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RESUMEN
1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS
1.1. Cintica enzimtica
La cintica enzimtica es la parte de la Enzimologa que se ocupa del
estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas y las
causas de su variacin. Los ensayos enzimticos se emplean rutinariamente
en muchos laboratorios clnicos para el diagnstico de numerosas
enfermedades, bien observando velocidades de reaccin anormales o bien
observando niveles enzimticos inadecuados en el plasma u otros tejidos.
Un ensayo enzimtico se basa en la actuacin de la enzima sobre una
sustancia, llamada sustrato, catalizando su conversin en otra especfica,
conocida como producto. Normalmente algn elemento de los que intervienen
en la reaccin absorbe luz a una longitud de onda determinada, con lo que la
reaccin puede seguirse por colorimetra o espectrofotometra.
1
HO P OH
Fosfatasa
alcalina
O
O
H2 O
+ HO P OH
OH
p-nitrofenil-fosfato
p-nitrofenol
Figura 1. Reaccin enzimtica
1.4. Objetivos
Comprobar la aplicacin prctica en el laboratorio de los principios tericos
de la Enzimologa, tales como:
Efecto del tiempo de reaccin en la aparicin de producto.
Representacin de la curva de progreso de la reaccin.
Clculo de la actividad enzimtica a partir de la velocidad inicial de la
reaccin (vi).
Efecto de la concentracin de enzima sobre la velocidad de reaccin.
2
3. PROTOCOLOS A REALIZAR
3.1. Efecto del tiempo de reaccin en la aparicin de producto.
3.1.1. A 5 tubos de ensayo y se aaden los reactivos que se detallan en la
Tabla 1. Se agitan suavemente e incuban en bao termostatizado a
30 C los tiempos indicados.
Tabla 1: Efecto del tiempo de reaccin en la aparicin de producto.
Tubo (n)
Tampn (ml)
Sustrato (ml)
Enzima (ml)
Tiempo (min)
2
1
1
1
1
1
1
1
--1
1
1
AGITAR SUAVEMENTE E INCUBAR A 30 C
5
5
10
15
1
1
1
20
3.2.1. A una serie de 5 tubos de ensayo se les aade los distintos reactivos
segn se indica en la Tabla 2, obtenindose as concentraciones
crecientes de enzima en los mismos. Tras agitar suavemente se
incuban en bao termostatizado el tiempo indicado:
Tabla 2. Efecto de la concentracin de enzima sobre la velocidad de la reaccin.
Tubo (n)
1
2
3
4
5
Tampn (ml)
2,5
2,3
2,1
1,9
1,7
Sustrato (ml)
1,0
1,0
1,0
1,0
1,0
Enzima (ml)
--0,2
0,4
0,6
0,8
AGITAR SUAVEMENTE E INCUBAR A 30 C 10 minutos
6
--3,0
0,5
3.3.2. Al finalizar los 10 minutos de reaccin, retirar los tubos del bao y
aadir inmediatamente 0,5 ml de la solucin de fosfato mezclando
para detener la reaccin.
3.3.3. Medir la absorbancia a los distintos tubos a 405 nm; usando como
blanco el n 1.
4. RESULTADOS ESPERADOS
4.1. Efecto del tiempo de reaccin en la aparicin de producto.
La actividad de una enzima se determina conociendo la velocidad de la
reaccin que cataliza. La velocidad de reaccin se define como la cantidad de
sustrato consumido o de producto formado por unidad de tiempo. En nuestro
caso representaremos la aparicin de producto frente al tiempo (Figura 2),
obteniendo la curva de progreso de la reaccin. El clculo de la concentracin
.C.l;
en
-1
0,0 24
0,0 18
d [P]
0,0 12
a
b
[p
-N
IT
R
O
F
E
N
O
L
]
(m
M
)
dt
= vi =
0,0 06
a
0
0
10
15
20
TIEMPO (min)
A = . C. I
C=
.I
[Producto]
(mM)
0,00
0,035
0,051
4
5
15
20
1,203
1,300
0,065
0,07
b
a
Aplicando la ecuacin:
Vi =
b
a
0,0 5 -0 ,0 3 5
= 0 ,0 0 3 mM min- 1
10 -5
Velocidad
(mM/min)
0,0
0,00143
0,00240
0,00330
0,00410
0,0
0,1
0,5
1,0
2,0
3,0
0,0
0,0085
0,0489
0,0850
0,1710
0,2570
0,0
0,068
0,328
0,558
0,889
1,124
0,0
0,0038
0,0170
0,0300
0,0480
0,0620
0,0
0,00038
0,0017
0,003
0,0048
0,006
Velocidad/[
S]
(min-1)
0,0
0,045
0,039
0,035
0,028
0,024
1/[S]
(mM-1)
0,0
117,76
23,31
11,76
5,84
3,89
5. DISCUSIN Y COMENTARIOS
Los resultados obtenidos, se fijan a los objetivos planteados en el
desarrollo de la prctica.
11
6. BIBLIOGRAFA COMENTADA
Nelson DL, Cox MM (2001): Principios de Bioqumica, 3 ed. Editorial
Omega (Barcelona, Espaa), pp 304-305.
Stryer L, Berg JM, Tymoczko JL (2003): Bioqumica, 5 ed. Editorial Revert
(Barcelona, Espaa), pp 577-580.
0,203 g
0,136 g
Hasta 1 litro
0,026 g
Hasta 200 ml
228,2 g
Hasta 1 litro
13