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MANUAL DE PRCTICAS DE
LABORATORIO DE BIOLOGA
MOLECULAR
AUTORAS:
Ana Luisa Bravo de la Garza
Claudia Hayde Gonzlez de la Rosa
Sylvie Le Borgne Le Gall
Doctorado en Ciencias Biolgicas y de la Salud,
Departamento de Ciencias Naturales,
Departamento de Procesos y Tecnologa
IBSN: 978-607-477-728-4
Junio 2012
MATERIAL DIDCTICO
ISBN:
978-607-477-728-4
Ttulo de la publicacin:
Manual de prcticas de laboratorio de Biologa Molecular
Fecha de publicacin:
15 de Junio del 2012
Nombre de la Licenciatura:
Ingeniera Biolgica
Nombre de la UEA:
Biologa Molecular
Autoras:
M.B. Ana Luisa Bravo de la Garza
Alumna
Doctorado en Ciencias Biolgicas y de la Salud de la UAM
Dra. Claudia Hayde Gonzlez de la Rosa
Profesora-Investigadora Titular B
Departamento de Ciencias Naturales
Dra. Sylvie Le Borgne Le Gall
Profesora-Investigadora Titular C
Departamento de Procesos y Tecnologa
RESUMEN
Este manual de prcticas de laboratorio cubre el programa de estudios de la
Unidad de Enseanza Aprendizaje Biologa Molecular de la Licenciatura en
Ingeniera
Biolgica
de
la
Universidad
Autnoma
Metropolitana,
Unidad
Cuajimalpa. Forma parte del rea de formacin profesional, por lo que integra
conocimientos prcticos con habilidades y destrezas especficas para el ejercicio
profesional.
En estas prcticas se contemplan el empleo del equipo bsico utilizado en los
laboratorios de biologa molecular y la realizacin de experimentos que
manifiestan las propiedades estructurales y qumicas de los cidos nucleicos. El
contenido se encuentra directamente vinculado a los objetivos del programa de
estudio, dando nfasis en conocer y comprender las principales aplicaciones
biotecnolgicas. Por ejemplo, la regulacin de expresin de genes en
procariontes es un tema que suele abordarse en clase al explicar el
funcionamiento del opern de lactosa, mismo que puede ilustrarse fcilmente
con una aplicacin biotecnolgica, como es la expresin en bacterias de una
protena recombinante. Con el fin de evitar un aprendizaje fragmentado y facilitar
la integracin, algunas prcticas estn organizadas de tal manera que el alumno
utilizar las muestras obtenidas durante el experimento previo. La metodologa
utilizada en ocasiones es especfica para el equipo disponible en nuestro
laboratorio, pero cualquiera de estos experimentos puede ser optimizado para
equipos similares. Cada prctica contiene los siguientes apartados:
CONTENIDO
Recomendaciones generales de trabajo en el laboratorio ........................................ 3
PRCTICA No. 1 Aislamiento y purificacin de ADN genmico ................................. 4
PRCTICA No. 2 Aislamiento y purificacin de ADN plasmdico Miniprep .......... 11
PRCTICA No. 3 Separacin de ADN por electroforesis horizontal en geles de
agarosa .......................................................................................................................... 18
PRCTICA No. 4 Cuantificacin y estimacin de la pureza del ADN ....................... 25
PRCTICA No. 5 Digestin de ADN con enzimas de restriccin ............................... 29
PRCTICA No. 6 Reaccin en cadena de la polimerasa PCR ............................... 35
PRCTICA No. 7 Extraccin, purificacin y precipitacin de fragmentos de ADN . 40
PRCTICA No. 8 Ligacin de productos de PCR en un vector-T ............................... 45
PRACTICA No. 9 Transformacin de clulas de Escherichia coli .............................. 50
PRCTICA No. 10 Induccin de una protena recombinante ................................... 55
PRCTICA No. 11 Separacin de protenas por electroforesis en geles
desnaturalizantes de poliacrilamida ........................................................................... 60
Seguridad en el laboratorio de Biologa Molecular ................................................... 67
Bibliografa ..................................................................................................................... 70
INTRODUCCIN
La extraccin y purificacin de los cidos nucleicos es el primer paso en la
mayora de los estudios de Biologa Molecular (Figura 1).
Para manipular o amplificar el ADN es necesario eliminar otros componentes
celulares que pueden interferir con los experimentos
experimentos, como protenas, ARN y
lpidos, sin daar al ADN. El primero en aislar y purificar el ADN fue el qumico suizo
Johann Friedrich Miescher (1844
(1844-1895). En 1869, Miescher aisl a partir del ncleo
de los glbulos blancos varias molculas ricas en fosfatos, a las cuales les llam
nuclenas (cidos nucleicos
nucleicos). El protocolo original de Miescher era burdo y el ADN
obtenido no era puro.. LLa contaminacin con protenas era una
un de sus
preocupaciones, por lo que modific su protocolo agregando pepsina,
pepsina una
proteasa, para digerir las protenas presentes
presentes.
precipitado forma unas finas hebras blancas, mientras que el resto de las
sustancias permanecen disueltas.
Cromatografa
Filtracin en gel, separando las molculas por su tamao molecular.
Intercambio inico, permite la separacin y concentracin de las
molculas por interacciones electrostticas con la matriz de la columna.
Adsorcin, los cidos nucleicos son retenidos selectivamente sobre
membranas de slica en presencia de altas concentraciones de ciertas
sales, mientras que otras molculas no lo son. Los cidos nucleicos
posteriormente son eluidos con agua o un buffer (amortiguador).
Afinidad, los cidos nucleicos se unen a un ligando particular, el resto de
molculas se elimina con lavados, posteriormente se agrega una molcula
que compite por el ligando dejando libre a los cidos nucleicos.
Centrifugacin
La centrifugacin es un mtodo de purificacin importante utilizado
frecuentemente en combinacin con otros mtodos, como la filtracin en
gel y la cromatografa de adsorcin.
Electroforesis
La electroforesis se utiliza frecuentemente para determinar el tamao y la
integridad del ADN extrado.
Los cidos nucleicos pueden ser separados por electroforesis con base en
su peso molecular. Esta separacin se realiza ms comnmente en geles
de agarosa.
MATERIALES REQUERIDOS
Etanol absoluto
Etanol al 70% (v/v)en agua MilliQTM
Fenol:cloroformo (1:1, v/v)
Acetato de sodio 3 M pH 5.2
Buffer STES
Buffer TE pH 7.6
Medio YPD
Perlas de vidrio (~0.4 mm de
dimetro) estriles
Microcentrfuga
Vrtex
Tubos de 1.6 mL
Incubadora a 30 C con
agitacin orbital
Cepa de Saccharomyces
cerevisiae
Hielo/contenedor
Agua destilada
Agua Milli-QTM
Micropipetas y puntas de 200 y
1,000 L
Tubos de cultivo
Pipetas de vidrio graduadas de 5
mL estriles
Congelador a -20 C
PROTOCOLO
Antes de iniciar la Prctica, consulte las recomendaciones de seguridad
especificadas para cada sustancia utilizada (ver Seguridad en el laboratorio de
Biologa Molecular al final del Manual).
Utilice bata y guantes en todo momento.
El da anterior a la prctica:
1.
2.
3.
El da de la prctica:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
8.
9.
RESULTADOS
Observe y documente los cambios fsicos de la muestra durante todo el proceso
de extraccin y purificacin.
Describa la diferencia entre las pastillas obtenidas de la centrifugacin de la
levadura, de la levadura lisada y de la obtencin de los cidos nucleicos.
Diga por qu es necesario colocar los tubos que se van a centrifugar con la unin
de la tapa hacia la parte externa de la centrfuga y su relacin con el lugar
donde se formar la pastilla.
CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
SOLUCIONES
Utilice bata y guantes en todo momento para preparar las soluciones.
PMEDTA 372.24
Agregar 46.52 g de EDTA 2H2O disdico en 150 mL de agua Milli-QTM, agitar
vigorosamente con una barra magntica y ajustar el pH a 8.0 con NaOH
(alrededor de 5 g de NaOH). Esterilizar por autoclave en un frasco de vidrio
con tapn de rosca. Antes de usar el hidrxido de sodio, consulte la seccin
de Seguridad en el laboratorio de Biologa Molecular.
10
OBJETIVO
El objetivo de esta prctica es que el alumno conozca los fundamentos de la
extraccin y purificacin de ADN plasmdico a partir de Escherichia coli y que sea
capaz de describir y explicar cada una de las etapas del protocolo.
INTRODUCCIN
Los plsmidos son molculas de ADN extracromosmico, circular o lineal, de
doble cadena, que se replican y transcriben independientes del ADN
cromosmico. Los plsmidos aparecen de forma natural en las bacterias y en
algunas eucariotas. El tamao de los plsmidos vara entre 1 y ms de 1,000 kpb.
En bacterias, los plsmidos se asocian con la conjugacin, un mecanismo de
transferencia horizontal de genes, o bien, con la resistencia a antibiticos, metales
pesados, patogenicidad o biodegradacin de compuestos. Los plsmidos
utilizados en Ingeniera gentica se denominan vehculos o vectores y pueden ser
utilizados para la clonacin y la expresin de genes, entre otras aplicaciones.
La principal consideracin en la obtencin de ADN plasmdico es la separacin
de ste del ADN genmico y del ARN de la bacteria. Se han desarrollado
protocolos que producen clulas lisadas en los que no solamente se eliminan
protenas y lpidos si no que tambin se elimina el ADN genmico, obtenindose
slo el ADN plasmdico libre en solucin. Dentro de estos protocolos se encuentran
la desnaturalizacin alcalina con SDS (dodecilsulfato de sodio), la precipitacin
sal-SDS y la ebullicin rpida.
La desnaturalizacin alcalina con SDS es uno de los mtodos ms utilizados, el
cual se basa en las diferentes caractersticas de desnaturalizacin y
renaturalizacin del ADN plasmdico circular cerrado covalentemente y del ADN
genmico (Figura 1). Bajo condiciones alcalinas (pH 11), tanto el ADN genmico
como el ADN plasmdico son eficientemente desnaturalizados. La posterior
neutralizacin rpida en un buffer con SDS y altas concentraciones de sales como
el acetato de potasio, tiene dos efectos que permiten la obtencin del ADN
plasmdico. Primero, la neutralizacin rpida causa que en el ADN genmico
algunas pares de bases se apareen con otras pares de bases de la misma hebra
en lugar de la hebra complementaria, formando agregados insolubles que
precipitan. El cierre covalente del ADN plasmdico circular, aunado a su menor
longitud en pares de bases, promueve la rehibridacin de las hebras
complementarias, permitiendo que permanezca soluble en el buffer.
11
Segundo, la sal de potasio del SDS es insoluble, por lo que las protenas y el
detergente se agregan y precipitan, ayudando tambin a atrapar el ADN
genmico
enmico de alto peso molecular.
Figura 1. Obtencin de A
ADN
DN plasmdico por desnaturalizacin alcalina con SDS.
MATERIALES REQUERIDOS
PROTOCOLO
El da anterior a la prctica:
1. Verificar que se cuenta con todas las soluciones necesarias.
2. Inocular la cepa en tubos de cultivo con 5 mL de medio LB con ampicilina a una
concentracin final de 100 g/mL.
3. Incubar a 37 C por toda la noche (14-16 horas) con agitacin orbital de 150 rpm.
El da de la prctica:
Antes de iniciar la Prctica, consulte las recomendaciones de seguridad
especificadas para cada sustancia utilizada (ver Seguridad en el laboratorio de
Biologa Molecular al final del Manual).
Utilice bata y guantes en todo momento.
Antes de comenzar, preparar 10 mL de la Solucin Miniprep 2:
NaOH 0.2N
SDS 1%
13
1.
Verter 1.5 mL de cultivo en un tubo de 1.6 mL (el resto dejarlo como stock a 4
C).
2.
3.
4.
5.
6.
8.
9.
(450
L)
de
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Lavar la pastilla con 500 L de etanol 70%, mezclar invirtiendo el tubo varias
veces.
17.
18.
19.
20.
21.
Eliminar el sobrenadante.
22.
Secar al aire por aprox. 10 min (invertir el tubo sobre papel absorbente).
23.
24.
Almacenar a -20 C.
RESULTADOS
Observe y documente los cambios fsicos de la muestra durante todo el proceso
de extraccin y purificacin.
Describa la diferencia entre las pastillas obtenidos de la centrifugacin de las
bacterias, de las bacterias lisadas y de la obtencin de los cidos nucleicos.
CUESTIONARIO
1. Por qu se le agrega un antibitico al medio de cultivo para la propagacin
de E. coli?
2. Identifique y diga las diferencias entre el protocolo de extraccin y
purificacin del ADN genmico y el de ADN plasmdico.
3. Qu es una sal caotrpica?
4. Enliste y explique los fundamentos de cada unas de las etapas de extraccin y
purificacin de ADN plasmdico por lisis alcalina.
5. Qu es la transformacin? Explique las diferencias con la transfeccin.
SOLUCIONES
Utilice bata y guantes en todo momento para preparar las soluciones.
Las soluciones stock de EDTA 0.5 M pH 8, SDS 10% (p/v), acetato de sodio 3 M pH
5.2 y fenol:cloroformo (1:1), fueron preparadas en la Prctica No. 1.
PMGlucosa 180.16
Disolver 1.8 g de glucosa en agua Milli-QTM. Esterilizar por filtracin (0.22 m).
17
OBJETIVO
El objetivo de esta prctica es que el alumno conozca y sea capaz de describir y
explicar los principios bsicos y principales aplicaciones de la electroforesis
horizontal de ADN en geles de agarosa, as como de realizar esta tcnica de
forma rutinaria.
INTRODUCCIN
La electroforesis es el proceso de movimiento de molculas cargadas en una
solucin al aplicar un campo elctrico. Debido a que las molculas en un campo
elctrico se mueven a una velocidad dependiente de su carga, forma y tamao,
la electroforesis se ha desarrollado ampliamente para la separacin de diversas
biomolculas. Debido a que es una herramienta analtica simple y relativamente
rpida, se utiliza para el anlisis y la purificacin de molculas grandes como
protenas y cidos nucleicos o de molculas pequeas como azcares,
aminocidos, pptidos y nucletidos.
La electroforesis de macromolculas se realiza normalmente aplicando un
volumen pequeo de la muestra en una matriz porosa (Figura 1). Bajo la influencia
del voltaje aplicado, las diferentes molculas presentes en la muestra se movern
a travs de la matriz a diferentes velocidades. Al final se podr observar la
separacin de las molculas detectadas como bandas en distintas posiciones
dentro de la matriz. La matriz puede estar compuesta por diferentes materiales
como papel, acetato de celulosa, agarosa o poliacrilamida.
En la unidad de electroforesis, el gel se encuentra colocado entre dos cmaras
que contienen buffer. La conexin elctrica ente las dos cmaras es a travs del
gel. Debido a que los cidos nucleicos tienen carga negativa, los pozos para
muestras deben colocarse del lado del electrodo negativo para que estos migren
hacia el lado positivo (Figura 1).
Los cidos nucleicos son comnmente separados en geles de agarosa. La
agarosa es un polisacrido altamente purificado, derivado del agar. La velocidad
de migracin del ADN en matrices de agarosa est determinada por los
siguientes factores:
Tamao molecular del ADN. Las molculas ms grandes migran ms
lentamente por que su friccin de arrastre es mayor y porque se mueven a
travs de los poros del gel con mayor dificultad que las molculas pequeas.
18
Electrodo negativo
Electrodo positivo
Gel de agarosa
Buffer de electroforesis
Pozos para muestras
Campo elctrico
Direccin de la migracin
I = V/R
La ley de Ohm relaciona el voltaje (V) medido en volts (V), la corriente (I) medida
en amperes (A) y la resistencia (R) medida en ohms ().
La segunda ecuacin fundamental en la electroforesis es la ecuacin de
potencia (P) medida en watts (W), la cual describe la cantidad de calor
producida en un circuito:
P = VI
P =I2R
P = V2/R
19
Longitud del
fragmento (pb)
0.5
25,000 2,000
0.7
10,000 - 800
1.0
8,000 - 500
1.2
5,000 400
1.5
3,000 200
2.0
2,000 - 100
Ausencia de bandas. Puede deberse a que la muestra se haya salido del gel
por corrimiento excesivo o porque los cables fueron colocados
incorrectamente en sus electrodos respectivos. Tambin puede ocurrir cuando
se cargan cantidades inferiores al lmite de deteccin.
MATERIALES REQUERIDOS
PROTOCOLO
Antes de iniciar la Prctica, consulte las recomendaciones de seguridad
especificadas para cada sustancia utilizada (ver Seguridad en el laboratorio de
Biologa Molecular al final del Manual).
Utilice bata y guantes en todo momento.
1.
Limpiar y secar las charolas de preparacin de geles y los peines con agua
destilada y ensamblarlos. Colocar las charolas en una superficie horizontal y
nivelada.
2.
Acomodar los peines en cada charola a 0.5 -1.0 mm del fondo de ellas.
21
3.
5.
6.
Remover cuidadosamente los peines y montar los geles con cada charola
en las cmaras de electroforesis.
7.
Verter el buffer TBE 0.5x en las cmaras hasta cubrir el gel (1 mm por
encima del gel).
8.
9.
10.
No tocar el fondo del pozo con la punta para evitar perforar el gel. Evitar
burbujear con la micropipeta mientras se coloca la muestra para que sta no se
salga del pozo.
11.
12.
14.
Teir los geles en una solucin de agua Milli-QTM con bromuro de etidio (0.5
g/mL) o SYBR Green I 1 durante 30 min. Utilizar una charola especfica
para la tincin y usar un volumen de agua suficiente para cubrir el gel. Si se
utiliza SYBR Green I, la charola se debe proteger de la luz.
22
RESULTADOS
Evale las imgenes de los geles al comparar la migracin de las bandas de
cada carril y comente el efecto de la concentracin de agarosa. Determine el
peso molecular aparente de cada banda.
CUESTIONARIO
1. El voltaje sugerido para la electroforesis en gel de agarosa es de 1 a 5 V/cm.
a. Explique a que se refiere esta relacin.
b. En la cmara utilizada en esta prctica se aplicaron 85 V, calcule los
V/cm a los que corresponde.
c. Diga cul es el intervalo de voltajes que pueden ser aplicados en la
cmara utilizada (para ello, calcular el voltaje correspondiente a 1 y 5
V/cm).
2. Qu otras macromolculas pueden ser separadas por electroforesis en gel?
Cul es el polmero ms utilizado para cada una de esas macromolculas?
3. Mencione tres
caractersticas.
tipos
de
agarosa
disponibles
comercialmente
sus
23
4. Adems del azul de bromofenol, que otro colorante se utiliza en los buffers de
carga?
SOLUCIONES
Utilice bata y guantes en todo momento para preparar las soluciones.
24
OBJETIVO
El objetivo de esta prctica es que el alumno conozca los principios bsicos de la
determinacin de la concentracin y pureza del ADN por espectrofotometra y
sea capaz de describir, realizar y explicar esta tcnica.
INTRODUCCIN
La tcnica comn para cuantificar el ADN y evaluar su pureza es por medicin de
la densidad ptica (DO) o absorbancia (A). La lectura de absorbancia se realiza
a 260 nm (A260), longitud de onda en la que el ADN tiene su mximo de absorcin
de luz. El valor obtenido permite estimar la concentracin en la solucin. Para
asegurarse de que los nmeros obtenidos sean confiables, la lectura de la A260
debe estar entre 0.1 y 1.0.
Sin embargo, el ADN no es la nica molcula que absorbe la luz UV a 260 nm. El
ARN tambin tiene absorbancia a 260 nm, mientras que los aminocidos
aromticos presentes en las protenas absorben a 280 nm, contribuyendo a la
medicin total a 260 nm si se encuentran presentes en la solucin. La guanidina es
un agente caotrpico comnmente empleado en la extraccin y purificacin del
ADN que tambin incrementa la A260. Esto quiere decir que si solo se toma el valor
de A260 para calcular la concentracin, la cantidad de ADN se sobreestimar.
Para evaluar la pureza del ADN por espectrofotometra, se debe medir la
absorbancia desde 230 nm hasta 320 nm con el objetivo de detectar otros
posibles contaminantes en la solucin. El clculo ms comn para evaluar la
pureza consiste en determinar la relacin entre la A260 y la A280. Un ADN de buena
calidad deber tener una relacin A260/A280 entre 1.7 y 2.0; cuanto menor sea esta
relacin, mayor es la cantidad de contaminantes presentes (Tabla 1).
Tabla 1. Relacin de absorbancias A260/A280 para estimar la pureza del ADN.
Protenas
(%)
cidos
nucleicos (%)
A260/A280
Protenas
(%)
cidos
nucleicos (%)
A260/A280
100
0.57
40
60
1.91
90
10
1.32
30
70
1.94
80
20
1.59
20
80
1.97
70
30
1.73
10
90
1.98
60
40
1.81
100
2.00
50
50
1.87
MATERIALES REQUERIDOS
Agua Milli-QTM
Micropipetas y puntas de 20 y
1000 L
Tubos de 1.6 mL estriles
Hielo/contenedor
PROTOCOLO
Antes de iniciar la Prctica, consulte las recomendaciones de seguridad
especificadas para cada sustancia utilizada (ver Seguridad en el laboratorio de
Biologa Molecular al final del Manual).
Utilice bata y guantes en todo momento.
26
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
RESULTADOS
Registre los diferentes valores de DO en la siguiente tabla.
Absorbancia (nm)
ADN genmico
ADN plasmdico
230
260
270
280
320
CUESTIONARIO
1. Por qu se recomienda medir la absorbancia a 280 nm?
2. Espectrofotomtricamente no es posible distinguir una muestra pura de ADN a
una contaminada con ARN. Proponga un mtodo que permita observar esta
contaminacin.
3. Utilizando la imagen del siguiente gel de electroforesis, estime la
concentracin del fragmento U de ADN. Los estndares utilizados son 125,
100, 75 y 50 ng. M corresponde al marcador de peso molecular de 1 kb.
27
28
OBJETIVO
El objetivo de esta prctica es que el alumno se
sea
a capaz de explicar lo que son las
enzimas de restriccin
triccin y de realizar una reaccin de digestin, as como de
conocer y explicar
ar las principales aplicaciones de estas enzimas.
INTRODUCCIN
Las enzimas de restriccin o endonucleasas de restri
restriccin
ccin son enzimas
enzi
que
reconocen secuencias de ADN especficas y cortas, comnmente palindrmicas
(es decir, que la secuencia de nucletidos en las dos cadenas complementarias
de un segmento de ADN es la misma si se lee en la direccin 5 a 3). Estas
enzimas cortan el ADN
DN de doble hebra en sitios especficos dentro o contiguo a
las secuencias de reconocimiento (Figura 1).
ADN del bacterifago lambda (): ADN lineal que es utilizado como un
estndar para medir y expresar las unidades de actividad de las enzimas de
30
ADN plasmdico: comparado con el ADN lineal, la digestin completa del ADN
plasmdico requiere ms unidades de enzima debido a su sper-enrollamiento
o al nmero de sitios por digerir (dependiendo del tamao y secuencia del
plsmido).
31
MATERIALES REQUERIDOS
Agarosa grado Biologa Molecular
Buffer TBE 0.5x (preparado
previamente)
Buffer de carga 5x (preparado
previamente)
ADN de plsmido conteniendo
sitios EcoRI e HindIII
Enzimas EcoRI e HindIII
Buffer de restriccin 10x para EcoRI
e HindIII
Marcadores de peso molecular
Agua Milli-QTM estril
PROTOCOLO
Antes de iniciar la Prctica, consulte las recomendaciones de seguridad
especificadas para cada sustancia utilizada (ver Seguridad en el laboratorio de
Biologa Molecular al final del Manual).
Utilice bata y guantes en todo momento.
1.
Rotular 4 tubos: uno para EcoRI, otro para HindIII, otro para la doble digestin
y el ltimo para el control negativo (es decir, sin enzima).
2.
3.
4.
5.
6.
Agua libre de
nucleasas
Buffer (10x)
BSA (1 mg/mL)
ADN
EcoRI
HindIII
Volumen total
30 L
7.
8.
9.
10.
RESULTADOS
Evale la imagen del gel al comparar las bandas en cada carril. Determine el
peso molecular aparente de cada banda y analice a que porcin del plsmido o
inserto corresponde cada banda.
CUESTIONARIO
1. Qu son los sistemas de restriccin-modificacin bacterianos?
2. D un ejemplo de secuencia de ADN palindrmica.
3. Observa las secuencias de las dos muestras de ADN mostradas a
continuacin, en las que por simplificacin se representa una sola cadena:
Muestra 1
CAGTGATCTCGAATTCGCTAGTAACGTT
Muestra 2
TCATGAATTCCTGGAATCAGCAAATGCA
33
Si ambas muestras fueran tratadas con una enzima de restriccin cuyo sitio de
reconocimiento fuera GAATTC, indica qu tipo de corte se provoca (romo o
con extremos salientes o cohesivos), el nmero de fragmentos y el tamao de
los mismos que se obtendran para cada muestra.
Muestra 1
Muestra 2
Tipo de corte:
Tipo de corte:
N de fragmentos:
N de fragmentos:
Procedencia
Sitio de
reconocimiento
5
3
Sitio de
corte
Resultado de la
digestin del
lado 5
Resultado de
la digestin
del lado 3
Ejemplo:
XbaI
Xanthomonas
badrii
TCTAGA
TCTAGA
CTAGA
EcoRI
HindIII
BamHI
PstI
SalI
7.
34
PRCTICA
CTICA No. 6 Reacc
Reaccin en cadena de la polimerasa PCR
PCR
OBJETIVO
El objetivo de esta prctica
ica es que el alumno conozca y sea capaz de explicar los
principios bsicos de la PCR
PCR, as como de realizar una amplificacin estndar con
el uso de un termociclador.
INTRODUCCIN
En 1983, el bioqumico Kary Mullis desarroll la t
tcnica de Biologa Molecular
M
que desde entonces ha revolucionado la investigacin biolgica y mdica, lo
que le llev a recibir el premio Nobel de Qumica de 1993. Esta tcnica,
denominada reaccin en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en ingls),
transform a la Biologa
iologa Molecular
olecular en una herramienta de investigacin
multidisciplinaria. Muchas de las tcnicas de Biologa Molecular usadas antes de
la invencin de la PCR para amplificar fragmentos de ADN eran muy laboriosas,
consuman mucho tiempo y requeran un alto nivel de especializacin tcnica,
por lo que en algunos campos de la B
Biologa
iologa no era prctico ni rentable su uso.
La PCR es una tcnica que replica enzimticamente al ADN in vitro,, permitiendo
que una pequea cantidad de molculas de ADN ((molde o templado)
templado sean
amplificadas selectivamente
tivamente de manera exponencial ((Figura 1). Una de las
principales razones por las cuales la PCR es una herramienta tan poderosa es su
simplicidad y especificidad.
Temperatura de fusin (Tm). Los valores de Tm calculados para los dos primers
usados juntos no debe variar en ms de 5 C.
Las cadenas recin sintetizadas pueden servir a su vez como moldes para la
sntesis del nuevo ADN, lo que da lugar a una reaccin en cadena con un
incremento exponencial del producto.
Una desventaja evidente de la PCR es el tamao limitado de los productos de la
amplificacin: es cada vez ms difcil obtener una amplificacin eficiente a
medida que aumenta la longitud del producto deseado. Sin embargo,
recientemente se comercializan ADN polimerasas capaces de amplificar
fragmentos de hasta 30 kb.
36
MATERIALES REQUERIDOS
PROTOCOLO
Antes de iniciar la Prctica, consulte las recomendaciones de seguridad
especificadas para cada sustancia utilizada (ver Seguridad en el laboratorio de
Biologa Molecular al final del Manual).
Utilice bata y guantes en todo momento.
1.
Rotular 4 tubos de PCR de 0.2 mL: dos para la reaccin de PCR problema en
duplicado y otros 2 para el control negativo en duplicado (con agua MilliQTM en lugar del ADN). Mantener siempre los tubos en hielo hasta colocarlos
en el termociclador.
37
2.
Agua Milli-QTM
reacciones de 100 L
Buffer 10x
10 L
Primer 5 50 M
1 L
Primer 3 50 M
1 L
dNTPs 10 mM
2 L
ADN molde
L*
Taq ADN
polimerasa 5 U/L
1 L
No. ciclos
Temperatura
Tiempo
94 C
3 min
94 C
30 s
Depende de la Tm
de los primers
30 s
72 C
72 C
7 min
4 C
Desnaturalizacin
Alineamiento
25 a 35
Polimerizacin
Extensin final
RESULTADOS
Describa detalladamente la imagen del gel, determine el peso molecular
aparente del producto de PCR (amplicn) obtenido.
CUESTIONARIO
1. Mencione la funcin de cada uno de los componentes de la mezcla de
reaccin de PCR.
2. A qu se debe el nombre de Taq de la ADN polimerasa utilizada?
3. Explique por qu razn la temperatura de alineamiento es variable y sta
depende de la secuencia de los primers.
4. Por qu es necesario tener un primer a cada extremo del segmento del ADN
a amplificar?
5. Explique por qu la longitud precisa de la secuencia de ADN molde no llega a
ser amplificada hasta el tercer ciclo. Realiza un dibujo que explique tu
respuesta.
39
purificacin
precipitacin
de
OBJETIVO
El objetivo de esta prctica es que el alumno conozca y sea capaz de explicar los
principios bsicos
sicos y aplicaciones de los siguientes mtodos de purificacin de
ADN: extraccin con
on fenol seguido de precipitacin con etanol y purificacin con
membranas de slica.
INTRODUCCIN
a. Extraccin orgnica con fenol y precipitacin de ADN con etanol
Las tcnicas de extraccin del ADN con compuestos orgnicos son ampliamente
utilizadas. Las protenas presentes en soluciones de ADN durante la preparacin
de ADN genmico, plasmdico o despus de reacciones enzimticas (digestiones,
PCR, etc.) pueden ser eliminadas por extraccin con una mezcla de fenol,
cloroformo y alcohol isoaml
isoamlico. La adicin de este alcohol promueve la
separacin de la fase no polar (orgnica) y la fase polar (acuosa).
cuosa). El fenol
desnaturaliza las protenas y como no es miscible en agua secuestra a las
protenas desnaturalizadas en la fase orgnica
orgnica, mientras que durante
d
este
proceso el ADN permanece en la fase acuosa (Figura 1).
El fenol es un solvente menos polar que el agua. El ADN es una molcula polar
debido a las cargas negativas de sus grupos fosfato. Las protenas
pro
estn
constituidas por cadenas de aminocidos. Algunos aminocidos son apolares,
apolares
como la leucina y la fenilalanina
fenilalanina, y otros son polares como la asparagina, el cido
40
la unin especfica del ADN a la slica mientras las otras molculas presentes
(como protenas por ejemplo) permanecen en solucin y pasan a travs de las
membranas sin unirse. Posteriormente, las sales se eliminan con una solucin con
alcohol para lavar las impurezas y sales presentes. Finalmente, el ADN es liberado
al pasar una solucin acuosa con baja fuerza inica como buffer TE o agua.
MATERIALES REQUERIDOS
- Microtubos de 2 mL
PROTOCOLO
Antes de iniciar la Prctica, consulte las recomendaciones de seguridad
especificadas para cada sustancia utilizada (ver Seguridad en el laboratorio de
Biologa Molecular al final del Manual).
Utilice bata y guantes en todo momento.
a. Extraccin con fenol y precipitacin con etanol
El fenol puede causar quemaduras severas y dao en la ropa. Utilice y bata
guantes en todo momento. El fenol debe trabajarse en campana de
extraccin.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Con mucho cuidado, remover la fase acuosa (superior) con una punta de
pipeta de 200 L y verterla en un microtubo nuevo. NOTA: Si en la interface
hay precipitados blancos repetir los pasos 4 a 7. Concentraciones altas de
sales pueden provocar la inversin de las fases. La fase orgnica puede ser
identificada por su color amarillo.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
RESULTADOS
Observe y documente los cambios fsicos de la muestra durante todo el proceso
de extraccin y purificacin.
Cuantifique y evale la calidad y pureza del ADN obtenido despus de la
precipitacin con etanol y despus de la purificacin con slica. Compare y
discuta estos resultados.
CUESTIONARIO
1. Explique porqu el fenol es un solvente menos polar que el agua.
2. Aparte de las protenas desnaturalizadas, que otros compuestos celulares
pueden ser eliminados por el fenol?
3. Qu compuestos celulares son eliminados por el cloroformo?
4. Explique cada paso de la extraccin de ADN con fenol y la precipitacin con
etanol.
5. Explique cul es la funcin de cada una de las soluciones utilizadas en la
purificacin del ADN con slica.
44
OBJETIVO
El objetivo de esta prctica es que el alumno conozca y sea capaz de explicar los
principios bsicos de la tecnologa del ADN recombinante, a travs del ejemplo
de la ligacin de un fragmento de PCR en un vector-T.
INTRODUCCIN
Muchas veces es conveniente clonar el producto de la PCR en un sistema de
clonacin basado en clulas, para conseguir grandes cantidades de ADN y
permitir una diversidad de anlisis (por ejemplo, en estudios de expresin del
producto amplificado). Hay al menos tres estrategias de clonacin en plsmidos
para propagar el ADN amplificado mediante PCR:
45
Taq
Tfl
Tth
Tli
Pfy
Pwo
3A
3A
3A
Romos
Romos
Romos
Actividad exonucleasa 53
si
si
si
no
no
no
Actividad exonucleasa 35
no
no
no
si
si
si
Digerir el vector con una enzima de restriccin que reconozca dos sitios para
que produzca extremos cohesivos de una sola base (por ejemplo, XcmI o
AhdI) y asegurar que la base sea timina.
2)
Digerir el plsmido con una enzima que deje extremos romos (por ejemplo,
SmaI o PvuII) y despus adicionar al 3 la timidina mediante una reaccin con
Taq polimerasa, solo en presencia de dTTPs.
MATERIALES REQUERIDOS
Fenol:cloroformo (1:1)
Acetato de sodio (3 M)
Etanol absoluto
Etanol al 70% (v/v)
Vrtex
Microcentrfuga
Hielo/contenedor
47
PROTOCOLO
Antes de iniciar la Prctica, consulte las recomendaciones de seguridad
especificadas para cada sustancia utilizada (ver Seguridad en el laboratorio de
Biologa Molecular al final del Manual).
Utilice bata y guantes en todo momento.
1.
Verificar que el producto de PCR corresponda a una sola banda por medio
de electroforesis en un gel de agarosa (actividad realizada en la Prctica
No. 6).
2.
3.
Rotular 2 tubos de 0.6 mL: uno para la reaccin de ligacin problema y otro
para el control negativo (sin inserto) y dejarlos en hielo.
4.
5.
6.
Ligacin problema
Control negativo
Buffer 2X
5 L
5 L
pGEM-T
1 L
1 L
Producto de PCR
L*
1 L
1 L
Completar a 10 L
Completar a 10 L
Agua Milli-QTM
7. Mezclar los reactivos por pipeteo (no usar vrtex). Incubar las reacciones por 1
h a 25 C.
8. Analizar la mitad de las reacciones de ligacin (5 L) en un gel de agarosa al
1%.
48
RESULTADOS
Realice la descripcin detallada de la imagen del gel, ubicando el vector, el
inserto y los productos de ligacin en los diferentes carriles.
CUESTIONARIO
1. Cunto producto de PCR de 0.6 kb debe ser usado en una reaccin
r
de
ligacin en la cual se usarn 50 ng de un vector de 3 kb, si deseamos una
un
relacin molar inserto:vector de 3:1?
2. Escriba los fragmentos que se obtendran despus de la digestin del siguiente
producto de PCR clonado en el vector pGEM
pGEM-T, con las siguientes
iguientes enzimas de
restriccin:
ATCAGGAAGCTTCCGGCCGCTCGCTCTGTTCGGCCGTCAACTGGAATTCTTCG
CCCGCATAGTAGGCCCGCACCTTGGGGTCGACCGCCCGCCACAGCGGC
GGGATCAGCGCCAGCACCACCATCCCGGCATAAGCTTGCTGGGCATCTGC
GGGCTATCGTCAGAATTCCGGAGTCGACCTGATAGGGGCGTTTGGCGAATTC
ATGATGGTCGGAATGCCGT
ATGATGGTCGGAATGCCGTTGCAGATGGAACAGGACCAAGCTTGGTGAAGA
TGCAGATGGAACAGGACCAAGCTTGGTGAAGA
CGAAGTTGCTGTTC CAAACATA
a. EcoRI
b. HindIII
Mapa del vector pGEM-T
49
OBJETIVO
El objetivo de esta prctica es que el alumno conozca los principios bsicos y las
aplicaciones de la transformacin de clulas de E. coli y se familiarice con la
tcnica de transformacin con clulas tratadas con calcio.
INTRODUCCIN
La clonacin de genes, fragmentos de genes u otras secuencias de ADN es una
parte fundamental de la Biologa Molecular. Para poder estudiar la funcin de
una secuencia de ADN en particular, es necesario el poder manipular dicha
secuencia. Existen dos mtodos para lograr esto, la PCR que permite amplificar
secuencias especficas de ADN in vitro, y la utilizacin de enzimas de restriccin y
de modificacin para cortar y pegar fragmentos de ADN en vectores para
diversos propsitos. Los vectores con fragmentos de ADN de inters pueden ser
replicados utilizando clulas vivas, ms comnmente E. coli. La transformacin se
lleva a cabo cuando el vector es introducido a clulas de E. coli competentes. La
competencia de una clula es el estado en el cual la clula es capaz de
capturar ADN del medio.
La transformacin artificial permite la introduccin de fragmentos de ADN
forneo, generalmente plsmidos, en la bacteria E. coli. El tratamiento con iones
de calcio permite obtener clulas competentes de E. coli, es decir, clulas ms
permeables capaces de captar ADN del medio. Solo un pequeo porcentaje de
las clulas sern transformadas. Por lo tanto, las clulas deben ser sembradas en
un medio selectivo para seleccionar las transformantes. Usualmente los plsmidos
contienen un gen de resistencia a un antibitico que permite esta seleccin. Slo
aquellas clulas que contengan el vector podrn crecer en el medio que
contiene el antibitico. Despus de la transformacin, las colonias bacterianas
resultantes son analizadas mediante la digestin del vector por enzimas de
restriccin para determinar la presencia del fragmento (inserto) correcto o bien
por PCR usando primers que flanquean el inserto.
La eleccin de las colonias transformadas puede ser an ms simple al utilizar el
sistema de seleccin basado en el gen lacZ mencionado en la prctica anterior,
con cepas de E. coli con un gene lacZ inactivo, incompleto en su extremo 5. Esta
mutacin elimina parte del gen de la -galactosidasa dejando la parte que
codifica para el denominado fragmento inactivo de esta enzima. Por otro lado,
el vector utilizado debe contener la parte faltante del gen lacZ, codificando el
50
fragmento de la -galactosidasa.
galactosidasa. Una vez que el vector est
st dentro de la
bacteria, el plsmido produce el fragmento y la cepa de E. coli produce el
fragmento , los dos fragmentos se completan, produciendo una -galactosidasa
galactosidasa
funcional. A esto se le llama complementacin. Si las bacterias transformadas se
inoculan en agar con X-g
gal, las colonias presentan una coloracin azul como
resultado de la actividad
-galactosidasa, indicando la complementacin de la
bacteria por el plsmido.
Los mtodos de clonacin azul/blanco utilizan plsmidos con regiones mltiples
mltiple
de clonacin dentro de la secuencia que codifica para el fragmento . Los
plsmidos que tienen interrumpida la secuencia del fragmento por la insercin
de un fragmento de ADN producen un fragmento no funcional incapaz de
llevar a cabo la complementac
complementacin .. Entonces, los plsmidos con inserto son
diferenciados por el color blanco de sus colonias (Figura 1). Las cepas JM109,
DH5 y XL-1
1 Blue son ejemplos de cepas de E. coli que se utilizan para seleccin
blanco/azul.
MATERIALES REQUERIDOS
Tubos con 50 L de clulas
lulas de E.
coli competentes con calcio
(cepa para complementacin
plementacin
proporcionada por el profesor)
Vector pGEM-T sin inserto (2 ng/L)
(proporcionado por el profesor)
Reacciones de ligacin de la
Prctica No. 8
Hielo/contenedor
Bao de agua a 42 C
Incubadora con agitacin orbital
a 37 C
51
PROTOCOLO
Antes de iniciar la Prctica, consulte las recomendaciones de seguridad
especificadas para cada sustancia utilizada (ver Seguridad en el laboratorio de
Biologa Molecular al final del Manual).
Utilice bata y guantes en todo momento.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
RESULTADOS
Calcule la eficiencia de transformacin utilizando el control de pGEM-T sin inserto.
Ejemplo de clculo: 100 L de clulas son transformadas con 0.1 ng de plsmido y
cultivadas en 900 L de medio LB (0.1 ng/mL). A partir de este cultivo, se hace una
dilucin 1/10 (0.01 ng/mL) y se siembran 100 L de esta dilucin en una caja Petri
(0.001 ng/100 L). Se obtienen 200 colonias (unidades formadoras de colonias,
ufc). La eficiencia de transformacin es:
200 ufc / 0.001 ng = 2 x 105 ufc/ng = 2 x 108 ufc / g de ADN
En la siguiente tabla reporte los resultados de las transformaciones de las
reacciones de ligacin e interprete los resultados obtenidos.
Nmero de colonias incoloras
CUESTIONARIO
1. Por qu se pone IPTG al medio LB?
2. Por qu es preferible utilizar IPTG en vez de lactosa?
53
54
OBJETIVO
El objetivo de esta prctica es que, aplicando un sistema de expresin comercial
para clulas procariontes, el alumno sea capaz de identificar con exactitud las
partes que lo componen y explicar para qu se requieren en la expresin de
protenas recombinantes.
INTRODUCCIN
En Biologa Molecular es comn estudiar la composicin, estructura y, en lo
posible, la funcin de protenas. Ahora es posible producir grandes cantidades de
protenas seleccionadas usando la tecnologa del ADN recombinante. En general,
un ADN hbrido o recombinante se prepara al insertar el gen que deseamos
expresar en un vector y luego se transfiere dentro de una clula hospedera
(host) donde la protena deseada es sintetizada. Este procedimiento ha sido
usado en la produccin de cientos de protenas con propsitos cientficos,
mdicos e industriales. En la Tabla 1 se enlistan algunos ejemplos de los productos
proteicos obtenidos por mtodos de ADN recombinante.
Tabla 1. Ejemplos de protenas recombinantes y sus usos.
Protena
Uso
Insulina humana
Tratamiento de diabetes
Eritropoyetina
Interferones
Herceptin
Las clulas bacterianas han sido ampliamente usadas como clulas hospederas
para la produccin de protenas recombinantes a gran escala. El gen clonado
que contiene el mensaje para la protena deseada es incorporado dentro de un
vector de expresin que tiene todas las secuencias de control transcripcional y
traduccional necesarias (Figura 1).
55
Si las seales apropiadas para la expresin del gen estn presentes, es posible
sobreexpresar la protena deseada a una concentracin que puede representar
hasta el 40% en peso de la protena total de la bacteria. Sin embargo, esta
sobreexpresin puede causar dificultades en el crecimiento bacteriano,
inestabilidad plasmdica o incluso, la protena extraa puede ser txica para la
bacteria. Adems, en ocasiones las clulas bacterianas concentran las protenas
extraas dentro de cuerpos de inclusin insolubles en donde las protenas estn
presentes en forma desnaturalizada y agregada. Muchos de estos problemas
pueden ser minimizados o eliminados al etiquetar (tagging) la protena deseada
con una protena de origen bacteriano, lo cual se logra al insertar dentro del
vector un fragmento de ADN que codifique una protena bacteriana. As, la
bacteria puede reconocer a la protena extraa como propia (la etiqueta
frecuentemente se agrega en el extremo N- terminal de la protena de inters).
Estas protenas modificadas son llamadas protenas hbridas o de fusin. Si es
necesario, la etiqueta puede ser eliminada de la protena deseada despus de la
purificacin.
Otra forma de disminuir los problemas asociados a la expresin de protenas
extraas en las clulas bacterianas, es restringir al mnimo la expresin basal, es
decir, utilizar un sistema inducible de expresin proteica. Esto se puede lograr si la
enzima encargada de la transcripcin del gen, la ARN polimerasa, reconoce al
promotor del vector slo en presencia de un inductor, por ejemplo IPTG (isopropil-D-tiogalactopiransido). La adicin de IPTG al cultivo en crecimiento induce la
transcripcin del ADN blanco bajo el control de promotores derivados del
promotor lac.
56
Las etiquetas en las protenas tienen otros usos, adems del mencionado
previamente: pueden ser tiles para facilitar la purificacin, para identificar a la
protena de inters, para incrementar la probabilidad de actividad biolgica por
afectar la solubilidad en el citoplasma o para exportar al periplasma. Varios
vectores comerciales contienen diferentes secuencias adyacentes al sitio de
clonacin que codifican pptidos etiqueta y que pueden desarrollar varias de
estas funciones cuando se fusionan con la protena de inters. La eleccin de los
sitios de clonacin depende de la combinacin de etiquetas deseadas y la
localizacin de stas en el extremo N-terminal, C- terminal o ambos, de la
protena de inters. Ejemplos de estos sistemas de expresin para protenas de
fusin son los vectores pGEX de la compaa GE Healthcare Life Sciences y el
sistema pET de NOVAGEN.
En esta prctica utilizaremos un vector pGEX, que permite expresar, purificar y
detectar protenas de fusin a glutatin S-transferasa (GST) producidas en E. coli.
El gen gst codifica para una protena de 26 kDa, tiene un codn de inicio y un sitio
de entrada ribosomal y est bajo el control de un promotor que es inducible con
1 a 5 mM de IPTG. El plsmido confiere resistencia a ampicilina y contiene un
represor lacI. La protena de fusin resultante puede ser purificada por
cromatografa de afinidad, usando una resina con glutatin.
MATERIALES REQUERIDOS
Tubos de 1.6 mL
Bacterias de E. coli DH5
transformadas con el vector
pGEX-6P o similar
Medio LB (preparado en la
Prctica No. 2)
Ampicilina (100 mg/ml;
preparada en la Prctica No.
2)
Hielo/contenedor
IPTG (100mM)
Buffer de carga para protenas
PROTOCOLO
El da anterior a la prctica:
1.
El da de la prctica:
Antes de iniciar la Prctica, consulte las recomendaciones de seguridad
especificadas para cada sustancia utilizada (ver Seguridad en el laboratorio de
Biologa Molecular al final del Manual).
Utilice bata y guantes en todo momento.
1.
2.
3.
4.
5.
Tomar una muestra de 1.5 mL del cultivo bacteriano (con induccin) cada
hora y mantenerlas en hielo. A la par, medir la densidad ptica.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
RESULTADOS
Documente los cambios observables en su cultivo bacteriano durante toda la
prctica.
Registre los diferentes valores de DO obtenidos y grafquelos contra tiempo.
Explique el comportamiento de la grfica.
CUESTIONARIO
1. Por qu es importante la aireacin durante la induccin de la expresin de
protena recombinante?
2. Explique por qu es importante agregar el inductor cuando el cultivo
bacteriano ha llegado a una densidad ptica mayor a 0.6 pero menor a 1.0
3. Qu consecuencias tendra el no agregar ampicilina al cultivo bacteriano?
SOLUCIONES
Utilice bata y guantes en todo momento para preparar las soluciones.
58
59
Objetivo
El objetivo de esta prctica es que el alumno conozca y sea capaz de describir y
explicar los fundamentos y principales aplicaciones de la electroforesis de
protenas en geles de poliacrilamida desnaturalizantes y se familiarice con esta
tcnica.
Introduccin
Como se mencion previamente (Prctica No. 3), la electroforesis es una tcnica
de separacin basada en la migracin diferencial de especies cargadas en un
medio conductor de la corriente elctrica, bajo la influencia de un campo
elctrico. La separacin electrofortica depende de la densidad de carga de las
molculas y de su tamao. Las protenas se separan comnmente sobre un
soporte slido de poliacrilamida. Los geles formados por polimerizacin de
acrilamida tienen gran poder de resolucin para protenas de pequeo a
moderado tamao (hasta 1 x 106 Daltons) y tienen mnimas interacciones con las
molculas que migran a travs de ellos.
Los geles de poliacrilamida se preparan con acrilamida, que acta como el
radical libre de polimerizacin, y N,N-metilen-bis-acrilamida, que es el agente
entrecruzante (cross-linking). La polimerizacin qumica es controlada por un
sistema iniciador de catlisis: persulfato de amonio y N,N,N,Ntetrametiletilendiamina (TEMED). El primero es un catalizador de la polimerizacin
que se descompone espontneamente formando radicales sulfato. El TEMED es
otro catalizador, que forma radicales estables en presencia de radicales sulfato,
lo que contribuye a que la reaccin de propagacin no se extinga.
La separacin de protenas por electroforesis en geles de poliacrilamida puede
llevarse a cabo en 2 condiciones:
>15%
<10,000
10-15%
10,000 80,000
5-10%
20,000 150,000
3-5%
>100,000
El gel es preparado entre dos placas de vidrio que estn separados por
espaciadores, lo que permite un grosor uniforme de 0.5 a 2 mm. Se inserta un
peine plstico en la parte superior que permitir formar los pozos para colocar las
muestras. Posteriormente el gel se coloca en una cmara vertical, entre dos
reservorios de buffer separados. El reservorio superior usualmente contiene el
ctodo (-) y el inferior el nodo (+) (Figura 1). Como las protenas no tienen color,
se suele agregar azul de bromofenol a la muestra, colorante que permite
monitorear la electroforesis. Al finalizar la electroforesis, las protenas en los geles
de poliacrilamida pueden teirse con azul de Coomassie, uno de los colorantes
ms empleados para este fin.
61
MATERIALES REQUERIDOS
62
PROTOCOLO
Antes de iniciar la Prctica, consulte las recomendaciones de seguridad
especificadas para cada sustancia utilizada (ver Seguridad en el laboratorio de
Biologa Molecular al final del Manual).
Utilice bata y guantes en todo momento.
1.
Verificar que los vidrios (con separadores de 1.5 mm), el peine y el mdulo
de ensamble se encuentren limpios y secos.
2.
3.
Con una micropipeta, agregar poco a poco la solucin al espacio entre los
vidrios, hasta la marca previamente realizada.
5.
63
7.
8.
Con una micropipeta, agregar poco a poco la solucin al espacio entre los
vidrios, hasta llegar al borde.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
64
19.
20.
21.
RESULTADOS
Evale las imgenes de los geles al comparar el patrn de bandas de cada carril.
Determine qu diferencias existen entre la muestra obtenida antes de agregar
IPTG y las muestras obtenidas despus de haber agregado el inductor.
Identifique la banda a la cul corresponde la protena GST y determine el peso
molecular aparente. Discuta si el peso molecular observado es igual a lo
reportado para esta protena.
CUESTIONARIO
1. A qu concentracin de poliacrilamida se encuentra el gel separador que
preparaste en la prctica? y el gel concentrador?
2. Cules son las funciones del glicerol y del azul de bromofenol en el buffer de
carga para protenas?
SOLUCIONES
Utilice bata y guantes en todo momento para preparar las soluciones.
Solucin desteidora
- cido actico
7 mL
- Etanol
30 mL
- Agua destilada
63 mL
Almacenar a temperatura ambiente.
66
CONSIDERACIONES GENERALES
Evitar el contacto de sustancias con la piel; usar bata y guantes para proteger
la ropa y el cuerpo en todo momento.
SUSTANCIAS PELIGROSAS
Acetato de sodio. Ver cido actico.
cido actico. Peligroso por inhalacin, manejar con guantes y lentes de
proteccin en la campana.
67
cido brico. Puede ser peligroso por inhalacin, ingestin o absorcin por la piel.
Utilizar guantes apropiados y lentes de proteccin y manipular en la campana de
extraccin.
cido clorhdrico. Voltil y puede ser fatal en caso de inhalacin, ingestin, o
absorcin por la piel. Extremadamente destructivo para las mucosas, tracto
respiratorio, ojos y piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de proteccin y
manipular con extrema precaucin en la campana de extraccin.
Acrilamida. Potente neurotxico que se absorbe por la piel (con efecto
acumulativo); evitar inhalar el polvo, usar guantes y mascarilla de proteccin
cuando se pesa y preparar las soluciones en campana de extraccin. En principio
la poliacrilamida no es txica pero debe manejarse con precaucin, ya que
puede contener restos de acrilamida no polimerizada.
Ampicilina. Puede ser peligrosa por inhalacin, ingestin o absorcin por la piel.
Utilizar guantes apropiados y lentes de proteccin y manipular en la campana de
extraccin.
Azul de bromofenol. Puede ser peligroso por inhalacin, ingestin, o absorcin por
la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de proteccin y manipular en la
campana de extraccin.
Azul de Coomassie. Puede ser peligroso por inhalacin, ingestin, o absorcin por
la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de proteccin y manipular en la
campana de extraccin.
Bis-acrilamida. Ver acrilamida.
Bromuro de etidio. Potente mutagnico y txico. Evitar respirar el polvo. Utilizar
guantes apropiados para pesarlo o trabajar con soluciones que contienen este
colorante.
Cloroformo. Altamente voltil e irritante para la piel, ojos, mucosas y tracto
respiratorio. Carcingeno y puede daar hgado y riones. Evitar respirar sus
vapores. Puede ser peligroso por inhalacin, ingestin, o absorcin por la piel.
Utilizar guantes apropiados y lentes de proteccin y siempre manipular en la
campana de extraccin.
Dimetilsulfxido (DMSO). Puede ser peligroso por inhalacin y absorcin por la
piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de proteccin y manipular en una
campana de extraccin. El DMSO es combustible. Almacenar en un contenedor
bien cerrado. Apartar del calor, chispas y flamas.
68
Etanol. Puede ser peligroso por inhalacin, ingestin, o absorcin por la piel. Utilizar
guantes apropiados y lentes de proteccin y manipular en la campana de
extraccin.
Fenol. Extremadamente txico, altamente corrosivo y puede causar severas
quemaduras. Puede ser peligroso por inhalacin, ingestin o absorcin por la piel.
Utilizar guantes apropiados y lentes de proteccin y manipular en la campana de
extraccin. En caso de contacto con la piel, enjuagar con abundante agua y
lavar con jabn y agua pero nunca con etanol.
Hidrxido de sodio y soluciones que lo contienen. Altamente txico y custico.
Utilizar guantes apropiados, lentes de proteccin y mascarilla facial.
Isopropanol. Irritante y puede ser peligroso por inhalacin, ingestin, o absorcin
por la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de proteccin. No respirar el vapor.
Alejar del calor, chispas y flama.
Luz UV y radiacin UV. Peligrosa y puede daar la retina de los ojos. Es
mutagnica y carcinognica. Utilizar pantalla protectora, mascarilla o lentes de
proteccin.
N,N,N,N-tetrametiletilendiamina (TEMED). Extremadamente destructivo para
tejidos, mucosas y tracto respiratorio superior, ojos y piel. Su inhalacin puede ser
fatal. El contacto prolongado puede causar severa irritacin y quemaduras.
Utilizar guantes apropiados y lentes de proteccin y manipular en campana de
extraccin. Altamente inflamable, mantener lejos del calor, chispas y flamas.
Persulfato de amonio. Extremadamente destructivo para tejidos, mucosas y tracto
respiratorio superior, ojos y piel. Su inhalacin puede ser fatal. El contacto
prolongado puede causar severa irritacin y quemaduras. Utilizar guantes
apropiados y lentes de proteccin y manipular en campana de extraccin.
Poliacrilamida. Ver acrilamida.
SYBR Green I. Se encuentra en solucin concentrada 10,000X en DMSO, el cual es
una sustancia que transporta qumicos a travs de la piel y otros tejidos. Utilizar
guantes apropiados y lentes de proteccin.
Tris. Puede ser peligroso por inhalacin y absorcin por la piel. Utilizar guantes
apropiados y lentes de proteccin.
Xilen-cianol. Inflamable y narctico a altas concentraciones. Puede ser peligroso
por inhalacin y absorcin por la piel. Utilizar guantes apropiados y lentes de
proteccin y manipular en una campana de extraccin. Almacenar en un
contenedor bien cerrado. Apartar del calor, chispas y flamas.
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Bibliografa
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