Title: Un nuevo diterpenoide del mulinane del compacta de Azorella del arbusto del

amortiguador que crece en Per

Author(s): Francisco Salgado, Carlos Areche, Mario Simirgiotis, Cristina Quispe, Lina
Quispe and Teresa Cano
Source: Pharmacognosy Magazine. 10.39 (Aug. 2014): p543. From Academic OneFile.
Document Type: Report
Copyright: COPYRIGHT 2014 Medknow Publications and Media Pvt. Ltd.
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Texto completo:
Byline: Francisco. Salgado, Carlos. Areche, Beatriz. Sepulveda, Mario. Simirgiotis,
Ftima. Caceres, Cristina. Quispe, Lina. Quispe, Teresa. Cano
Antecedentes: El compacta de Azorella es un arbusto resinoso compacto de color verde
amarillo raro del amortiguador que crece de los altos Andes de meridional por? a la
Argentina del noroeste, y que es un productor de diterpenoides biolgicamente activos y
nicos. Objetivo: Este estudio investig los metabilitos secundarios presentes en una
muestra peruana de compacta de Azorella y de la evaluacin de la actividad
gastroprotective de los compuestos aislados en un modelo inducido gstrico de la lcera
en ratones. Material y mtodos: Seis metabilitos secundarios (diterpenoides 1-6)
presentan en el extracto del diclorometano (DCM) de compacta del A. que crece adentro
por? fueron aislados por una combinacin de la impregnacin de Sephadex LH-20 y la
cromatografa del gel de silicona y sus estructuras qumicas fueron aclaradas por los
mtodos espectroscpicos (RMN) y el modelado molecular. La actividad
gastroprotective del nuevo compuesto 1 fue evaluada en el cido clorhdrico/el modelo
gstrico EtOH-inducido de la lesin en ratones y comparada a la actividad mostrada por
los compuestos sabidos. Resultados: Un nuevo diterpeno del mulinane junto con cinco
diterpenoides sabidos se ha aislado de un Peruvian& #8202; la muestra de
compacta del A. y los resultados gastroprotective muestran que el compuesto 1 es
menos activo que los otros diterpenoides sabidos del mulinane aislados. Conclusiones:
A. compacta que crece adentro por? mostr la presencia del nuevo mulinane 1, que era
mal activo en el cido clorhdrico/el modelo gstrico EtOH-inducido de la lesin en
ratones. De hecho, la actividad era ms baja que otros diterpenoides (2-6) que
mostraban una funcin oxigenada en C-16 or/and C-20, que confirman el papel de un
grupo oxigenado (OH o cido carboxlico) para la actividad gastroprotective de los
compuestos del mulinane.
Introduccin
La flora terrestre ha formado la base de nuestros sistemas de la medicina tradicional e
incluso invoca hoy enorme inters en el mundo cientfico. Hay un optimismo puesto en
productos naturales en la bsqueda de nuevas drogas porque el mundo de las plantas
representa un depsito sin aprovechar de los compuestos naturales que nos esperan. El
gnero de Azorella es bien sabido para una amplia gama de metabilitos secundarios
tales como diterpenoides, triterpenoides y flavonoides presentes en varias especies del
gnero. [sorbo] [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15],
[16], [17] particularmente las especies andinas del gnero Azorella, Bolax, Mulinum y
Laretia se reconocen para la produccin de diterpenoides que tienen esqueletos nicos
del mulinane y del azorellane. [sorbo] [1] estos diterpenoides han exhibido una amplia
variedad de actividades biolgicas interesantes de las actividades, incluyendo

trypanosomicidal, [sorbo] [2] trichomonacidal, [sorbo] [3] toxoplasmocidal, [sorbo] [4]

antiplasmdicas, [sorbo] [5] del anti-bacteriano, [sorbo] [6], [7] antivirus, [sorbo] [8]
espermicidas, [sorbo] [9] citotxicas, [sorbo] [10], [11] antihiperglicmicas, [sorbo]
[12] antituberculares, [sorbo] [13], [14] antiinflamatorias y analgsicas. [sorbo] [18],
[19] el compacta de Azorella conocido como llareta se distribuye en las montaas de
los Andes de Per meridional, Chile del noreste, Bolivia, Ecuador meridional y la
Argentina del noroeste entre los cantos rodados en la correa Alto-andina en las altitudes
entre 3800-4000 y 4800-5200 M. Llareta es un arbusto compacto del amortiguador del
crecimiento extremadamente lento (solamente 1 cm en 20 aos). [sorbo] [20] la gente
andina utiliz esta planta desde las pocas precolombian para el tratamiento de fros, de
dolores, de la diabetes, del asma, de la bronquitis, de las denuncias de la matriz, de los
desordenes gstricos, del dolor de espalda, de heridas, y de la enfermedad de altitud.
[sorbo] [21] como una continuacin de nuestra sustancia qumica actual estudia en el
gnero de Azorella, divulgamos en este trabajo el aislamiento de cinco diterpenoides
sabidos junto con un nuevo diterpenoide del mulinane de una muestra de compacta del
A. que crece adentro por?. Adems, la actividad gastroprotective del nuevo diterpenoide
aislado contra el cido clorhdrico/etanol-indujo la prueba de la lcera gstrica en
ratones y la comparacin con los compuestos sabidos se divulga.
Material y mtodos
Procedimientos generales
la cromatografa de capa delgada Aluminio-revestida del gel de silicona (TLC, gel de
slice F254) fue desarrollada usando el n-hexano/las mezclas de EtOAc (1:0; 9:1; 7:3 y
1:1 v/v) como sistemas solventes mientras que los puntos fueron revelados rociando las
placas con H [submarino] 2 TAN [submarino] 4 - MeOH (el 5:95, v/v) y calefaccin en
el gel de silicona de 120 [los grados] C. (gel de slice 60, Merck 0.063-0.200
milmetros) y Sephadex (LH-20) fue utilizado para la cromatografa de columna abierta
(cc). Los solventes tcnicos usados en la extraccin a granel de la planta fueron
destilados y secados previamente segn procedimientos estndar.
Instrumentacin
Un espectrmetro de Bruker Avance AM-400 equipado de las puntas de prueba de 5
milmetros fue utilizado para todos los experimentos del RMN. Los compuestos fueron
disueltos en CDCl [submarino] 3 con el tetramethylsilane (TMS) como estndar interno.
[sorbo] 1 espectro de H-NMR fue obtenido en 400,13 megaciclos; [sorbo] espectro [de
13] C-NMR en 100,61 megaciclos. Los espectros del IR fueron registrados en un
espectrmetro del vector 22 FT-IR. Los espectros totales fueron registrados en un
espectrmetro termo del modelo del MAT 95XP Finnigan con un voltaje de aceleracin
de 3kV y la energa de ionizacin del eV 70. La temperatura de la fuente de ion fue
mantenida en 250 [los grados] C. que las rotaciones pticas fueron obtenidas en CHCl
[submarino] 3 en un Polax-2L ATAGO, polarmetro.
Material vegetal
Los especmenes fueron recogidos en 2012 en Patapampa (4980 m Arequipa, Per) e
identificaron como compacta de Azorella [cuadro 1] por el profesor experto Fatima
Caceres del botnico. Un espcimen del vale (N [grados] AC031112) se guarda en el

herbario del Departamento de Biologia, Universidad Nacional de San Agustin

(Arequipa, Per). {Cuadro 1}
Extraccin y aislamiento
Las partes areas de compacta del A. (400 g) fueron extrados con DCM (2 l) tres veces
por 7 das. El extracto concentrado de DCM (g) 10,5 fue sometida a una columna
abierta del gel de silicona (10 x 70 cm) usando el n-hexano/a las mezclas de EtOAc
(100:0 al 0:100% v/v) para dar cinco fracciones. Fraccin 1 (n-hexano 100%; el
magnesio 950) fue sujetado en una columna de Sephadex LH-20 (7 x 70 cm, n-hexano:
DCM: MeOH; 3:1: 1 v/v/v) seguido por la cromatografa de columna del silicagel (4 x
50 cm) que usa como n-hexano de la fase mvil solamente para permitir 1 (magnesio
20). Fraccin 2 (n-hexano: EtOAc; 8:2; 2,2 g) fueron impregnados a travs de Sephadex
LH-20 (7 x 70 cm, n-hexano: DCM: MeOH; 3:1: 1 v/v/v) permitir dos la fraccin 2A y
2B. La fraccin 2A (magnesio 200) fue sometida a una columna del gel de silicona (4 x
30 cm) usando el n-hexano/las mezclas de EtOAc (1:0 al 9:1 v/v) para rendir el cido de
1 (10 magnesio) y 2 [sorbo] [22] (mulin-11,13-dien-20-oic; magnesio 50). Fraccin 2B
(1,8 g) rechromatographed en el gel de silicona (4 los x 60cm) usando mezclas de nhexano/de EtOAc de la polaridad cada vez mayor como eluyentes (1:0 al 8:2 v/v) para
dar 2 (1,1 g) y 3 [sorbo] [3] (13a-hydroxyazorellane; magnesio 350). Fraccin 3 (nhexano: EtOAc; 6:4; 3,5 g) fueron impregnados en Sephadex LH-20 (7 x 70 cm; nhexano: DCM: MeOH; 3:2: 1 v/v/v) y entonces fue purificado sobre el gel de silicona
usando la cromatografa de columna abierta (4 x 60 cm) y el n-hexano/EtOAc como
eluyentes (0:1 al 0:10 v/v) para rendir 3 (100 magnesio), [sorbo] [23] (cido mulinic 4;
magnesio 300), [sorbo] [24] (cido mulinolic 5; 1g) y [sorbo] [25] (azorellanol 6; 1.1g).
Fraccin 4 (n-hexano: EtOAc; 3:7; 1,5 g) y fraccin 5 (EtOAc 100%; 1,0 g) fueron
impregnados en Sephadex LH-20 (7 x 70 cm; MeOH). No se observ ninguna presencia
de diterpenoides u otros metabilitos en esta ltima fraccin polar. Las estructuras
qumicas de los diterpenoides se muestran adentro [cuadro 2]. {Cuadro 1} {cuadro 2}
Procedimientos de cmputo
El anlisis conformacional de 1a y del 1b fue realizado usando un protocolo descrito en
las publicaciones anteriores [sorbo] [26], [27] primero, una bsqueda de Monte Carlo
fue hecho usando el campo de fuerza molecular de los mecnicos MMFF94 con el
programa ESPARTANO 02. [sorbo] [28] despus, conformers ms de poca energa
fueron obtenidos y despus reoptimized usando DFT en el nivel de B3LYP/6-31G (d)
de teora (programa GAUSIANO 09). [sorbo] [29] finalmente, las distancias de NOE
eran calculadas va 09 GAUSIANOS.
Actividad de Gastroprotective
Animales
Ratones suizos del albino (30 [+ o -] 3 g) fueron comprados en el Instituto de Salud
Publica de Chile en Santiago-Chile. Los ratones fueron alimentados en dieta certificada
del campen con el acceso libre al agua bajo condiciones estndar del ciclo de la
oscuro-luz de 12 h y en la temperatura ambiente de 20 [los grados] C. Los protocolos
fueron seguidos segn las recomendaciones del consejo canadiense sobre el cuidado
animal con las instrucciones ticas para las investigaciones en animales conscientes y

aprobados por el comit animal del uso y del cuidado de Universidad de Chile
(certificado aprobado el 2 de julio de 2010 por el Dr. Nicolas Giuliani). [sorbo] [30]
La actividad gastroprotective del diterpeno 1 fue evaluada en el cido clorhdrico/el
modelo EtOH-inducido de la lesin segn lo descrito previamente. [sorbo] [31], [32]
ratones fueron distribuidos aleatoriamente en los grupos de siete animales cada uno y
ayunados para 12 h con el acceso libre al agua antes del experimento. El diterpenoide 1
y el lansoprazole fueron suspendidos en el tween 80 (solucin del 1%), y administrados
intragastrically a los ratones en una dosis de 20 mg/kg en 10 ml/kg vol. cincuenta
minutos despus de la administracin de 1, lansoprazole o el tween 80 (10 ml/kg) del
1%, todos los grupos fue tratado oral con 0,2 ml de una solucin que contena la
solucin del etanol de 0,3 M el HCl/60% (cido clorhdrico/EtOH) para la induccin
gstrica de la lesin. Los animales fueron sacrificados 1 h despus de la administracin
del cido clorhdrico/de EtOH; los estmagos fueron suprimidos e inflados por la
inyeccin salina (1 ml). Los estmagos ulcerados fueron fijados en el formalina del 5%
para 30 mnimos y abiertos a lo largo de la mayor curvatura. El dao gstrico visible al
ojo desnudo fue observado en la mucosa gstrica como lneas negro-rojas alargadas,
paralelo al de eje largo del estmago similar al cido clorhdrico/a las lesiones EtOHinducidas en ratas. La longitud (milmetro) de cada lesin fue medida, y el ndice de la
lesin fue expresado como la suma de la longitud de todas las lesiones.
Anlisis estadstico
Los resultados se presentan como [+ o -] los sem malos. En todos los experimentos, las
diferencias estadsticas entre los tratamientos y su control respectivo fueron
determinadas por el anlisis de variacin unidireccional (ANOVA) seguido por la
prueba de Dunnet en parejas. El nivel de significacin fue fijado en P 0,01. La prisma 4
de GraphPad para Windows fue utilizada para todas las pruebas estadsticas.
Resultados
El extracto del diclorometano de las hojas del compacta del A. permiti el nuevo
diterpenoide 1 del mulinane y el cido sabido 2 de los compuestos mulin-11,13-dien-20oic, 13a-hydroxyazorellane 3, el cido mulinic 4, el cido mulinolic 5, y el azorellanol
6, por cromatografa del gel de silicona de la impregnacin de Sephadex LH-20 y de la
columna abierta. Las estructuras de los diterpenoides sabidos 2-6 y el nuevo compuesto
1 fueron aclaradas por la comparacin de sus datos del RMN con sos encontrados en
trabajos previos. [sorbo] [3], [5], [6], [7], [22], [23], [24]
Discusin
Aclaracin estructural del nuevo compuesto 1
La estructura de 1 fue aclarada principalmente por espectroscopia del RMN como sigue:
[Sorbo] el 1 espectro de H-NMR de 1 indic las resonancias para una mitad del dieno
en a H [sub] 5,64 (1H, d, J = 12,7, H-12), 5,52 (1H, DD, J = 12,7; 6,4, H-11), 5,48 (1H,
d, J = 8,1, H-14) junto con cuatro grupos metlicos en a H [sub] s 1,80, 0,93 d (6,6),
0,87 s, 0,84 d (6,6) y 0,74 S. Estos datos eran similares a las resonancias del cido de
los diterpenoides particularmente mulin-11,13-dien-20-oic del mulinane, que Loyola y
otros divulg anterior. [sorbo] [22] la diferencia principal era la presencia de un grupo

metlico adicional en 1 en lugar de un grupo carboxlico en 2. el departamento 135 y

[sorbo] 13 datos de C-NMR confirmaron la presencia de ese grupo metlico (a C [sub]
11,8) en vez del cido carboxlico (a C [sub] 182,1). [sorbo] 13 datos de C-NMR y la
espectrometra de masa de la bajo-resolucin indicaron la frmula molecular C
[submarino] 20 H [submarino] 32 para 1. La estructura de 1 fue determinada como
mulin-11, dieno 13. 1D y el 2.o RMN permitieron las asignaciones correctas de todas
las [sorbo] 1 seales de H RMN para el compuesto 1. En el espectro de HMBC, la seal
del protn en a H [sub] 1,33 (H-10) mostr correlaciones de largo alcance con las
seales del carbono en a C [sub] 11,8 (C-20), 24,1 (C-1) y 44,3 (C-5), y la seal del
protn en a H [sub] 0,72 (H [submarino] 3 -20) tena picos cruzados con a C [sub] 57,8
(C-3), 44,3 (C-5), 35,9 (C-6) y 54,6 (C-10) que indicaban que a C [sub] 11,8 para ser la
seal C-20. Las otras seales sabidas fueron deducidas en comparacin con los
espectros de 2. [sorbo] [22] la estereoqumica relativa de 1 fue asignada en base del 2.o
experimento de NOESY. En el espectro de NOESY, las correlaciones entre a H [sub]
0,87 (H [submarino] 3 -17) y a H [sub] 2,02 (H-9), y a H [sub] 0,73 (H [submarino] 3 20) y a H [sub] 2,02 (H-9) fueron observadas, indicando que estn en la misma cara
molecular de 1. No se detect ninguna correlacin de NOESY entre a H [sub] 1,33 (H10) y a H [sub] 0,87 (H [submarino] 3 -17) y a H [sub] 0,73 (H [submarino] 3 -20).
Asombrosamente, una interaccin fuerte de NOE fue observada entre a H [sub] 2,02 (H9) y a H [sub] 1,33 (H-10). Los un datos pasados son contrarios con la estereoqumica
relativa para los diterpenoides del mulinane. Para aclarar estos datos, el modelado
molecular fue utilizado para examinar las dos estructuras posibles de 1, correspondiente
a la a (1a) y [SZ] (1b) a orientaciones de H-10. La distribucin conformacional usando
una bsqueda de Monte Carlo fue realizada para definir conformaciones estables dentro
de 10 kcal/mol de ventana. Los conformers de poca energa entonces fueron sometidos a
la optimizacin adicional usando B3LYP funcional con un 6-31G (d) sistema de la base.
Dos estructuras optimizadas 1a y el 1b fueron obtenidas [cuadro 3], en los cuales las
distancias entre H-9 y H-10, H-17 y H-20 eran calculadas. En estructura las distancias
entre H-9 y H-10 llevados a un pico cruzado en el espectro de NOESY [vea [cuadro 1].
Sin embargo, el espectro de NOESY de 1 mostr a picos cruzados previstos cul es
constante con la configuracin de la estructura optimizada 1a y la configuracin relativa
divulgada para el mulinane-tipo diterpenoides. [sorbo] [3], [5], [6], [7], [22], [23], [24]
los datos espectroscpicos y fsicos para el nuevo compuesto 1 se presentan abajo.
{Cuadro 3} {cuadro 1}
Mulin-11,13-diene (1): Aceite blanco; FT-IR i [sub] mximo: 3090, 1440, 1260, 1125
cm [sorbo] - 1; HREIMS: Calcd. para C [submarino] 20 H [submarino] 32 [M [sorbo]
+*] 272,2504, encontraron: 272,2473; E-I-ms: m/z (rel. internacional. %): C
[submarino] 20 H [submarino] 32 272 [M [sorbo] +*] (4), 257 (2), 247 (4), 245 (68),
242 (13), 227 (24), 191 (66), 175 (19), 163 (12), 161 (28), 149 (33), 147 (33), 136 (27),
135 (43), 133 (25), 123 (31), 121 (83), 119 (41), 117 (9), 109 (51), 107 (100), 105 (48),
95 (54), 91 (48), 85 (26), 82 (47), 79 (53), 77 (35), 69 (44), 67 (46), 55 (64), 53 (27), 43
(48), 41 (61). [sorbo] [1] H RMN (400,13 megaciclos, CDCl [submarino] 3): 1,62 m;
1,22 m (H-1); 1,82 m; 1,26 m (H-2); 1,00 m (H-3); 1,50 m (H-4); 1,66 m; 1,40 m (H-6);
2,74 RFA (16,9); 1,56 m (H-7); 2,02 DD (6,4; 8,8) (H-9); 1,33 m (H-10); 5,52 DD (6,4;
12,7) (H-11); 5,63 d (12,7) (H-12); 5,48 d (8,1) (H-14); 1,63 m; 1,23 m (H-15); 1,8 s
(H-16); 0,87 s (H-17); 0,84 d (6,6) (H-18); 0,92 d (6,6) (H-19); 0,73 s (H-20). [sorbo]
[13] C RMN (100,61 megaciclos, CDCl [submarino] 3): 24,1 t (C-1); 28,5 t (C-2); 57,8
d (C-3); 31,1 d (C-4); 44,3 s (C-5); 35,9 t (C-6); 36,4 t (C-7); 34,9 s (C-8); 48,9 d (C-9);

54,6 d (C-10); 133,7 d (C-11); 127,6 d (C-12); 131,5 s (C-13); 125,5 d (C-14); 39,0 t
(C-15); 25,8 q (C-16); 27,3 q (C-17); 23,1 q (C-18); 22,4 q (C-19); 11,8 q (C-20).
Actividad de Gastroprotective
El efecto de mulin-11, 13 dieno 1 en el modelo de las lceras gstricas inducidas por el
cido clorhdrico/EtOH en ratones se muestra adentro [cuadro 2]. Una sola
administracin oral de 1 y el lansoprazole en 20 mg/kg inhibieron el aspecto de lesiones
gstricas por el 18% y el 68%, respectivamente. {Cuadro 2}
El desequilibrio entre los factores agresivos (los agentes qumicos, cido gstrico,
pepsina, bilis, lisolecitina, las enzimas pancreticas, tensin y las drogas) y protectores
(moco, PGS, bicarbonato, renovacin rpida de la clula epitelial, compuestos del
sulfidrilo y flujo de sangre gstrico) en la mucosa gstrica puede llevar al dao gstrico.
[sorbo] [33] en las otras manos, los diversos compuestos naturales de las plantas
medicinales son una fuente de agentes gastroprotective. [sorbo] [34], [35], [36], [37] en
un estudio anterior, vario los diterpenoides del mulinane y del azorellane mostraron
actividad gastroprotective en 20 mg/kg en el cido clorhdrico/el modelo gstrico EtOHinducido de la lesin en ratones. [sorbo] [38] entre los compuestos estudiados, el
azorellanol (6), 13 [SZ] - hydroxyazorellane y el cido de mulin-11,13-dien-18-acetoxy16,20-dioic mostraron el mayor efecto gastroprotective, siendo tan activos como
lansoprazole y reduciendo las lesiones gstricas por por lo menos el 69%. El mismo
estudio demostr que en la serie del diterpenoide del mulinane, la mejor actividad fue
relacionada con la presencia de un cido carboxlico adicional. En nuestro estudio, el
hidrocarburo 1 era menos activo que el lansoprazole que reduca las lesiones gstricas
por el 18%. Claramente, la misma tendencia fue observada para la actividad
gastroprotective cuando estaba comparada a los compuestos naturales mulin-11,13dien-20-ol (el 26%), al cido de mulin-11,13-dien-20-oic (el 39%) y a mulin-11,13dien-18-acetoxy-16, cido dioic 20 (el 73%). Por lo tanto, segn los resultados, se
sugiere que el efecto gastroprotective aumenta con el grado de oxidacin en los
carbonos C-16 y C-20 en diterpenoides del mulinane.
Conclusin
Segn mi entender, ningunos estudios anteriores en la qumica del compacta del A.
muestrean el crecimiento adentro por? fueron publicados, as ste es el primer informe
de metabilitos secundarios de la planta peruana y de la presencia del nuevo compuesto 1
del mulinane en las hojas, que fue aclarado completamente usando el RMN y tcnicas
de modelado moleculares. Adems, la actividad gastroprotective contra lceras en
ratones fue probada para este nuevo compuesto que bajo (el 18%) fue comparado al
lanzoprasole positivo del control (el 68%) y otros mulinanes sabidos aislaron que
confirman de hecho el papel de un grupo oxigenado (OH o cido carboxlico) en C-16 y
C-20 para la actividad gastroprotective de los diterpenoides del mulinane.
Reconocimientos
La ayuda financiera de FONDECYT DE INICIACION N [grados] 11110241
agradecido se reconoce.
Referencias

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Francisco. Salgado, Carlos. Areche, Beatriz. Sepulveda, Mario. Simirgiotis, Ftima.
Caceres, Cristina. Quispe, Lina. Quispe, Teresa. Cano
Source Citation (MLA 7th Edition)
Salgado, Francisco, et al. "A new mulinane diterpenoid from the cushion shrub Azorella
compacta growing in Peru." Pharmacognosy Magazine 10.39 (2014): 543. Academic
OneFile. Web. 18 Sept. 2014.

Document URL
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Gale Document Number: GALE|A381631766

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A new mulinane diterpenoid from the cushion shrub Azorella compacta growing in Peru
Author(s): Francisco Salgado, Carlos Areche, Mario Simirgiotis, Cristina Quispe, Lina
Quispe and Teresa Cano
Source: Pharmacognosy Magazine. 10.39 (Aug. 2014): p543. From Academic OneFile.
Document Type: Report
Copyright: COPYRIGHT 2014 Medknow Publications and Media Pvt. Ltd.
http://www.phcog.com/
Full Text:
Byline: Francisco. Salgado, Carlos. Areche, Beatriz. Sepulveda, Mario. Simirgiotis,
Fatima. Caceres, Cristina. Quispe, Lina. Quispe, Teresa. Cano
Background: Azorella compacta is a rare yellow-green compact resinous cushion shrub
growing from the high Andes of southern Per? to northwestern Argentina, and which is
a producer of biologically active and unique diterpenoids. Objective: This study
investigated the secondary metabolites present in a Peruvian sample of Azorella
compacta and the evaluation of gastroprotective activity of the isolated compounds in a
gastric- induced ulcer model in mice. Material and Methods: Six secondary metabolites
(diterpenoids 1-6) present in the dichloromethane (DCM) extract of A. compacta
growing in Per? were isolated by a combination of Sephadex LH-20 permeation and
silica gel chromatography and their chemical structures were elucidated by
spectroscopic methods (NMR) and molecular modeling. The gastroprotective activity of
the new compound 1 was evaluated on the HCl/EtOH-induced gastric lesion model in
mice and compared to the activity showed by the known compounds. Results: A new
mulinane diterpene along with five known diterpenoids have been isolated from a
Peruvian  sample of A. compacta and the gastroprotective results show that
compound 1 is less active than the other known mulinane diterpenoids isolated.
Conclusions: A. compacta growing in Per? showed the presence of the new mulinane 1,
which was poorly active in the HCl/EtOH-induced gastric lesion model in mice. Indeed,
the activity was lower than other diterpenoids (2-6) showing an oxygenated function at
C-16 or/and C-20, which confirm the role of an oxygenated group (OH or carboxylic
acid) for the gastroprotective activity of mulinane compounds.
Introduction
Terrestrial flora has formed the basis of our traditional medicine systems and even today
invokes tremendous interest in the scientific world. There is an optimism placed on
natural products in the search of new drugs because the world of the plants represents an
untapped reservoir of natural compounds waiting for us. The Azorella genus is well
known for a wide range of secondary metabolites such as diterpenoids, triterpenoids and
flavonoids present in several species of the genus.
[sup][1],[2],[3],[4],[5],[6],[7],[8],[9],[10],[11],[12],[13],[14],[15],[16],[17] In particular
Andean species of the genus Azorella, Bolax, Mulinum and Laretia are recognized for
the production of diterpenoids having unique mulinane and azorellane skeletons.
[sup][1] These diterpenoids have displayed a wide variety of interesting biological
activities, including trypanosomicidal, [sup][2] trichomonacidal, [sup][3]
toxoplasmocidal, [sup][4] antiplasmodial, [sup][5] antibacterial, [sup][6],[7] antiviral,
[sup][8] spermicidal, [sup][9] cytotoxic, [sup][10],[11] antihyperglycemic, [sup][12]
antitubercular, [sup][13],[14] antiinflammatory and analgesic activities. [sup][18],[19]
Azorella compacta known as "llareta" is distributed in the Andes mountains of southern

Peru, northeastern Chile, Bolivia, southern Ecuador and northwestern Argentina among
boulders in the High-Andean belt at altitudes between 3800-4000 and 4800-5200 m.
Llareta is a compact cushion shrub of extremely slow growth (only 1 cm in 20 years).
[sup][20] The Andean people utilized this plant since precolombian times for the
treatment of colds, pains, diabetes, asthma, bronchitis, womb complaints, gastric
disorders, backache, wounds, and altitude sickness. [sup][21] As a continuation of our
current chemical studies on the Azorella genus, we report in this work the isolation of
five known diterpenoids along with a new mulinane diterpenoid from a sample of A.
compacta growing in Per?. Furthermore, the gastroprotective activity of the new
isolated diterpenoid against the HCl/ethanol-induced gastric ulcer test in mice and
comparison with the known compounds is reported.
Material and Methods
General procedures
Aluminum-coated silica gel thin layer chromatography (TLC, Kieselgel F254) was
developed using n -hexane/EtOAc mixtures (1:0; 9:1; 7:3 and 1:1 v/v) as solvent
systems while the spots were revealed by spraying the plates with H [sub]2 SO [sub]4 MeOH (5:95, v/v) and heating at 120[degrees]C. Silica gel (Kieselgel 60, Merck 0.0630.200 mm) and Sephadex (LH-20) were used for open column chromatography (CC).
Technical solvents used in bulk plant extraction were previously distilled and dried
according to standard procedures.
Instrumentation
A Bruker Avance AM-400 spectrometer equipped with 5 mm probes was used for all
NMR experiments. Compounds were dissolved in CDCl [sub]3 with tetramethylsilane
(TMS) as internal standard. [sup]1 H-NMR spectrum was obtained at 400.13 MHz;
[sup][13] C-NMR spectrum at 100.61 MHz. IR spectra was recorded on a Vector 22
FT-IR spectrometer. Mass spectra were recorded on a MAT 95XP Thermo Finnigan
model spectrometer with an accelerating voltage of 3kV and ionization energy of 70 eV.
The temperature of the ion source was maintained at 250[degrees]C. Optical rotations
were obtained in CHCl [sub]3 on a Polax-2L ATAGO, polarimeter.
Plant material
Specimens were collected in 2012 at "Patapampa" (4980 m Arequipa, Peru) and
identified as Azorella compacta [Figure 1] by the expert botanist Prof. Fatima Caceres.
A voucher specimen (N[degrees] AC031112) is kept at the Herbarium of the
Departamento de Biologia, Universidad Nacional de San Agustin (Arequipa,
Peru).{Figure 1}
Extraction and isolation
The aerial parts of A. compacta (400 g) were extracted with DCM (2 l) three times for 7
days. The concentrated DCM extract (10.5 g) was submitted to an open silica gel
column (10 x 70 cm) using n -hexane/EtOAc mixtures (100:0 to 0:100% v/v) to give
five fractions. Fraction 1 (100% n -hexane; 950 mg) was subjected on a Sephadex LH20 column (7 x 70 cm, n -hexane: DCM: MeOH; 3:1:1 v/v/v) followed by silicagel

column chromatography (4 x 50 cm) using as mobile phase only n -hexane to afford 1 (

20 mg). Fraction 2 ( n -hexane: EtOAc; 8:2; 2.2 g) was permeated through Sephadex
LH-20 (7 x 70 cm, n -hexane: DCM: MeOH; 3:1:1 v/v/v) to afford two fraction 2A and
2B. Fraction 2A (200 mg) was submitted to a silica gel column (4 x 30 cm) using n hexane/EtOAc mixtures (1:0 to 9:1 v/v) to yield 1 ( 10 mg) and 2 [sup][22] (mulin11,13-dien-20-oic acid; 50 mg). Fraction 2B (1.8 g) was rechromatographed on silica
gel (4 x 60cm) using mixtures of n -hexane/EtOAc of increasing polarity as eluents (1:0
to 8:2 v/v) to give 2 ( 1.1 g) and 3 [sup][3] (13a-hydroxyazorellane; 350 mg). Fraction 3
( n -hexane: EtOAc; 6:4; 3.5 g) was permeated on Sephadex LH-20 (7 x 70 cm; n hexane: DCM: MeOH; 3:2:1 v/v/v) and then was purified over silica gel using open
column chromatography (4 x 60 cm) and n -hexane/EtOAc as eluents (0:1 to 0:10 v/v)
to yield 3 ( 100 mg), 4 [sup][23] (mulinic acid; 300 mg), 5 [sup][24] (mulinolic acid;
1g) and 6 [sup][25] (azorellanol; 1.1g). Fraction 4 ( n -hexane: EtOAc; 3:7; 1.5 g) and
fraction 5 (100% EtOAc; 1.0 g) were permeated on Sephadex LH-20 (7 x 70 cm;
MeOH). No presence of diterpenoids or other metabolites were observed in this last
polar fraction. The chemical structures of the diterpenoids are shown in [Figure
2].{Figure 1}{Figure 2}
Computational procedures
Conformational analysis of 1a and 1b was carried out using a protocol described in
previous publications [sup][26],[27] First, a Monte Carlo search was done using the
MMFF94 molecular mechanics force field through the SPARTAN 02 program.
[sup][28] Next, lower-energy conformers were obtained and then reoptimized using
DFT at the B3LYP/6-31G (d) level of theory (GAUSSIAN 09 program). [sup][29]
Finally, NOE distances were calculated via GAUSSIAN 09.
Gastroprotective activity
Animals
Swiss albino mice (30 [+ or -] 3 g) were purchased at the Instituto de Salud Publica de
Chile in Santiago-Chile. Mice were fed on certified Champion diet with free access to
water under standard conditions of 12-h dark-light cycle and at 20[degrees]C room
temperature. The protocols were followed according to the recommendations of the
Canadian Council on Animal Care with the ethical guidelines for investigations in
conscious animals and were approved by the Universidad de Chile Animal Use and
Care Committee (certificate approved on July 2, 2010 by Dr. Nicolas Giuliani).
[sup][30]
The gastroprotective activity of the diterpene 1 was evaluated in the HCl/EtOH-induced
lesion model as described previously. [sup][31],[32] Mice were randomly distributed
into groups of seven animals each and fasted for 12 h with free access to water prior to
the experiment. Diterpenoid 1 and lansoprazole were suspended in Tween 80 (1%
solution), and was administered intragastrically to mice at a dose of 20 mg/kg in a 10
ml/kg vol. Fifty minutes after administration of 1 , lansoprazole or 1% Tween 80 (10
ml/kg), all groups were orally treated with 0.2 ml of a solution containing 0.3 M
HCl/60% ethanol solution (HCl/EtOH) for gastric lesion induction. Animals were
sacrificed 1 h after the administration of HCl/EtOH; the stomachs were excised and
inflated by saline injection (1 ml). The ulcerated stomachs were fixed in 5% formalin

for 30 min and opened along the greater curvature. Gastric damage visible to the naked
eye was observed in the gastric mucosa as elongated black-red lines, parallel to the long
axis of the stomach similar to the HCl/EtOH-induced lesions in rats. The length (mm) of
each lesion was measured, and the lesion index was expressed as the sum of the length
of all lesions.
Statistical analysis
Results are presented as the mean [+ or -] sem. In all experiments, statistical differences
between treatments and their respective control were determined by one-way analysis of
variance (ANOVA) followed by Dunnet's pair-wise test. The level of significance was
set at P < 0.01. GraphPad Prism 4 for Windows was used for all statistical tests.
Results
The dichloromethane extract of the leaves of A. compacta afforded the new mulinane
diterpenoid 1 and the known compounds mulin-11,13-dien-20-oic acid 2 , 13ahydroxyazorellane 3 , mulinic acid 4 , mulinolic acid 5 , and azorellanol 6 , by
Sephadex LH-20 permeation and open column silica gel chromatography. The
structures of the known diterpenoids 2-6 and the new compound 1 were elucidated by
comparison of their NMR data with those found in previous works.
[sup][3],[5],[6],[7],[22],[23],[24]
Discussion
Structural elucidation of the new compound 1
The structure of 1 was mainly elucidated by NMR spectroscopy as follows: The [sup]1
H-NMR spectrum of 1 indicated resonances for a diene moiety at a[sub]H 5.64 (1H, d ,
J = 12.7, H-12), 5.52 (1H, dd , J = 12.7; 6.4, H-11), 5.48 (1H, d , J = 8.1, H-14) along
with four methyl groups at a[sub]H 1.80 s , 0.93 d (6.6), 0.87 s , 0.84 d (6.6) and 0.74 s .
These data were similar to the resonances of the mulinane diterpenoids particularly
mulin-11,13-dien-20-oic acid, which Loyola et al . earlier reported. [sup][22] The major
difference was the presence of an additional methyl group in 1 in place of a carboxylic
group in 2 . DEPT 135 and [sup]13 C-NMR data confirmed the presence of that methyl
group (a[sub]C 11.8) instead of carboxylic acid (a[sub]C 182.1). [sup]13 C-NMR data
and low-resolution mass spectrometry indicated the molecular formula C [sub]20 H
[sub]32 for 1 . The structure of 1 was determined as mulin-11, 13-diene. 1D and 2D
NMR allowed the correct assignments of all [sup]1 H NMR signals for compound 1 . In
the HMBC spectrum, the proton signal at a[sub]H 1.33 (H-10) showed long-range
correlations with the carbon signals at a[sub]C 11.8 (C-20), 24.1 (C-1) and 44.3 (C-5),
and the proton signal at a[sub]H 0.72 (H [sub]3 -20) had cross peaks with a[sub]C 57.8
(C-3), 44.3 (C-5), 35.9 (C-6) and 54.6 (C-10) indicating that a[sub]C 11.8 to be the C20 signal. The other known signals were deduced by comparison with the spectra of 2.
[sup][22] The relative stereochemistry of 1 was assigned on the basis of 2D NOESY
experiment. In the NOESY spectrum, correlations between a[sub]H 0.87 (H [sub]3 -17)
and a[sub]H 2.02 (H-9), and a[sub]H 0.73 (H [sub]3 -20) and a[sub]H 2.02 (H-9) were
observed, indicating that they are on the same molecular face of 1 . No NOESY
correlation was detected between a[sub]H 1.33 (H-10) and a[sub]H 0.87 (H [sub]3 -17)
and a[sub]H 0.73 (H [sub]3 -20). Surprisingly, a strong NOE interaction was observed

between a[sub]H 2.02 (H-9) and a[sub]H 1.33 (H-10). The last one data is inconsistent
with the relative stereochemistry for mulinane diterpenoids. To clarify this data,
molecular modeling was used to examine the two possible structures of 1 ,
corresponding to the a (1a) and [sz] (1b) orientations of H-10. Conformational
distribution using a Monte Carlo search was carried out to define stable conformations
within a 10 kcal/mol window. Low-energy conformers were then submitted to further
optimization using B3LYP functional with a 6-31G(d) basis set. Two optimized
structures 1a and 1b were obtained [Figure 3], in which the distances between H-9 and
H-10, H-17 and H-20 were calculated. In both structures the distances between H-9 and
H-10 led to a cross peak in the NOESY spectrum [see [Table 1]. However, the NOESY
spectrum of 1 showed the expected cross peaks which are consistent with the
configuration of the optimized structure 1a and the relative configuration reported for
mulinane-type diterpenoids. [sup][3],[5],[6],[7],[22],[23],[24] The spectroscopic and
physical data for new compound 1 is presented below.{Figure 3}{Table 1}
Mulin-11,13-diene (1) : White oil; FT-IR i[sub]max : 3090, 1440, 1260, 1125 cm [sup]1 ; HREIMS: Calcd. for C [sub]20 H [sub]32 [M [sup]+* ] 272.2504, found: 272.2473;
EI-MS: m/z (rel. int. %): C [sub]20 H [sub]32 272 [M [sup]+* ] (4), 257 (2), 247 (4),
245 (68), 242 (13), 227 (24), 191 (66), 175 (19), 163 (12), 161 (28), 149 (33), 147 (33),
136 (27), 135 (43), 133 (25), 123 (31), 121 (83), 119 (41), 117 (9), 109 (51), 107 (100),
105 (48), 95 (54), 91 (48), 85 (26), 82 (47), 79 (53), 77 (35), 69 (44), 67 (46), 55 (64),
53 (27), 43 (48), 41 (61). [sup][1] H NMR (400.13 MHz, CDCl [sub]3 ): 1.62 m; 1.22
m (H-1); 1.82 m; 1.26 m (H-2); 1.00 m (H-3); 1.50 m (H-4); 1.66 m; 1.40 m (H-6); 2.74
brd (16.9); 1.56 m (H-7); 2.02 dd (6.4;8.8) (H-9); 1.33 m (H-10); 5.52 dd (6.4; 12.7) (H11); 5.63 d (12.7) (H-12); 5.48 d (8.1) (H-14); 1.63 m; 1.23 m (H-15); 1.8 s (H-16); 0.87
s (H-17); 0.84 d (6.6) (H-18); 0.92 d (6.6) (H-19); 0.73 s (H-20). [sup][13] C NMR
(100.61 MHz, CDCl [sub]3 ): 24.1 t (C-1); 28.5 t (C-2); 57.8 d (C-3); 31.1 d (C-4); 44.3
s (C-5); 35.9 t (C-6); 36.4 t (C-7); 34.9 s (C-8); 48.9 d (C-9); 54.6 d (C-10); 133.7 d (C11); 127.6 d (C-12); 131.5 s (C-13); 125.5 d (C-14); 39.0 t (C-15); 25.8 q (C-16); 27.3 q
(C-17); 23.1 q (C-18); 22.4 q (C-19); 11.8 q (C-20).
Gastroprotective activity
The effect of mulin-11, 13-diene 1 on the model of gastric ulcers induced by HCl/EtOH
in mice is shown in [Table 2]. A single oral administration of 1 and lansoprazole at 20
mg/kg inhibited the appearance of gastric lesions by 18% and 68%, respectively.{Table
2}
The imbalance between aggressive (chemical agents, gastric acid, pepsin, bile,
lysolecithin, pancreatic enzymes, stress and drugs) and protective factors (mucus, PGs,
bicarbonate, fast epithelial cell renewal, sulfhydryl compounds and gastric blood flow)
in the gastric mucosa may lead to gastric damage. [sup][33] On the other hands, various
natural compounds from medicinal plants are a source of gastroprotective agents.
[sup][34],[35],[36],[37] In a previous study, several mulinane and azorellane
diterpenoids showed gastroprotective activity at 20 mg/kg on the HCl/EtOH-induced
gastric lesion model in mice. [sup][38] Among the compounds studied, azorellanol ( 6 ),
13[sz]-hydroxyazorellane and mulin-11,13-dien-18-acetoxy-16,20-dioic acid showed
the greater gastroprotective effect, being as active as lansoprazole and reducing the
gastric lesions by at least 69%. The same study demonstrated that in the mulinane
diterpenoid series, the best activity was related to the presence of an additional

carboxylic acid. In our study, the hydrocarbon 1 was less active than lansoprazole
reducing the gastric lesions by 18%. Clearly, the same trend was observed for the
gastroprotective activity when compared to the natural compounds mulin-11,13-dien20-ol (26%), mulin-11,13-dien-20-oic acid (39%) and mulin-11,13-dien-18-acetoxy-16,
20-dioic acid (73%). Therefore, according to the results, it is suggested that the
gastroprotective effect increases with the degree of oxidation at both carbons C-16 and
C-20 in mulinane diterpenoids.
Conclusion
To the best of our knowledge, no previous studies on the chemistry of A. compacta
samples growing in Per? were published, thus this is the first report of secondary
metabolites from the Peruvian plant and the presence of the new mulinane compound 1
in the leaves, which was fully elucidated using NMR and molecular modeling
techniques. Furthermore, the gastroprotective activity against ulcers in mice was tested
for this new compound which was low (18%) compared to the positive control
lanzoprasole (68%) and other known mulinanes isolated which indeed confirm the role
of an oxygenated group (OH or carboxylic acid) at C-16 and C-20 for the
gastroprotective activity of mulinane diterpenoids.
Acknowledgments
Financial support by FONDECYT DE INICIACION N[degrees] 11110241 is gratefully
acknowledged.
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Source Citation (MLA 7th Edition)
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Document URL
http://go.galegroup.com/ps/i.do?id=GALE%7CA381631766&v=2.1&u=fondoconacyt&
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Gale Document Number: GALE|A381631766