Ana Mara Romano LU: 14.

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Comisin 14 Da Viernes 11 hs
Trabaja Prctico N2: Colorantes y
Coloraciones: Fundamntacin d! M"todo
d #ram$
Antes de comenzar a explicar el mtodo de Gram propiamente dicho, hagamos
una breve alusin a la constitucin de la pared celular de las clulas
bacterianas:
Pard C!u!ar
Es la estructura ms rgia y e!terna en la mayora e las "acterias. En estao
natural# son incoloras. $ram ie% una t&cnica e coloraci%n 'ue (ermite
istinguir os gru(os e "acterias# $ram )*+ y $ram ),+.
El es'ueleto e la (are est -ormao (or un com(le.o e (olisacrios#
(e(tioglucano o murena. Este com(le.o re(resenta una re -ormaa (or
caenas e /,acetil murmico )/01+ y /,acetil glucosamina )/0$+#
entrela2aas (or aminocios y caenas laterales tetra(e(ticas.
Los amino a23cares /,acetil murmico y /,acetil glucosamina# se unen (or
enlaces glucosicos 4 )1,4+ y los aminocios se unen a la caena el /, acetil
murmico. 5or lo general son e 4 a 6 aminocios. Esta unia estructural se
re(ite e 70 a 80 9eces -ormano la estructura e murena y constituyeno la
:"ra el (e(etioglucano# las :"ras se unen -ormano la re triimensional.
Pard C!u!ar d %actrias #ram &'(
;e o"ser9a una ca(a gruesa y o(aca a los electrones# -ormaa (or el
(e(tioglucano# .unto con os clases e cios tecoicos. Entre ellos el cio
li(oteicoico )generalmente glicerol -os-ato+# se encuentra unio a la mem"rana
cito(lasmtica y atra9esano la ca(a e (e(tioglucanos hacia el e!terior e
la c&lula. < el cio tecoico (ro(iamente icho )glicerol -os-ato y ri"itol -os-ato+#
'ue se encuentra tam"i&n en la su(er:cie y 'ue solo se une al
(e(tioglucano. 0m"os son los res(onsa"les e la carga negati9a e la (are#
e all la -acilia con la 'ue se unen al iente y a la mucosa (roucieno la
agregaci%n "acteriana.
E!isten en2imas# como la (enicilina 'ue rom(en las uniones (e(ticas y la
liso2ima a las uniones (olisacrios. Cuano esto sucee# las "acterias $ram
(ositi9as se enominan cromo(lastos.
Pard C!u!ar d %actrias #ram &)(
=iene una ca(a elgaa e (e(tioglican o )mureina+ unia a una mem"rana
e!terior (or li(o(rotenas. La mem"rana e!terior est hecha e (rotena#
-os-ol(io y li(o(olisacrio. En el li(o(olisacrio# la (orci%n e l(io est
em"e"ia en el -os-ol(io y el antgeno > (olisacrio est en la su(er:cie. El
l(io se llama L(io 0 y es t%!ico# (ero el li(o(olisacrio entero se llama
Enoto!ina. La (are e la c&lula tiene (oros llamao 5orines (ara el
trans(orte e su"stancias e (eso molecular "a.o. Entre la mem"rana
cito(lsmica y la (are celular hay un es(acio (eri(lsmico con en2imas
hirolticas# en2imas inacti9aoras e anti"i%ticos y (rotenas e trans(orte
Co!oracin d #ram
Es la tinci%n com(uesta# (ost,9ital y i-erencial ms im(ortante y ms
utili2aa# 'ue (ermite o"ser9ar y clasi:car mor-ol%gicamente a las "acterias.
De acuero al color 'ue o"tienen estas luego e la coloraci%n# se i-erencian
en $ram )*+ y $ram ),+ en -unci%n e las caractersticas estructurales e la
(are "acteriana:
, Gram (+): ca(a gruesa e murena# se ti?en e 9ioleta.
, Gram (-): ca(a :na e murena y mem"rana e!terna# se ti?en e rosao.
M"todo
5ara reali2ar la coloraci%n e $ram necesitaremos e los siguientes
instrumentos:
Lminas (ortao".etos
;oluci%n salina est&ril
Culti9o e una ce(a (re9iamente sem"raa
@iso(o
1echero
Pr*aracin d! +,tndido
;o"re un (ortao".etos e 9irio# lim(io y seco# se coloca una gota el material
'ue se 9a a te?ir )si es l'uio+ o se hace roar el hiso(o con 'ue se tom% la
muestra. Una 9e2 'ue el hiso(o ha tocao la su(er:cie el (ortao".etos# 'ue no
est est&ril# ya no (uee ser em(leao (ara inocular los meios e culti9o.
5uee usarse una agu.a est&ril (ara trans-erir una (e'ue?a cantia e un
culti9o "acteriano a la su(er:cie el (ortao".etos. Este material es sus(enio
en una gota e agua o soluci%n salina (re9iamente colocaa so"re el
(ortao".etos y se lo -rota irectamente so"re el (ortao".etos# one (uee
9isuali2arse con -acilia. El material colocao en el (ortao".etos se e.a secar
al aire o "ien se (asa 9arias 9eces (or la 2ona a2ul e la llama e un mechero
e Aunsen hasta 'ue el 9irio est& tan caliente 'ue moleste al tacto (ero no
'ueme
Co!oracin Pro*iamnt -ic.a
1. ;e ti?e la muestra con B9ioleta e genciana "sicaC urante os
minutos.
7. La9amos con a"unante agua.
D. 0(licamos el reacti9o BlugolC# 'ue es una soluci%n e yoo,youro
(otsico# urante os minutos. Este es una sustancia moriente 'ue
tiene yoo# (or lo tanto# -orma el com(le.o colorante,yoo
4. ;e ecolora con Balcohol,acetonaC urante unos 'uince segunos. ;e
inclina el (orta o".etos y se e.a gotear el Balcohol,acetonaC hasta 'ue
el (re(arao e.e e (erer color
6. La9amos nue9amente con agua.
6. ;e ti?e la muestra con B-ucsina rosa "sicaC# 'ue es un colorante e
contraste# urante un minuto.
E. La9amos con a"unante agua.
8. De.ar secar el (re(arao al aire.
F. Una 9e2 seco# se coloca una gota e aceite e cero a la muestra (ara
(oer o"ser9ar al microsco(io.
Fundamnto
0l reali2ar los tres (rimeros (asos# toas las "acterias se o"ser9an e color
9ioleta# ya 'ue al te?ir con B9ioleta e genciana "sicaC urante os minutos#
el colorante atra9iesa la (are celular e las "acterias y llega al interior (ara
as mani-estarse. Lo mismo sucee al agregar el moriente# BlugolC# ya 'ue
tam"i&n atra9iesa la (are "acteriana y -orma un com(le.o con el colorante.
Es en el cuarto (aso# 'ue al ecolorar la (re(araci%n con Balcohol,acetonaC# en
el cual se solu"ili2a el com(le.o colorante# o"ser9amos la i-erencia e
resultaos: las "acterias $ram )*+ no se ecoloran )(ermanecen te?ias e
9ioleta+# mientras 'ue las $ram ),+ si lo hacen )se ti?en e color rosao+. La
i-erencia esencial est (or tanto en su resistencia a la ecoloraci%n.
, Las "acterias $ram )*+ se eshiratan y la murena cierra sus (oros#
'ueano retenio el com(le.o colorante,lugol e"io a 'ue la ca(a e
murena es muy gruesa
, En las "acterias $ram ),+ el alcohol,acetona# 'ue es un sol9ente li(ico#
atra9iesa la (are "acteriana (or'ue isuel9e la mem"rana e!terna#
a"re los (oros e la misma y isuel9e el com(le.o colorante,lugol
(ermitieno la salia el colorante. De este moo 'uean es(ro9istas
e color y al agregar B-ucsina rosa "sicaC se ti?en e rosao.