Fundamentos Analisis Cromatografico

1
INTRODUCCI INTRODUCCI N A LA HPLC N A LA HPLC

Dr. JOS ANTONIO FERNNDEZ LPEZ
Depto. Ingeniera Qumica
Grupo de Investigacin QUIMYTEC
UPCT
FUNDAMENTOS DEL ANALISIS
CROMATOGRAFICO.
Cromatografa Lquida de
Alta Resolucin
2 2
Cromatografa = escribir en colores
Elementos que participan en una
cromatografa
1. Fase estacionaria
2. Fase mvil
3. Muestra
Cmo interaccionan?
En general, una cromatografa se realiza
permitiendo que la mezcla de molculas que se
desea separar (muestra) interaccione con un
medio o matriz de soporte que se denomina fase
estacionaria. Un segundo medio (la fase mvil)
que es inmiscible con la fase estacionaria se hace
fluir a travs de sta para "lavar" (eluir) a las
molculas en la muestra.
3 3
Inicialmente se refera a:
High Pressure Liquid Chromatography
En la actualidad hace referencia a:
High Performance Liquid Chromatography
La alta presin permite usar relleno de tamao de partcula reducido
para lograr la separacin de componentes a flujos razonables.
2
4 4
fase mvil
(Lquido)
bombasquepermitenpresionesdehasta6000psi (414
atm) hacen pasar la fase mvil por el interior de
columnas de acero (2-5 mmx 3-25 cm) que contienen
lafaseestacionariaconflujosde0,110ml/min.
HPLC = high performance liquid chromatography
cromatografa lquida de alta resolucin
Otras acepciones equivalentes:
high pressure liquid chromatography
high patient liquid chromatography
high priced liquid chromatography
5 5
Las muestras no necesitan ser vaporizadas para
su anlisis. Cualquier sustancia puede ser
potencialmente analizada por esta tcnica.
El desarrollo instrumental es posterior al de la CG
debido a dificultades para lograr un flujo estable
en el eluyente.
6 6
Una muestra en estado lquido es arrastrada por una
corriente lquida llamada eluyente.
Como fase estacionaria acta un slido finamente
dividido (dimetro de partcula 3, 5, 10 m), o una
pelcula lquida a l adherida.
Dependiendo de la retencin de los componentes de la
muestra por la fase estacionaria y de su solubilidad en
el eluyente se provocar su migracin diferencial.
3
7 7
Caractersticas:
Selectividad
Reproducibilidad
Sensibilidad
Rapidez
Parmetros:
Naturaleza de la fase estacionaria
Tamao de partcula
Eluyente (composicin y flujo)
Detector
Fase Directa:
fase estacionaria polar
fase mvil de baja polaridad
Fase Reversa:
fase estacionaria de polaridad baja
fase mvil de polaridad alta
8 8
Principales mecanismos de interaccin en
cromatografa lquida:
Adsorcin superficial
Particin
Intercambio inico
Exclusin molecular
9 9
La fase estacionaria es slida. La separacin se logra
por las diferencias en solubilidad (en fase mvil) y de
retencin por adsorcin (en fase estacionaria) de la
mezcla de solutos.
CROMATOGRAF A DE ADSORCI N
4
10 10
Slica (90%) y almina (10%) son las fases estacionarias
ms comunes.
Tanto las molculas de solutos como de disolvente son
atradas hacia los lugares activos polares de la fase
estacionaria.
Unos solutos sern ms atrados que otros por la fase
estacionaria y as se lograr su migracin diferencial.
Se usan mezclas de disolventes para conseguir el poder
de elucin y la selectividad adecuadas. Normalmente un
disolvente apolar (n-hexano) unido a otro ms activo
(acetona, cloruro de metilo, etc.).
CROMATOGRAF A DE ADSORCI N
11 11
La separacin se basa en el reparto o distribucin de
los solutos entre una fase mvil lquida y otra
estacionaria inmiscible, soportada sobre un slido
inerte. La discriminacin se produce por diferencias de
solubilidad.
CROMATOGRAF A DE PARTI CI N
12 12
El mecanismo de actuacin es similar al de un modelo de
extraccin en contracorriente.
Las especies ms retenidas sern las que presenten
mayor afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que
por la fase mvil (eluyente).
La separacin de los solutos se basa en las diferencias en
esta solubilidad relativa.
5
13 13
Existen dos modos bsicos de operacin:
Fase normal. Cuando se trabaja con fase estacionaria polar
y fase mvil no polar.
Fase reversa. Cuando se emplea una fase estacionaria no
polar y fase mvil polar.
Inicialmente tuvo ms auge la fase normal pero en la
actualidad son ms comunes los mtodos cromato-
grficos en fase reversa dada la naturaleza hidroflica de
las muestras de mayor inters (clnico, contaminacin,
alimentos).
14 14
Segn empleemos fase directa o fase reversa se nos
va a alterar el orden de elucin de bandas y el
tiempo de anlisis.
15 15
90 5 Spherisorb
A5W
Almina
600 5, 10, 20 Spherosil Slice
400 5, 10, 20 Partisil Slice
25 10 Lichrospher
100
Slice
200 5-7 Hypersil Slice
Area especfica
(m
2
/g)
Tamao
partcula (m)
Nombre
comercial
Tipo
Materiales comerciales empleados como soportes
en cromatografa de adsorcin y particin.
6
16 16
CROMATOGRAF A DE PARTI CI N Y ADSORCI N
Bondpak-Phenyl -C
6
H
5
Fase Reversa
Nucleosil-C8, Lichrosorb RP8, -C
8
H
17
Fase Reversa
Nucleosil-C18, Lichrosorb RP18,
Spherisorb ODS2,
-C
18
H
37
Fase Reversa
Nucleosil-NH
2
, Lichrosorb-NH
2
,
Bondpak-NH
2
,
-(CH
2
)
n
-NH
2
Fase Directa
Nucleosil-CN, Micropak-CN, -(CH
2
)
3
-CN Fase Directa
Nucleosil, Kromasil,
Inertsil, Partisil,
Slica Fase Directa
Nombre comercial - R Mecanismo
Principales fases estacionarias en HPLC
17 17
Tanto fase estacionaria como fase mvil son de
naturaleza inica. La iones de la fase estacionaria son
de carga opuesta a los del eluyente.
CROMATOGRAF A DE I NTERCAMBI O I NI CO
R
A
+
+ B
+
R
B
+
+ A
+
R
+
A
+ B
R
+
B
+ A
18 18
7
19 19
Se emplea para el anlisis de todo tipo de iones
(inorgnicos y orgnicos).
Las molculas intercambiadoras se ligan a soportes
especficos.
El material intercambiador de la fase estacionaria es de
dimetro de partcula pequeo (1-10 m) y estructura
microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy
baja respecto al material intercambiador convencional
(10
-2
10
-3
meq/g).
20 20
Separacin de aniones inorgnicos por
cromatografa de intercambio inico.
21 21
La separacin se basa en el tamao molecular. Como
fase estacionaria se emplean sustancias de tamao
de poro determinado. Tambin se denomina
cromatografa de permeabilidad por gel (GPC).
CROMATOGRAF A DE EXCLUSI N MOLECULAR
8
22 22
Como fase estacionaria se emplea un material poroso
inerte (gel) que permite la discriminacin entre los
solutos segn su tamao.
Los analitos de mayor tamao no pueden penetrar en los
poros de la fase estacionaria y son excluidos, viajando
con la fase mvil en el frente de la misma.
Se muestra especialmente til para determinar el rango
molecular de polmeros, protenas, etc.
23 23
Separacin de polmeros de poliestireno por GPC.
24 24
EL EXPERI MENTO CROMATOGRFI CO
Ilustracin de un experimento por HPLC.
9
25 25
EL EXPERI MENTO CROMATOGRFI CO
Parmetros de un cromatograma.
26 26
MAGNI TUDES CROMATOGRFI CAS
MAGNITUD SMBOLO
Tiempo de retencin de
una sustancia no retenida
seg.
t
M
Tiempo de retencin seg.
t
R
Tiempo de retencin
reducido
seg.
t
R
= t
R
t
M
Retencin relativa --
=t
R2
/ t
R1
Amplitud de bandas a
media altura
seg. W
Relacin de capacidad --
k= t
R
/t
M
Resolucin -- R
S
=2[(t
R2
- t
R1
) / (w
2
+w
1
)]
27 27
Equipo bsico para HPLC.
EQUI PO
10
28 28
Alta pureza (calidad HPLC).
Inactividad frente a la fase estacionaria.
Baja viscosidad.
Compatibles con la muestra.
Facilitar la recuperacin de la muestra.
Compatibilidad con el sistema de deteccin.
Segn su composicin vare o no con el tiempo:
Elucin isocrtica
Elucin en gradiente
FASE MVI L
29 29
Los disolventes deben desgasificarse antes de uso
empleo en HPLC.
La desgasificacin reduce el riesgo de formacin de
burbujas en la columna o en el detector.
Posibilidades:
Desplazamiento con un gas menos soluble (He)
Aplicacin de vaco
Sonicacin
Calentamiento
FASE MVI L
30 30
Presin estable hasta 5000 psi
(400 atm) 1 atm= 14,696 psi
Flujo libre de pulsaciones
Amplio rango de flujos (0,1 a
10 mL/min)
Control, exactitud y repro-
ducibilidad del flujo
Componentes qumicamente
inertes y resistentes a la
corrosin
BOMBAS
11
31 31
Se emplean vlvulas inyectoras de volumen (loop) constante
Pueden ser manuales o automticas
Para variar el volumen de inyeccin se debe cambiar el
loop correspondiente
Se debe evitar la entrada de burbujas en el sistema de
inyeccin
SI STEMAS DE I NYECCI N
32 32
Se trata de una pequea columna (0,5 3 cm) colocada
entre el inyector y la columna
Ayuda a prevenir la entrada de suciedad, procedente de la
muestra o del eluyente, en la columna analtica
Va a permitir alargar la duracin de las columnas
Debe ser del mismo relleno que el de la columna analtica
PRECOLUMNAS
33 33
Gran avance en la ltima
dcada por el progreso en
la tecnologa de rellenos y
columnas
Rellenos ms uniformes y
de menor tamao
Fases qumicamente liga-
das a los soportes
aumentando su eficacia y
resolucin
Mejora en los mtodos de
empaquetado
COLUMNAS
12
34 34
Al disminuir el tamao del relleno aumenta la
eficiencia pero tambin la presin de trabajo
Las columnas constan de:
Cuerpo normalmente de acero inoxidable
Relleno material con i.d. definido
Algunas casas comerciales permiten la
renovacin del relleno sin tener que comprar
la columna completa
Existen columnas de compresin radial, cuyo
cuerpo puede ser presurizado para aumentar
su eficiencia
COLUMNAS
35 35
Fase Normal
Slica
Almina
Amino (-NH
2
)
Ciano (-CN)
Diol (glicidoxi-etilmetoxisilano)
Fase Reversa
C-2 o RP-2 (-SiCH
2
CH
3
)
C-8 o RP-8 (-Si-(CH
2
)
7
-CH
3
)
C-18 o RP-18 (Si-(CH
2
)
17
-CH
3
)
COLUMNAS
36 36
COLUMNAS
13
37 37
COLUMNAS
Influencia de la longitud de la columna y del tamao de
partcula en la duracin del cromatograma
38 38
Ventajas de la High Speed HPLC con columnas cortas
Tiempo de anlisis reducido
Menor consumo de disolventes
Menor dispersin de los solutos a analizar
Ahorro de costes
Mayor sensibilidad
COLUMNAS
39 39
Cualquier propiedad fsica o qumica
que se pueda medir en la disolucin
podra usarse como mtodo de
deteccin
Los detectores en HPLC no son
destructivos
Se pueden clasificar en:
Detectores que miden una
propiedad de la fase mvil
Detectores que miden una
propiedad de los solutos
DETECTORES
Rapidez
Reproducibilidad
Sensibilidad
Linealidad
Estabilidad
14
40 40
INTRODUCCIN A LA HPLC
Principales detectores empleados en HPLC:
UV/Vis
Fotodiodos
ndice de refraccin
Fluorescencia
Conductividad
Dispersin de luz
Espectrometra de masas
DETECTOR
41 41
0,1 1 ng
0,5 1
0,001 0,01 ng
0,1 1 ng
100 1000 ng
0,1 1 ng
Lmite deteccin
S Espectrometra de masas
No Conductividad
S Fluoresecencia
S Dispersin de luz
No ndice de refraccin
S UV/VIS
Permite
Gradiente
Detector
DETECTOR
Comparacin de detectores usados en HPLC
42 42
DETECTOR UV/ VI S
Para sustancias que absorben radiacin UV/VIS
El ms usado
Con lmparas de deuterio, xenon o wolframio
Desde 190 a 900 nm
Camino ptico de la microcelda de un detector
UV/VIS. Las celdas ordinarias tienen 0,5 cmde
camino ptico y contienen 8 L de lquido
15
43 43 284 nm Tolueno
212 nm Tetrahidrofurano
205 nm Metanol
195 nm n-Hexano
215 nm ter Dietlico
245 nm Cloroformo
190 nm Agua
190 nm Acetonitrilo
330 nm Acetona
Longitud de onda Disolvente
DETECTOR UV/ VI S
Longitudes de onda de corte en el UV de disolventes
usados en HPLC
44 44
DETECTOR FOTODI ODOS
Permite registrar la absorbancia simultnea en todo el
rango UV/VIS.
La muestra es atravesada por luz blanca (todas las ) y el
policromador dispersa la luz en las diversas que la
componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos. En cada
diodo incide una diferente, que manda la informacin al
sistema de anlisis de datos.
45 45
Posibilidades de un
detector de fotodiodos.
-0,05
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
0,60
AU
0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00
Minutes
250,00
300,00
350,00
DETECTOR FOTODI ODOS
n
m
220,00
240,00
260,00
280,00
300,00
Minutes
1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
A
U
0,00
0,20
0,40
0,60
Minutes
1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
C
a
fe
n
a
- 5
,3
5
7
16
46 46
Van a medir variaciones en el ndice de refraccin del
eluato con respecto al del disolvente puro.
Slo se pueden usar si la elucin es isocrtica.
Responden casi todos los solutos pero con escasa baja
sensibilidad.
Son muy sensibles a las variaciones de temperatura.
Deben estar termostatizados.
DETECTOR DE NDI CE DE REFRACCI N
47 47
Para analitos fluorescentes por naturaleza o derivados
fluorescentes.
Se seleccionar la
exc
y la
em
.
Son de alta sensibilidad.
No se ven interferidos por los disolventes al no tener
stos naturaleza fluorescente.
DETECTOR DE FLUORESCENCI A
48 48
Son detectores basados en una respuesta diferencial y
no absoluta.
Empleados fundamentalmente en cromatografa de
intercambio inico.
Inconvenientes:
Baja sensibilidad
Sensibles a impurezas de la fase mvil.
DETECTOR DE CONDUCTI VI DAD
17
49 49
Vlido para aquellos solutos que
sean claramente menos voltiles
que la fase mvil.
El eluyente es evaporado con una
corriente de N
2
dejando una nube
de finas partculas slidas que
entran en la zona de deteccin.
Las partculas se detectan por la
luz que procede de un diodo lser
y llega al fotodetector por
dispersin.
Slo tampones voltiles en la fase
mvil.
DETECTOR DE DI SPERSI N DE LUZ
50 50
APLI CACI ONES
51 51
APLI CACI ONES
18
52 52
APLI CACI ONES

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