Mtodos

cromatogrficos
CROMATOGRAFIA
Conjunto de tcnicas utilizadas para la separacin de mezclas de
solutos, basada en la diferente solubilidad de los solutos
por dos solventes inmiscibles.
Se desarroll en Inglaterra en la dcada del 40 para la separacin
de
sustancias coloreadas (de all su nombre: cromatografa).
El fundamento de todas las formas de cromatografa es el
coeficiente de
particin (K
d
) que describe la distribucin de un compuesto en las
dos
fases inmiscibles:

concentracin en la fase A

K
d
= ---------------------------

concentracin en la fase B
Las dos fases de todo sistema cromatogrfico se denominan:

- Fase estacionaria o fase fija: un slido, un gel, un lquido.

- Fase mvil: un lquido o un gas, que fluye sobre o a travs de
la fase fija.

Se escoge las fases de modo que los coeficientes de particin de los
componentes de la mezcla sean lo ms distintos posible.
TIPOS DE CROMATOGRAFIA
Se los clasifica de acuerdo al principio fsico-qumico que permite la
separacin:

ADSORCION: equilibrio entre una fase fija slida y una fase mvil
lquida. (Ej: cromatografa de adsorcin; cromatografa de interaccin
hidrofbica).

PARTICION: equilibrio entre una fase fija lquida y una fase mvil
lquida o gaseosa. (Ej: cromatografa en fase reversa; cromatografa
gas-lquido; cromatografa de contra-corriente).

INTERCAMBIO IONICO: equilibrio entre un intercambiador inico
fijo y una fase mvil con electrolitos. (Ej: cromatografa de intercambio
inico; cromatoenfoque).
TIPOS DE CROMATOGRAFIA (continuacin)
EXCLUSION: equilibrio entre un lquido atrapado en los poros de una
fase fija slida y un fase mvil lquida. (Ej: cromatografa de filtracin
molecular).

AFINIDAD: equilibrio entre un ligando inmovilizado (fase fija) y un
ligando en solucin (fase mvil). (Ej: cromatografa de afinidad;
cromatografa de inmunoafinidad; cromatografa de ligando-colorante).

En la prctica, es comn que dos o ms de estos tipos de equilibrio
operen en forma simultnea en una determinada cromatografa.

PARAMETROS DE RENDIMIENTO CROMATOGRAFICO
En cromatografa, dos tipos de procesos afectan el comportamiento
de los analitos y con ello el xito de la separacin:

1.- Mecanismos fsico-qumicos bsicos que definen el proceso (p.
ej., particin, adsorcin, intercambio inico, etc.).

2.- Procesos que tienden a oponerse a la separacin, p. ej. difusin,
que producen bandas ms anchas y tailing.
ALGUNAS DEFINICIONES:
- Tiempo de retencin (t
r
): tiempo requerido por un analito para
emerger de la columna.

- Volumen de elucin (V
e
): volumen de fase mvil requerido para
eluir el analito.

-Velocidad de flujo (F
c
) de la fase mvil (ml/min). Influenciado por
las dimensiones de la columna, la caracterstica fsica de las partculas,
y la viscosidad de la fase mvil.

V
e
= t
r
x F
c



UN CROMATOGRAMA:
Se grafica la respuesta del detector en funcin del tiempo de retencin
(o volumen de elucin).
La asimetra de un pico puede tener distintas causas: aplicacin de un
exceso de analito, mal empaque de la columna, deficiente aplicacin de
la muestra, etc.
El xito de una cromatografa se mide por su capacidad de separar
(resolver) completamente un analito de una mezcla.

La resolucin de dos picos A y B (R
s
) depende de las propiedades
de stos:

2 (t
rB
- t
rA
)
R
s
= ---------------- donde: t
rA
y t
rB
son los tiempos de retencin
w
A
+ w
B
de A y de B.
y w
A
y w
B
el ancho de la base de los picos
respectivos.


Valores de R
s
de 1,0 corresponde a una separacin del 98 %, lo que
es adecuado para anlisis cuantitativo.
Se considera que las columnas cromatogrficas consisten de un
conjunto de zonas adyacentes donde hay suficiente espacio para que
los solutos logren un equilibrio completo entre las fases fija y mvil.
Cada una de estas zonas hipotticas se denomina un "plato terico" y su
altura en la columna es la "altura del plato" (H).

Una columna es ms efectiva mientras ms platos tericos tenga.

El nmero de platos tericos (N) involucrados en la elucin de un
analito determinado est dado por:

N = 16 (t
r
/w)
2
o N = 5,54 (t
r
/w
h
)
2

Donde w es la anchura de la base de cada pico, w
h
la anchura del
pico medida a la mitad de su altura y t
r
el tiempo de retencin.

El nmero N puede, dentro de ciertos lmites, ser aumentado alargando
la columna, pero tambin aumentan el tiempo de retencin y el ancho
del pico.
Efecto del nmero de platos tericos en la distribucin de un soluto.
Mientras mayor sea N, (y menor H) ms angosto ser el pico del analito.
PROCESOS QUE TIENDEN A AUMENTAR LA ANCHURA DEL
PICO DE ELUCION DE UN ANALITO
-Tiempo requerido para aplicar la muestra a la columna.

- Difusin longitudinal. El analito tiende a difundir de zonas de alta
concentracin a aquellas de baja concentracin.

- Caminos mltiples. El empaque de la columna es aleatorio y esto
genera muchos caminos entre las partculas para el analito y la fase
mvil.

-Tiempo requerido para el equilibrio entre las dos fases. Mientras
ms pequeas las partculas de la fase estacionaria, ms rpido es
el equilibrio y menor la tendencia a la difusin.
El xito de un sistema cromatogrfico determinado se evala por su
capacidad de resolucin y depende de los siguientes parmetros:

- Selectividad. Capacidad del sistema de discriminar entre
compuestos relacionados estructuralmente. Se refleja en los valores
de K
d
. Depende de la naturaleza qumica de las fases fijas y mvil.
Alta selectividad muestra la cromatografa de afinidad.

- Eficiencia. Es una medida de los efectos de difusin que producen
picos ms anchos y que se sobreponen. Importante el empaque de la
columna.

- Capacidad. Es un ndice de la cantidad de material que puede ser
resuelto sin sobreposicin de picos. La cromatografa de intercambio
inico y el cromatoenfoque son de alta capacidad.
CLASIFICACION DE LA CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE
ACUERDO A LA PRESION GENERADA DENTRO DE
LA COLUMNA
Cromatografa de baja presin: presiones menores a 5 bar (0,5 MPa,
5,1 Atm).

Cromatografa de presin media: genera presiones entre 6 y 50 bar.
(FPLC ~20 - 50 bar)

Cromatografa de alta presin: presiones sobre 50 bar. Denominada
tambin HPLC.
Cromatografa lquida de alto rendimiento
La capacidad de resolucin de una columna cromatogrfica aumenta
con el nmero de platos tericos y stos con el largo de la columna
(dentro de ciertos lmites, por la tendencia al ensanchamiento de los
picos).

El nmero de platos tericos est asociado al rea de las partculas de
la fase fija (mientras ms pequeas, mejor la resolucin pues se reduce
el tiempo de equilibrio entre fase fija y mvil).

Al achicarse las partculas, aumenta la resistencia al flujo, y esto obliga
a aplicar altas presiones.
COMPONENTES DE UN EQUIPO DE HPLC
Columnas: se las fabrica de acero inoxidable para que resistan presiones
de hasta 55 MPa (550 bar).

Matrices (fases estacionarias): partculas esfricas de tamao
uniforme para minimizar difusin. Tres tipos:
Microporo, microporos que se ramifican en toda la partcula.
Pelicular (porosa superficial); partculas porosas que cubren
un slido inerte.
Fases unidas La fase estacionaria estqumicamente ligada a
un soporte inerte como slice.

Fase mvil: solventes de alta pureza, que deben ser desgasificados.

Bombas: deben operar hasta 55 MPa, sin generar pulsos

COMPONENTES DE UN EQUIPO DE HPLC (Continuacin)
Detectores: deben ser muy sensibles (poca muestra) y estables.

Longitud de onda variable. Son espectrofotmetros de luz
ultravioleta y visible con celdas de flujo continuo.
Arreglo de diodos. Permiten detectar el espectro completo.
Fluorescentes. Alta sensibilidad. Pocos analitos fluorescentes.
Indice de refraccin. Sensibilidad limitada pero responden a
cualquier analito.
Espectrmetro de masas. Deteccin y determinacin simultnea
de la estructura del analito.
Electroqumicos. Muy sensibles. Utiles en la deteccin de analitos
que pueden ser oxidados o reducidos. Dos electrodos, uno de referencia y
el otro de trabajo, al que se aplica un potencial constante. Al fluir un
analito, ste se reduce u oxida, pasando una corriente entre ambos
electrodos, la que es registrada.