Tema 10

Introduccin a los Mtodos Cromatogrficos 2
Tema 10

INTRODUCCION A LOS METODOS CROMATOGRAFICOS

Los mtodos que se utilizan en anlisis qumico presentan una selectividad ms o
menos alta, si bien, existen muy pocos que sean verdaderamente especficos. Por ello,
en muchas ocasiones, la separacin del analito de las posibles sustancias interferentes
suele ser una etapa fundamental en los procedimientos analticos. Sin duda, la
Cromatografa es uno de los mtodos de separacin ms poderosos que se hayan
descubierto. Fue desarrollada originalmente por el botnico ruso M. S. Tswett como
tcnica para la separacin de pigmentos vegetales coloreados, y la I.U.P.A.C.
*
la define
como:
"Un mtodo utilizado inicialmente para la separacin de los componentes de una
muestra en la cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de las
cuales es estacionaria, mientras que la otra se mueve. La fase estac onar a
puede ser un slido, un lquido sobre un soporte slido, o un gel. La fase
estacionaria puede estar contenida en una columna, extendida en forma de
capa o dispuesta en forma de pelcula . La fase mvil puede ser gaseosa o
lquida".
i i

El trmino "cromatografa" posiblemente derive de las palabras griegas "chroma"
(color) y "graphein" (escribir), aludiendo a que los pigmentos vegetales separados se
ponen claramente de manifiesto como bandas coloreadas. Sin embargo, el mismo
Tswett indica que tambin pueden separarse sustancias incoloras por el mismo
procedimiento.
Cuando se utiliza una columna rellena de CaCO
3
(figura 10.1.a.), en la que se
introduce un extracto de hojas verdes en ter de petrleo, y seguidamente se aade
disolvente puro (eluyente) es posible la separacin de clorofila, carotenos y
xantofilas.
En estas separaciones, la fase estacionaria es el relleno (CaCO
3
), la fase mvil
es el ter de petrleo y los componentes a separar, los distintos pigmentos vegetales,
los cuales se encuentran sometidos a dos fuerzas contrarias: el disolvente tiende a
arrastrarlos hacia la salida y el CaCO
3
a retenerlos. Como este ltimo efecto es

*
I.U.P.A.C. "Compendium of Analytical Nomenclature". Pergamon Press. Oxford (1977).
Claudio Gonzlez Prez 3

diferente para los distintos pigmentos, stos se mueven a diferente velocidad y
emergen de la columna a distintos tiempos (figura 10.1.b.c.d.)
disolvente puro (eluyente)
extracto de hojas verdes en ter de petrleo
CaCO
3
eluato
a b
c d
.

Figura 10.1. Separacin hipottica de tres componentes de una mezcla por cromatografa en columna.

Cuando se mide la concentracin de cada componente a la salida de la columna y
se representa en funcin del volumen de fase mvil, o del tiempo transcurrido desde
la introduccin de la muestra, se obtiene una grfica como la representada en la
figura 10.2., denominada "cromatograma"
*
.
R
volumen o tiempo

Figura 10.2. Cromatograma de la mezcla de tres componentes de la figura 10.1.

*
Aunque es posible recoger distintas fracciones de fase mvil que sale de la columna y determinar en cada
una de ellas la concentracin de soluto, normalmente el efluente se monitoriza continuamente con un
detector que mide alguna propiedad fsica o qumica del soluto o de la fase mvil.

La cromatografa es una tcnica cuyo campo de aplicacin se extiende a todas las
reas de la Qumica y de la Bioqumica. Asimismo, es importante en Biologa, Control
de Calidad, Investigacin, Anlisis, separaciones a escala preparativa y medidas
fisicoqumicas. Asimismo, puede aplicarse con el mismo xito tanto a escala micro
como macro, siendo posible su utilizacin industrial para la separacin de los
componentes en los ms diversos materiales: azcares, tierras raras, productos
farmacuticos, etc.

CLASIFICACION DE LOS METODOS CROMATOGRAFICOS
Los mtodos cromatogrficos pueden clasificarse atendiendo a distintos
factores: estado fsico de las fases mvil y estacionaria (gas-lquido, lquido-lquido,
etc), soporte utilizado (columna, papel, etc), mecanismo de la separacin (adsorcin,
reparto), e incluso el tipo de soluto (cromatografa inica, cromatografa de protenas,
etc). En el cuadro de la figura 10.3. se muestra una clasificacin en funcin de algunos
parmetros mencionados anteriormente.

1. Cuando se utiliza como fase mvil un fluido a presin y temperatura superiores a la crtica se tiene un tipo
de cromatografa denominada de fluido supercrtico.
2. Adems de los mecanismos mencionados existen otros tales como: fase enlazada, interaccin inica,
afinidad, quelacin.
3. El mecanismo es de adsorcin cuando la fase mvil en un lquido polar.
4. El mecanismo puede ser de reparto cuando la fase mvil es un lquido no polar
Figura 10.3. Clasificacin de los mtodos cromatogrficos

Segn la naturaleza de la fase mvil, los mtodos cromatogrficos se clasifican
en dos grupos: cromatografa lquida y cromatografa de gases (adems de la
mencionada en el pie de la figura 10.3. de fluidos supercrticos), segn que la fase
mvil sea un lquido o un gas respectivamente.
En cromatografa lquida, cuando la fase estacionaria es polar y la fase mvil no-
polar, se denominan sistemas normales, o de fase normal. En estos sistemas, la
retencin del soluto se incrementa generalmente con su polaridad. Por otra parte, si la
fase estacionaria es menos polar que la fase mvil, el sistema se designa como de fase
inversa, y en stos, las especies polares tienen poca afinidad por la fase estacionaria,
siendo eluidos ms fcilmente.
En cuanto al soporte, o la tcnica utilizada para desarrollar el cromatograma,
pueden distinguirse dos categoras: plana y en columna. En cromatografa plana, la
fase estacionaria puede estar constituida por una hoja de papel (cromatografa en
papel) o por una capa de un slido distribuido uniformemente sobre una lmina de
vidrio, plstico o aluminio (cromatografa de capa fina). Por otra parte, la fase
estacionaria puede estar contenida en una columna, en cuyo caso la tcnica se
denomina cromatografa en columna. Cuando la fase estacionaria es un lquido, ste
debe inmovilizarse sobre un soporte slido inerte, o sobre la propia columna.
Evidentemente, la cromatografa plana est limitada al uso de fase mvil lquida,
debido a las dificultades inherentes para confinar un gas o un fluido supercrtico en
una superficie plana. Sin embargo, la cromatografa en columna puede utilizarse en las
modalidades de lquidos, gases y fluidos supercrticos.
En el caso de la cromatografa lquida en columna existen dos modalidades, que
pueden denominarse en funcin de su desarrollo cronolgico como cromatografa
clsica en columna y cromatografa de alta resolucin (CLAR o HPLC)
*

Columnas cromatogrficas
Las columnas convencionales usadas en cromatografa lquida y de gases tienen
dimetros relativamente grandes: 2-4 mm en CG y 4-6 mm en HPLC. Estas columnas
contienen la fase estacionaria empacada, consistente en un slido o un lquido voltil
recubriendo a un soporte slido inerte.
Desde 1957 se han venido desarrollando distintos tipos de columnas capilares
(tambin denominadas columnas tubulares abiertas) utilizadas inicialmente en CG y

*
Las siglas HPLC corresponden a las iniciales de la denominacin en ingls High Performance Liquid
Chromatography.

extendindose posteriormente a CL e incluso a cromatografa de fluidos supercrticos.
Estas columnas son mucho ms estrechas y mucho ms largas que las columnas
empacadas. En ellas, la fase estacionaria slida est constituida por una capa porosa
(figura 10.4.a) y la fase estacionaria lquida puede estar recubriendo directamente la
pared interna de la columna (figura 10.4.b.), o sobre un soporte slido (figura 10.4.c.).
a
b
c
soporte slido recubierto
con fase estacionaria lquida
fase estacionaria slida
fase estacionaria lquida
pared de la columna

Figura 10.4. Columnas tubulares abiertas. a) de capa porosa. b) con pared recubierta. c) con soporte
recubierto.
Las columnas tubulares abiertas proporcionan mayor resolucin, requieren menor
tiempo para el anlisis y presentan mayor sensibilidad que las columnas empacadas, si
bien, se maneja una cantidad de muestra considerablemente menor y no son tiles
para separaciones preparativas en las que se trate de aislar cantidades relativamente
grandes de compuesto.

Mecanismo de las separaciones cromatogrficas
La naturaleza de las interacciones entre los distintos componentes de la muestra
y las dos fases, mvil y estacionaria, permite clasificar los sistemas cromatogrficos
desde este punto de vista, si bien, puede considerarse que la fase estacionaria es la
que gobierna el modo de separacin. Las fuerzas implicadas en estas interacciones
suelen ser dbiles, tales como fuerzas de Van der Waals o enlaces de hidrgeno.

La cromatografa de adsorcin se tiene cuando la fase estacionaria es un slido
adsorbente de gran rea superficial (gel de slice, almina, etc.). Los centros activos
situados sobre la superficie del slido (por ejemplo, los grupos silanol de la gel de
slice) interaccionan con los grupos funcionales polares de los compuestos a separar
(figura 10.5.a.). La separacin se produce como consecuencia de la distinta intensidad
de las mencionadas interacciones para unos y otros compuestos.

Las primitivas separaciones de Tswett corresponden a un mecanismo de
adsorcin. Actualmente an se utiliza la adsorcin en algunas separaciones por
cromatografa lquida en columna, si bien, su principal campo de aplicacin corresponde
a la cromatografa de capa fina. Por otra parte, las aplicaciones de la adsorcin en
cromatografa de gases se limitan fundamentalmente a separaciones donde los
analitos son gases permanentes.
Una caracterstica importante del adsorbente es el tamao de partcula. En
principio, la retencin es proporcional al rea superficial, la cual, a su vez, depende del
tamao de partcula y de la estructura interna de las partculas de adsorbente. Cuanto
menor sea el tamao de partcula, mayor ser el rea superficial del adsorbente y, en
consecuencia, mayor el nmero de centros activos disponibles para la adsorcin.

La cromatografa de reparto tiene lugar cuando se utiliza un lquido como fase
estacionaria. Para inmovilizar este lquido se utiliza un soporte slido (gel de slice,
celulosa, tierra de diatomeas, poli-estireno, etc.) de gran rea superficial.
En cromatografa lquido-lquido, para evitar que se mezclen las fases se utiliza
como fases mvil y estacionaria dos lquidos de polaridades muy diferentes. Si el
lquido estacionario es polar (por ejemplo, etilen-glicol), la fase mvil ser no polar
(por ejemplo, hexano). En este caso, los solutos polares son retenidos ms
fuertemente que los no polares. La forma citada es la de operacin normal, si bien
tambin puede operarse con una fase estacionaria no polar (por ejemplo, decano) y con
una fase mvil polar (por ejemplo, agua). Esta forma de proceder se denomina de fase
inversa. En cualquier caso, la separacin se produce porque las molculas de soluto se
distribuyen entre las dos fases segn su solubilidad relativa en cada una de ellas
*

(figura 10.5.b.).

En la cromatografa de intercambio inico, la fase estacionaria es una matriz
rgida, en cuya superficie existen grupos funcionales cargados positiva o
negativamente (A) y contra-iones de carga opuesta (M), susceptibles de
intercambiarse con iones de la misma carga contenidos en la fase mvil (figura 10.5.c.)
Intercambio catinico:
Matriz-A
M
+
+ X
+
> Matriz-A
X
+
+ M
+

*
Frecuentemente, en cromatografa lquido-lquido, la fase estacionaria est unida quimicamente al soporte
slido, en lugar de estar simplemente depositado sobre el. En este caso, se tiene la denominada
cromatografa de fase enlazada (bonded-phase chromatography, BPC). El mecanismo de las separaciones
por esta tcnica es complejo, si bien, parece que implica una combinacin de adsorcin y reparto,
dependiendo de las condiciones experimentales. En HPLC, la utilizacin de la BPC est muy generalizada.

Intercambio aninico:
Matriz-A
+
M
+ Y
> Matriz-A
+
Y
+M

La fase mvil suele ser una solucin acuosa tamponada y la separacin se produce
por la competencia que se establece entre los iones de la fase mvil y los iones del
analito por los centros activos de la resina. Este tipo de cromatografa se utiliza
ampliamente en qumica inorgnica para la separacin de iones metlicos, as como en
sistemas biolgicos para la separacin de compuestos inicos solubles en agua.
fase mvil
interfase
centros
activos
fase
estacionaria
slida
a) adsorcin
fase mvil
fase
estacionaria
lquida
soluto
b) reparto
fase mvil fase
estacionaria
slida
+
+
contrain
c) intercambio inico
grupo
funcional
fase mvil
fase
estacionaria
slida
d) exclusin
.
.

Figura 10.5. Representacin esquemtica de algunos mecanismos de separaciones cromatogrficas.
La cromatografa de exclusin tambin se denomina cromatografa de filtracin
en gel o cromatografa de permeacin en gel. En ella, la fase estacionaria consiste en
un slido inerte que contiene pequeos poros en los que pueden penetrar las molculas

de tamao reducido, pero no las grandes (figura 10.5.d.). El grado de retencin
depende del tamao de las molculas (solvatadas) y del tamao de los poros. Las
molculas pequeas pueden penetrar en los poros pequeos, mientras que las de
tamao intermedio pueden penetrar solo en algunos poros, siendo excluidas de los
otros, y las molculas grandes son excluidas completamente, Estas ltimas se
desplazan con la fase estacionaria y son eluidas en primer lugar. Este tipo de
cromatografa resulta especialmente adecuada para la separacin de especies
orgnicas de peso molecular elevado de otras molculas pequeas
*
.

FUNDAMENTOS TEORICOS

Se presentan seguidamente los conceptos en los que se basan las separaciones
cromatogrficas y aquellos parmetros que son de utilidad para comprender y mejorar
la calidad de los cromatogramas.

CONSTANTE DE DISTRIBUCION Y SEPARACIONES
Los componentes a separar, en su desplazamiento a lo largo del sistema
cromatogrfico se mueven a diferentes velocidades, dependiendo de la afinidad de
cada uno por la fase estacionaria, respecto a la fase mvil. Cada uno de ellos se
distribuye entre las dos fases segn un equilibrio caracterizado por una constante
denominada constante de distribucin o coeficiente de distribucin. Para el
componente A,
A
mvil
<> A
estacionaria

K
A
=
A
S
A
M

donde [A
S
] es la concentracin de A en la fase estacionaria, y [A
M
] la concentracin
de A en la fase mvil. Este modelo es anlogo al utilizado en sistemas de extraccin
simple, si bien, la cromatografa es un sistema dinmico en el que los procesos de

*
En el extremo opuesto a la cromatografa de exclusin puede situarse la denominada cromatografa de
afinidad. En sta, la fase estacionaria consiste en una especie bioactiva unida a un soporte slido. La
separacin se produce en funcin de la afinidad qumica entre los diferentes solutos y el lquido bioactivo. Se
utilizan interacciones altamente especficas, tales como las existentes entre un antgeno y un anticuerpo. El
compuesto activo es retenido por la fase estacionaria, siendo eluidos los dems. Posteriormente, un cambio
en el pH o en la composicin de la fase mvil origina la liberacin de la especie retenida, haciendo posible su
elucin.

separacin tienen lugar continuamente, con solutos movindose sobre la fase
estacionaria y tratando de alcanzar el equilibrio definido por K. En cualquier caso,
cuanto mayor sea el valor de K, mayor ser la afinidad del componente en cuestin
para la fase estacionaria y menor ser la velocidad a la que se mueve a travs del
sistema.
Para una muestra que contenga los componentes A, B y C, y que se introduzca
como una banda estrecha sobre una fase estacionaria, si
K
A
> K
B
> K
C

el componente A se desplazar a lo largo del sistema ms lentamente que el B, y ste
ms despacio que el C.
En cromatografa plana, los componentes A, B y C se ponen de manifiesto por la
presencia de manchas, mientras que en cromatografa de gases o en HPLC, donde
normalmente se utilizan mtodos instrumentales como detectores a la salida de la
columna en los que se monitoriza continuamente la composicin de la fase mvil, la
seal obtenida es proporcional a la cantidad de soluto presente en el eluyente, con lo
que se obtienen picos ms o menos Gaussianos, como los representados en la figura
10.7.(Los picos se ensanchan por una serie de causas que se considerarn
posteriormente).
A+B+C
COLUMNA DETECTOR
A
B
C
A
B C
A
B
C
.
.

Figura 10.7. Separacin cromatogrfica de una mezcla de tres compuestos.

RETENCION Y DISTRIBUCION
El cromatograma simplificado representado en la figura 10.8 corresponde a una
muestra que contiene un solo analito (A). El pico pequeo (B), corresponde a una
especie no retenida por la columna y que a menudo est contenida en la muestra, pero
que puede aadirse para facilitar la identificacin de los picos
*
. En la misma figura se
muestran algunos datos y smbolos caractersticos.

*
En cromatografa de gases con detector de conductividad trmica suele inyectarse, junto con la muestra,
unos micro-litros de aire,.

t
M:
tiempo muerto (tiempo requerido para que una especie no retenida alcance el detector)
V
M:
volumen muerto (volumen de fase mvil que se requiere para eluir una especie no
retenida)
t
R:
tiempo de retencin (tiempo transcurrido desde la introduccin de la muestra hasta
que el componente alcanza el detector)
V
R
: volumen de retencin (volumen de fase mvil que se requiere para eluir un soluto de la
columna cromatogrfica)
h: altura de pico; w: anchura de pico; w
1/2
: anchura de pico a la semialtura
w
0,1
: anchura de pico a un dcimo de la altura.
Figura 10.8. Cromatograma: parmetros caractersticos.
Anteriormente se ha indicado que la mayor o menor retencin de los
componentes de una muestra por la fase estacionaria depende de las correspondientes
afinidades. Estas, a su vez, dependen de diversos factores, entre los que cabe
mencionar:
* Interacciones electrostticas entre especies de carga opuesta, como las que tienen
lugar en separaciones por cromatografa inica.
* Interacciones por fuerzas de van der Waals del tipo dipolo-dipolo (orientacin) o del
tipo dipolo-dipolo inducido (induccin)
* Interacciones por fuerzas de dispersin entre molculas neutras o grupos funcionales.
* Formacin de enlaces de hidrgeno.

El tiempo de retencin puede considerarse que est constituido por dos
componentes. Uno de ellos es el ya mencionado tiempo muerto, que es el mismo para
todos los analitos en un sistema cromatogrfico determinado, y el otro es el
denominado tiempo de retencin ajustado, t'
R
, que es el tiempo que realmente se
invierte en la retencin de un soluto por la fase estacionaria, y que se define como
t'
R
= t
R
t
M

Las caractersticas de retencin de los componentes suelen describirse en la
prctica por el factor de retencin o factor de capacidad, k', definido como,
k
'
=
masadesoluto
S
masadesoluto
M
=
m
S
m
M

y relacionado con el coeficiente de distribucin y los volmenes de fase mvil y fase
estacionaria por:
K =
A
S
A
M
=
m
S
V
M
m
M
V
M
=
m
S
m
M
.
V
M
V
S
=k
'
V
M
V
S

donde V
M
y V
S
son los volmenes de fase mvil y estacionaria respectivamente. La
relacin V
M
/V
S
se denomina relacin de fases, , y es uno de los parmetros que se
utilizan para caracterizar una columna cromatogrfica, particularmente en
cromatografa de gases.

La medida directa de m
S
y m
M
suele ser difcil, por lo que la determinacin del
factor de retencin generalmente se lleva a cabo a partir de los tiempos de retencin,
parmetros fcilmente medibles en el cromatograma. Para ello, el factor de retencin
puede considerarse que es,
k
'
=
tiempodepermanenciadel solutoenlafaseestacionaria
tiempodepermanenciadel solutoenlafasemvil

o lo que es lo mismo
*
,
k
'
=
t
R
t
M
t
M

Como el volumen es proporcional al tiempo (V
R
= t
R
F, siendo F la velocidad de
flujo de fase mvil a travs de la columna y V
M
= t
M
F), cualquier relacin que se

*
La ecuacin k' = m
s
/m
M
representa la relacin entre la probabilidad de que una molcula de soluto
permanezca en la fase estacionaria y en la fase mvil y esta relacin de probabilidad es tambien igual a la
relacin entre el tiempo que en promedio una molcula de soluto permanece en la fase estacionaria y en la
fase mvil.

exprese como un cociente de tiempos puede escribirse como el cociente de los
volmenes correspondientes. Por ello,
k
'
=
t
R
t
M
t
M
=
V
R
V
M
V
M

El factor de capacidad es un parmetro importante porque es independiente de
la velocidad de flujo de la fase mvil y de las dimensiones de la columna, y puede
usarse para comparar retenciones en instrumentos diferentes.
Los factores de retencin grandes favorecen una buena separacin, pero tambin
incrementan el tiempo de elucin y el ancho de banda. Idealmente, las separaciones se
realizan en unas condiciones en las que los factores de capacidad para las especies de
una mezcla oscilan entre 1 y 5.

El volumen de retencin es un parmetro de utilidad en muchas ocasiones. De la
expresin anterior se deduce que,
V
R
= V
M
(1 + k')
y sustituyendo k' por K V
S
/V
M
, se tiene,
V
R
= V
M
(1 + K V
S
/V
M
)

V
R
= V
M
+ K V
S

que es una ecuacin importante en cromatografa, si bien, en cromatografa de
adsorcin debe modificarse de la forma siguiente:
V
R
= V
M
+ k
A
A
s

donde k
A
es el coeficiente de adsorcin y A
s
el rea superficial del adsorbente.
La capacidad de una determinada fase estacionaria para separar dos
componentes A y B se expresa mediante el factor de separacin o factor de
selectividad, , definido por:
=
k
B
'
k
A
'


y, por otra parte, puede determinarse fcilmente de forma directa midiendo los
tiempos de retencin de las especies A y B sobre un cromatograma experimental, ya
que,
=
t
R
B
t
M
t
R
A
t
M

EFICACIA DE LAS COLUMNAS CROMATOGRAFICAS
La observacin de los picos cromatogrficos muestra una gran semejanza con las
curvas de error normal o Gaussianas, lo cual puede explicarse de la forma siguiente:
durante el desplazamiento por el interior de una columna cromatogrfica, una
partcula individual de analito experimenta miles de transferencias entre las fases
mvil y estacionaria. El tiempo de residencia en una fase dada es muy irregular,
pudiendo ser muy pequeo en algunas etapas, y relativamente grande en otras. Por
ello, el tiempo de permanencia de la partcula en el interior de la columna tambin ser
irregular, ya que solamente se eluye cuando reside en la fase mvil; algunas partculas
se desplazarn rpidamente, debido a que permanecen ms tiempo en la fase mvil,
mientras que otras lo harn con mayor lentitud, como consecuencia de su mayor
permanencia accidental en la fase estacionaria.
Debido a que los procesos individuales mencionados transcurren de forma
aleatoria, se obtiene una dispersin de los tiempos de residencia en la columna (o de
las velocidades) alrededor de un valor medio, originndose un pico Gaussiano como el
representado en la figura 10.9., y en el que casi un 96 % del rea se encuentra dentro
del intervalo comprendido entre ms y menos dos veces la desviacin estndar
alrededor del mximo.
R
e
s
p
u
e
s
t
a

d
e
l

d
e
t
e
c
t
o
r
1/2 h
w
1/2
=2.35
w=4
Volumen

Figura 10.9. Pico cromatogrfico ideal.

Por otra parte, la anchura de los picos est directamente relacionada con el
tiempo de residencia en la columna (inversamente proporcional a la velocidad de flujo
de la fase mvil), ya que a mayor tiempo, mayor dispersin, de forma que las especies
eluidas al final presentan picos ms anchos que las eluidas al comienzo, como se
muestra en la figura 10.2.
El ensanchamiento de los picos de los distintos componentes del analito acta en
detrimento de la separacin, de forma que el objetivo en cromatografa es la
obtencin de picos estrechos y simtricos.
El trmino "eficacia" de una columna, o mejor, de un sistema cromatogrfico, se
utiliza para describir el ensanchamiento de las bandas de los solutos en su movimiento
a travs de la columna, papel o placa. Los tratamientos que normalmente se utilizan
estn relacionados con cromatografa en columna, si bien, pueden extenderse
fcilmente a la cromatografa plana.
El tema de la eficacia de un sistema cromatogrfico se aborda desde dos puntos
de vista: la teora de platos y la teora cintica, que se consideran brevemente a
continuacin.

Teora de los platos en Cromatografa
Se basa en considerar que la columna cromatogrfica es como si estuviera
constituida por numerosas, pero discretas capas estrechas, denominadas platos
tericos, en trminos anlogos a lo que ocurre en la teora de la destilacin
fraccionada o de la extraccin en contracorriente. Se considera que en cada plato se
establece un equilibrio del componente entre la fase mvil y la fase estacionaria, y el
desplazamiento del analito a travs de la columna se trata como una transferencia de
la fase mvil desde un plato al siguiente. La eficacia de la columna aumenta al hacerlo
el nmero de estas transferencias, esto es, al aumentar el nmero de platos tericos.
El nmero de platos tericos, N, se define como
N =
t
R
2

donde t
R
es el tiempo de retencin del analito y la desviacin estndar del pico
Gaussiano.
Como, w = 4 (figura 10.9.),
N = 16
t
R
w
2


expresin que permite obtener N midiendo directamente en el cromatograma.
En la prctica, es ms frecuente medir la anchura de pico a la semi-altura, w
1/2
,
en cuyo caso,
N =
t
R
w
1/2
2. 35
2
=5. 54
t
R
w
1/2
2

(En esta ecuacin, como en la anterior, pueden utilizarse volmenes de retencin,
en lugar de tiempos, en cuyo caso, el ancho se medir tambin en unidades de
volumen).
Es evidente que el nmero de platos tericos ser directamente proporcional a la
longitud de la columna, de forma que si esta se representa por L, la denominada altura
equivalente a un plato terico, (AEPT
*
H) ser:
H =
L
N

Es necesario indicar que las columnas se comportan a menudo como si tuvieran
distintos nmeros de platos para distintos solutos en una mezcla.
Los picos simtricos (Gaussianos) se originan cuando el coeficiente de
distribucin, K, (K=C
S
/C
M
), es constante e independiente de la cantidad de soluto. En
realidad, casi siempre se obtienen picos asimtricos, ya que la relacin C
S
/C
M
suele
variar con la cantidad de soluto, obtenindose isotermas (representacin grfica de
C
S
frente a C
M
) no lineales. En la figura 10.10. se muestran tres isotermas y las
formas de los picos correspondientes.
.
C
S
R
e
s
p
u
e
s
t
a
C
M
t
R
e
s
p
u
e
s
t
a
R
e
s
p
u
e
s
t
a
C
S C
S
C
M
C
M
t
t
a
b
10 % h
a
b
a b c

Figura 10.10. Isotermas y forma de los picos cromatogrficos.

*
En literatura inglesa, HETP (Height Equivalent to a Theoretical Plate).

La isoterma representada en la figura 10.10.b. suele presentarse en sistemas de
adsorcin con centros activos donde la fase estacionaria retiene fuertemente al
soluto. Cuando estos centros se saturan, K disminuye, al no existir sitios de retencin
fuerte disponibles, lo que se traduce en la presencia de una cola ms o menos
pronunciada.
El comportamiento representado en la figura 10.10.c. suele observarse en
sistemas de reparto en los que las interacciones soluto-fase estacionaria son
relativamente dbiles comparadas con las interacciones soluto-soluto, o cuando se
aade una cantidad de analito excesivamente grande (sobrecarga). En este caso, la
fase estacionaria sobrecargada tiende a comportarse como una fase lquida
constituida por el mismo soluto y, como "lo semejante disuelve a lo semejante", el
valor de K aumenta con la concentracin y el pico presenta un frente difuso y una cola
muy poco pronunciada.

El clculo del nmero de platos cuando los picos son asimtricos es ms
complicado que cuando son simtricos. Para ello se han propuesto diversos mtodos,
siendo uno de los ms empleados el que hace uso de la relacin
N =
41.7
t
R
w
0,1
2
a
b
+1.25

donde w
0,1
es la anchura de pico a un dcimo de la altura, y a/b (ver figura 10.10.) el
denominado factor de asimetra.
La teora de platos explica satisfactoriamente la forma de los picos
cromatogrficos, si bien, falla al intentar justificar el ensanchamiento de los mismos.
Por otra parte, se basa en unas supuestas condiciones de equilibrio que, en realidad no
se alcanzan, debido al movimiento continuo de la fase mvil.
Teora cintica
La teora cintica considera que el ensanchamiento de las bandas (o picos)
cromatogrficos se produce como consecuencia de que los distintos procesos de
transferencia de masa durante el desplazamiento de una especie a lo largo de la
columna ocurren a velocidad finita. Segn esta teora, la forma de los picos depende
de los siguientes factores:
* Difusin por turbulencia y trayectorias seguidas por la fase mvil.
* Difusin longitudinal del soluto a lo largo de la columna.

* Equilibrio del soluto entre las fases mvil y estacionaria no suficientemente
rpido.
Los tres factores mencionados normalmente se identifican con los parmetros A,
B y C y su contribucin al ensanchamiento de las bandas cromatogrficas conducen a
la ecuacin de van Deemter:
H =A +
B
u
+C u

donde u es la velocidad lineal media de la fase mvil (u=L/t
M
; L=longitud de la columna;
t
M
=tiempo muerto).
Este modelo es el clsico, y puede considerarse anticuado, si bien, se expondr
aqu por su sencillez y valor didctico. Por otra parte, la teora se desarroll
inicialmente para cromatografa de gases con columnas empacadas, pero puede
extenderse sin demasiadas dificultades a otros tipos de cromatografa, incluyendo
columnas tubulares abiertas e incluso a cromatografa plana.

Trmino A (difusin por turbulencia)
Este primer factor surge de la multitud de trayectorias de distintas longitudes
que toma la fase mvil que fluye a travs de la columna, que est empacada con
partculas de diferentes tamaos y formas acomodadas de manera irregular. Segn se
observa en la figura 10.11., donde se representan las trayectorias seguidas por dos
molculas durante la elucin, la distancia recorrida entre las lneas a y b por la
molcula 1 es mayor que la recorrida por la molcula 2, por lo que sta llegar antes a
la lnea b.
fase
mvil
a
b
1
2

Figura 10.11. Trayectorias de la fase mvil.
El trmino A es independiente de la velocidad de la fase mvil, pero es funcin
del tamao de las partculas de la fase estacionaria, de forma que

A = d
p

donde es una constante que depende de las dimensiones, geometra y uniformidad
del empaquetamiento de la columna, y d
p
es el dimetro medio de las partculas de la
fase estacionaria. Segn la expresin anterior, partculas pequeas y uniformemente
empaquetadas conducirn a columnas ms eficaces, si bien, ello implicar el empleo de
presiones altas. Por otra parte, el trmino A es cero para columnas tubulares abiertas,
debido a que la fase estacionaria en tales columnas se deposita directamente sobre la
pared de la columna.
Trmino B (difusin longitudinal)
El segundo factor que contribuye al ensanchamiento de las bandas es la difusin
longitudinal del soluto en la fase mvil. Se produce debido a que la concentracin de
soluto es menor en los bordes de la banda que en el centro, por lo que una banda de
soluto que se mueva a lo largo de la columna (de a hasta b en la figura 10.12.) se
ensanchar cuando las molculas se difundan hacia las zonas de menos concentracin,
hacia adelante y hacia atrs de la banda.
perfil de
concentraciones
fase
mvil
a
b

Figura 10.12. Ensanchamiento de banda debido a la difusin longitudinal.
La difusin longitudinal se dificulta por las partculas contenidas en la columna y
el coeficiente de difusin en la fase mvil, D
M
, de forma que,
B = 2 D
M

donde es un factor de impedimento que depende de las caractersticas del relleno de
la columna ( suele ser 0.7 para columnas con relleno y 1.0 para columnas tubulares
abiertas)
La contribucin del trmino B al valor de H suele ser despreciable en
cromatografa lquida, por los bajos valores de los coeficientes de difusin de los
lquidos. Sin embargo, los coeficientes de difusin de los gases suelen ser 10
5
veces
mayores que en fase lquida. Por otra parte, como la difusin consume un cierto

tiempo, el trmino de difusin en la ecuacin de van Deemter depende de la velocidad
de la fase mvil, disminuyendo a medida que aumenta sta.

Trmino C (resistencia a la transferencia de masa)
El trmino C est relacionado con el hecho de que el equilibrio para la
distribucin del soluto entre las fases mvil y estacionaria se establece tan
lentamente que una columna cromatogrfica siempre opera en condiciones lejos del
equilibrio. En realidad, el trmino C puede descomponerse en dos, C
S
y C
M
, segn se
considere la transferencia de masa en la fase estacionaria y en la fase mvil.
La resistencia a la transferencia de masa en la fase estacionaria es despreciable
para fases slidas, ya que la transferencia del analito sobre la superficie de un
adsorbente es muy rpida. Sin embargo, para fases estacionarias lquidas, el trmino
depende del espesor de la pelcula (d
f
) y del coeficiente de difusin del analito (D
S
)
C
S
=
d
f
2
D
S

En la prctica, las fases estacionarias lquidas poco viscosas presentan un
espesor de pelcula favorable.
El trmino C
M
describe la resistencia a la transferencia de masa en la fase mvil.
En la figura 10.13. se representa el ensanchamiento de banda originado por el hecho
de que el equilibrio no se produce instantneamente.
No equilibrio
Fase
mvil
Fase
estacionaria
Fase
mvil
Equilibrio
Fase
estacionaria

Figura 10.13. Ensanchamiento de banda originado por el no equilibrio en la transferencia de masa.
Perfiles de concentracin en las fases mvil y estacionaria.
Si la fase mvil se mueve rpidamente, y el soluto no puede "salir" con rapidez de
la fase estacionaria, entonces la zona del soluto en la fase mvil se adelanta respecto
a la fase estacionaria.

En cromatografa de gases, los efectos de la fase mvil, C
M
, son mucho menores
que los correspondientes de la fase estacionaria, C
S
, mientras que en HPLC, C
M
y C
S

tienen valores comparables.
En la figura 10.14. se representa la variacin de los tres trminos de la ecuacin
de van Deemter en funcin de la velocidad de la fase mvil. Ntese que la contribucin
del trmino A es independiente de la velocidad, mientras que B/u aumenta cuando la
velocidad disminuye y que Cu predomina a velocidades elevadas.
H
u
C u
A
B/u
A +
B
u
+C u

Figura 10.14. Representacin esquemtica de la ecuacin de van Deemter.
Las curvas de la ecuacin de van Deemter son similares para CG y para CL,
presentando, en todos los casos un valor mnimo de H para una determinada velocidad
de la fase mvil (condicin ptima). A velocidades inferiores a la ptima la difusin
longitudinal (B) origina un incremento en la altura de plato y un ensanchamiento de la
banda, mientras que a velocidades superiores, la resistencia a la transferencia de
masa (equilibrio lento) entre fases provoca que el soluto se extienda.

A partir de la ecuacin de van Deemter pueden deducirse las condiciones
experimentales que minimicen el valor de H. As, el valor de H disminuye con el tamao
de partcula (d
p
) y con un empaquetamiento uniforme (), as como operando con capas
finas de fase estacionaria lquida (d
f
2
) de baja viscosidad y a temperatura elevada
(para incrementar D
S
).

En la prctica, los datos para el grfico de la ecuacin de van Deemter suelen
determinarse experimentalmente usando valores de tiempos de retencin, tiempo
muerto y anchuras de pico, con objeto de objeto de obtener N y por tanto, H a
distintas velocidades de fases mviles. En cualquier caso, normalmente suele operarse
a velocidades superiores a la ptima, con objeto de reducir el tiempo necesario para la
separacin.

Factores extra-columna sobre el ensanchamiento de las bandas
cromatogrficas
Adems de los factores ya considerados que contribuyen al ensanchamiento de
los picos y que se producen en la propia columna cromatogrfica, es necesario
mencionar algunos que ocurren en otras zonas del sistema distintas de las fase
estacionaria. Entre ellos, pueden considerarse los siguientes:

* Introduccin de la muestra. Tericamente suele considerarse que la muestra
se introduce en el sistema cromatogrfico de forma que ocupa una capa de espesor
infinitamente pequeo. Sin embargo, en la realidad, la muestra ocupa un volumen
finito, y a veces relativamente grande, tal como sucede en CG, donde un micro-litro de
una sustancia lquida inyectada puede ocupar un volumen del orden de 0.5 mL cuando
se vaporiza a 250 , y ello representa varios centmetros de longitud de columna.
Adems, la lenta velocidad de vaporizacin contribuye tambin al ensanchamiento de
la banda.
En cromatografa lquida suelen emplearse bucles conteniendo un determinado
volumen de muestra a temperatura ambiente. En estas ocasiones, la relativamente
lenta eliminacin de trazas de la muestra de las paredes de la vlvula es el factor que
puede contribuir al ensanchamiento de la zona.
En cromatografa en papel y de capa fina la muestra deber aplicarse en forma
de una gota tan pequea como sea posible.

* Volmenes muertos en el sistema de inyeccin, detector y tubos de
conexin. Por volumen muerto se considera el existente entre el punto de inyeccin
de la muestra y el punto de deteccin, excepto el volumen ocupado por la fase

estacionaria, de forma que cualquier zona del sistema en la que estn presentes el
soluto y la fase mvil, pero no expuesta a la fase estacionaria contribuye a la difusin
del soluto y, en consecuencia, al ensanchamiento de las bandas cromatogrficas. Es
evidente, que debern usarse tubos estrechos para las conexiones entre el sistema de
inyeccin y la columna, y entre sta y el detector.
En CG el volumen muerto constituye un verdadero problema cuando se opera con
columnas tubulares abiertas, mientras que en HPLC, la menor velocidad de difusin en
la fase lquida disminuye la posibilidad de mezclas. Por otra parte, el empacado de la
columna es susceptible de compresin, sobre todo cuando se trabaja con presiones
altas y cuando la columna ha sido objeto de sbitos y rpidos cambios de presin.
En cuanto a los detectores, su propio volumen podr actuar como una verdadera
cmara de mezcla. Debern disearse de forma que su volumen sea pequeo y de que
se mantenga un flujo laminar en su interior.

En resumen, para minimizar el ensanchamiento de las bandas
cromatogrficas por factores extra-columna, deben minimizarse todos los
espacios muertos y las dimensiones de los tubos; la muestra deber aplicarse en
una zona muy estrecha y deber procurarse que penetre en la columna antes de
mezclarse con el eluyente.

RESOLUCION Y SU OPTIMIZACION
La separacin de solutos por un sistema cromatogrfico puede expresarse por el
factor de selectividad, , ya mencionado,
=
t
R
B
t
M
t
R
A
t
M
=
k
B
'
k
A
'
=
K
B
K
A

Sin embargo, describe la separacin entre los centros de las bandas
cromatogrficas, pero no tiene en cuenta las anchuras de pico, ya que puede ocurrir
que el factor de selectividad entre dos picos de dos cromatogramas diferentes sean
iguales, y, sin embargo, la resolucin sea bastante diferente, como puede apreciarse
en la figura 10.15.

A
B

Figura 10.15. Selectividad y resolucin.
Por lo anteriormente mencionado, resulta ms adecuado obtener la resolucin a
partir de la expresin (para picos Gaussianos)
R =
2t
RB
t
RA
w
A
w
B

o. alternativamente,
R =
2t
RB
t
RA
1.699 w
1/2A
+w
1/2B

segn se midan anchuras de pico, o anchuras a la semi-altura respectivamente (figura
10.16.)

Figura 10.16. Medidas para calcular la resolucin.

Si R=1.5, los dos picos solo se superponen un 0.3 %, mientras que si R=1, la
superposicin es del orden del 2 %, que puede considerarse adecuada para muchos
anlisis.
La ecuacin anterior resulta adecuada para obtener el valor de R, pero no
proporciona informacin acerca de las propiedades cinticas o termodinmicas de la
columna, lo cual es importante en orden a optimizar R. Por ello, una ecuacin
alternativa para la resolucin es la siguiente:
R =
1
4
N
1
k
'
1+k
'

donde k' es el valor medio de k'
A
y k'
B
. Esta expresin indica que la resolucin
depende de la eficacia global de la columna (N), de la capacidad de la fase estacionaria
para retener a los componentes () y de las caractersticas de retencin de cada
componente (k).
Segn la ecuacin anterior, la resolucin es una funcin de la raz cuadrada de N,
por lo que para aumentar significativamente el valor de R es necesario aumentar
mucho el de N. Esto puede hacerse incrementando la longitud de la columna, si bien
esto puede llevar a un tiempo demasiado grande. Por ello, normalmente suele ser
preferible optimizar k y .
Una forma relativamente sencilla de mejorar la resolucin es optimizando k', lo
cual puede hacerse aumentando la temperatura (sobre todo en CG) o cambiando la
composicin de la fase mvil (en HPLC). En cuanto al factor de selectividad, ste
puede modificarse variando la composicin de las fases mvil y estacionaria, as como
la temperatura o recurriendo a factores qumicos especiales como puede ser
incorporar a la fase estacionaria algn agente complejante particular. En cualquier
caso, y en la prctica, en muchas ocasiones se utiliza el mtodo SIMPLEX u otros ms
sofisticados para optimizacin de los mtodos analticos por cromatografa.
Cuando una muestra est constituida por un gran nmero de componentes, puede
ocurrir que se consigan las condiciones ptimas para la separacin de algunos , pero
ello vaya en detrimento de otros. En estos casos suele recurrirse a cambiar las
condiciones mientras se realiza la separacin, para lo cual, puede utilizarse la elucin
con gradiente (variacin gradual de la composicin de la fase mvil durante la elucin)
o la programacin de temperatura (variacin de la temperatura durante la elucin).


LA CROMATOGRAFIA Y EL ANALISIS QUIMICO
Aunque la cromatografa es el mtodo ms importante para la separacin de
especies, tambin es posible su empleo en anlisis cualitativo y, sobre todo, en anlisis
cuantitativo.

En anlisis cualitativo sus aplicaciones son bastante limitadas, sobre todo cuando
se compara la informacin que proporciona un cromatograma con la que puede
obtenerse con otras tcnicas como espectroscopia infrarroja, de resonancia
magntica o de masas. De todas formas, la cromatografa es una herramienta
importante para reconocer la presencia o ausencia de componentes en mezclas que
contengan un nmero limitado de posibles especies de las que se conozca su identidad.
Por otra parte, en ocasiones interesa conocer si un determinado componente est
ausente en una muestra. En estos casos, muchas veces la cromatografa proporciona
una evidencia segura en este sentido, al no aparecer el pico, o la mancha,
correspondiente al patrn en las mismas condiciones de operacin.

Anlisis Cuantitativo
En cromatografa plana (papel y capa fina) el rea ocupada por las especies
separadas es el parmetro utilizable en anlisis cuantitativo.
Las aplicaciones cuantitativas de la cromatografa en columna se basan en la
comparacin de la altura o del rea del pico del analito con los correspondientes a los
patrones. El empleo de las alturas de pico tiene la ventaja de su fcil medida
*
, pero
presenta el inconveniente de que debe controlarse rigurosamente la temperatura de la
columna, el caudal de eluyente y la velocidad de inyeccin de la muestra, ya que estas
variables alteran las anchuras de pico, y stas estn inversamente relacionadas con las
correspondientes alturas. Sin embargo, el rea de pico es independiente de los
efectos debidos a las variables anteriormente mencionadas, por lo que es el parmetro
que normalmente se utiliza. Su medida se lleva a cabo con facilidad, ya que casi todos
los cromatgrafos modernos estn provistos de integradores electrnicos digitales
*
.
Sin embargo, hay que tener en cuenta que la respuesta del detector vara de un
compuesto a otro. As, por ejemplo, el detector ultravioleta depende de la
absortividad de los correspondientes analitos, y el de ionizacin de llama de la

*
La altura de un pico cromatogrfico se obtiene uniendo las lneas base a cada lado del pico por una lnea
recta y midiendo la distancia perpendicular desde esta lnea al pico.
*
En el caso de no disponer de estos equipos, un mtodo sencillo para picos simtricos consiste en
multiplicar la altura de pico por la anchura a la semi-altura. Otros mtodos implican el uso de planmetros o
incluso la determinacin gravimtrica, consistente en recortar el pico y determinar su peso relativo respecto
al peso de un rea conocida del papel de registro.

formacin de iones. Por ello, a menudo se utilizan los denominados factores de
respuesta, obtenidos de la relacin entre el rea de un componente y el rea de otro
componente elegido como referencia.
Los mtodos de cuantificacin que principalmente se utilizan en cromatografa
son las rectas de calibrado obtenidas a partir de series de patrones, el mtodo del
patrn interno, el de normalizacin de reas y el de adicin estndar.
La obtencin de rectas de calibrado se lleva a cabo preparando una serie de
disoluciones patrn de composicin parecida a la de la muestra, obteniendo los
correspondientes cromatogramas y representando las reas de pico (o las alturas) en
funcin de la concentracin. En este mtodo, la fuente ms importante de error es la
incertidumbre en el volumen de la muestra, sobre todo cuando se utilizan micro-
jeringas. Estos errores pueden reducirse considerablemente con el empleo de vlvulas
rotatorias, cuyo funcionamiento se ilustra esquemticamente en la figura 10.17.
Muestra
(entrada)
Muestra
(salida)
Eluyente
Columna
Muestra
(entrada)
Muestra
(salida)
Eluyente
Columna
a) b)

Figura 10.17. Vlvula rotatoria. a) Llenado. b) Inyeccin (introduccin de la muestra en la columna).

En el mtodo del patrn interno se aade a los patrones y a la muestra una
cantidad exactamente medida de un componente puro, ausente en la muestra,
utilizndose como parmetro analtico la relacin de reas de pico del analito y del
patrn interno. Para aplicar este mtodo en cromatografa, es necesario que el pico
del patrn interno est bien aislado de los picos de los dems componentes de la
muestra, pero deber estar cerca del pico del analito.


El mtodo de normalizacin de las reas consiste en eluir todos los componentes
de la muestra, determinar las reas de todos los picos eluidos y obtener las
correspondientes reas de pico corregidas (mediante los factores de respuesta del
detector). La concentracin del analito se obtiene de la relacin entre su rea y el
rea total de los picos de todos los componentes de la muestra. Para el componente x,
%dex=
A
corregida
dex

A
corregidas
. 100

Finalmente, por lo que se refiere al mtodo de adicin estndar, su uso en
cromatografa est bastante limitado, debido, sobre todo, a la dificultad de inyectar
de forma precisa cantidades exactamente conocidas de la muestra.

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