Apuntes TEMA 8 - Metabolismo Oxidativo

Bioqumica.
Carmen Martnez URJC Metabolismo oxidativo

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Tema 8. Oxidacin del piruvato y ciclo de los cidos tricarboxlicos.
Transporte electrnico mitocondrial y fosforilacin oxidativa.

Aspectos generales del metabolismo respiratorio aerobio. Organizacin estructural de la
mitocondria y sus implicaciones metablicas.
Descarboxilacin oxidativa del piruvato a acetil-CoA por el complejo multienzimtico de la
piruvato deshidrogenasa. Enzimas y coenzimas participantes. Mecanismo de accin.
Regulacin.
Ciclo de los cidos tricarboxlicos.
Estrategia de la ruta. Reacciones y enzimas que intervienen. Balance global y
rendimiento energtico. Regulacin.
Papel central y anfiblico del ciclo de los cidos tricarboxlicos en el metabolismo
degradativo y biosinttico.
Reacciones anaplerticas para la reposicin de metabolitos del ciclo de los cidos
tricarboxlicos usados con fines biosnteticos.
Cadena respiratoria transportadora de electrones.
Visin global de las reacciones redox a favor de cadas de potencial. Termodinmica del
transporte electrnico. Reoxidacin de los coenzimas NADH y FADH
2
. Eficiencia del
transporte electrnico.
Transportadores electrnicos, la lgica de su secuencia en la cadena respiratoria.
Potenciales redox de los distintos componentes.
Descripcin molecular de los distintos complejos, constitucin proteica, grupos
prostticos, iones y tipos de transferencia electrnica que llevan a cabo. Rutas
propuestas de transporte electrnico (grupos implicados) y bombeo de protones.
Complejo I: NADH-ubiquinona reductasa.
Complejo II: Succinato-ubiquinona reductasa.
Complejo III: Ubiquinona-citocromo c reductasa.
Complejo IV: Citocromo c oxidasa.
Determinacin de la secuencia de los transportadores electrnicos respiratorios.
Inhibidores respiratorios.
Sistemas de transporte de poder reductor a travs de la membrana interna mitocondrial:
lanzaderas metablicas.
Fosforilacin oxidativa:
Sntesis de ATP acoplada al transporte electrnico mitocondrial. La relacin P/O,
eficiencia de la fosforilacin oxidativa.
Mecanismo de la fosforilacin oxidativa: hiptesis quimiosmtica de Mitchell.
Generacin de un gradiente electroqumico de protones (
H
).
El complejo ATP sintasa: subunidades. Mecanismo de sntesis de ATP. Inhibidores de
la ATP sintasa.
Desacoplamiento de la fosforilacin oxidativa. Funcin fisiolgica del desacoplamiento:
termognesis. Control respiratorio.
Utilizacin de la energa del transporte electrnico en procesos distintos a la sntesis de
ATP.

Bibliografa

Lehninger AL, Nelson DL y Cox MM (1993) Principios de Bioqumica. Caps.16 y19
Mathews CK y van Holde KE (1998) Bioqumica, Caps.14 y 15.
Stryer L (1995) Bioqumica. Caps. 20 y 21.
Voet D, Voet JG y Pratt CW (2007) Fundamentos de Bioqumica. Caps. 16 y 17.
Bioqumica. Carmen Martnez URJC Metabolismo oxidativo
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Tema 8. Oxidacin del piruvato y ciclo de los cidos tricarboxlicos.
Transporte electrnico mitocondrial y fosforilacin oxidativa.

En el tema anterior se vio cmo el piruvato, en condiciones anaerbicas, es
reducido a lactato en clulas animales. En presencia de O
2
el piruvato va a ser oxidado
completamente a CO
2
y H
2
O. Los electrones liberados durante los mltiples pasos de
oxidacin se transfieren a coenzimas (en su forma oxidada), principalmente NAD
+
,
generndose as transportadores electrnicos reducidos, NADH. Estos transportadores
se reoxidan posteriormente en la cadena respiratoria mitocondrial (de transporte de
electrones). Tales reacciones aportan la energa que impulsa la sntesis de ATP a
travs de la fosforilacin oxidativa.
As pues, en condiciones aerbicas el piruvato entra en la mitocondria y es
convertido en acetil-CoA (el coenzima A activa y transfiere grupos acilo). Esta
constituye la primera etapa de la respiracin (la respiracin mitocondrial se puede
considerar dividida en tres etapas). En una segunda etapa los dos tomos de carbono
del acetil-CoA se oxidan a CO
2
en el ciclo de Krebs, generndose transportadores
electrnicos reducidos. La cadena de transporte electrnico y la fosforilacin oxidativa
constituyen la tercera y ltima etapa.

El ciclo de Krebs est considerado como la ruta central del metabolismo
aerbico: es la ruta oxidativa central de la respiracin, proceso mediante el cual se
catabolizan todos los combustibles metablicos (hidratos de carbono, lpidos y
protenas) en los organismos y tejidos aerobios. Adems, el ciclo de Krebs es una
fuente importante de intermediarios de rutas biosintticas y, acoplado a la fosforilacin
oxidativa, la principal fuente de energa metablica.
El ciclo de Krebs se llama as en honor de su descubridor (Hans Krebs).
Tambin recibe el nombre de ciclo del cido tricarboxlico (TCA), puesto que se
identific a partir de los cidos tricarboxlicos que actan como intermediarios. O
tambin ciclo del cido ctrico, dado que el citrato es un intermediario clave de esta
secuencia de reacciones.
El ciclo de Krebs consta de 8 reacciones catalizadas enzimticamente y
transcurre en la matriz mitocondrial de clulas eucariotas. Bsicamente, consiste en lo
siguiente: el grupo acetilo del acetil CoA se transfiere a un cido orgnico de 4 C, el
OAA, para dar un cido tricarboxlico de 6 C, el citrato. El citrato entra en una serie de
reacciones durante las cuales se liberan 2 C en forma de CO
2
y los 4 C restantes se
regeneran en forma de OAA, que puede iniciar de nuevo el proceso. De ah la
naturaleza cclica de la ruta: el OAA est presente al inicio, para reaccionar con un
fragmento de 2 C activado, y est presente al final, despus de que se hayan oxidado 2
C hasta CO
2
. De las ocho reacciones del ciclo, cuatro son deshidrogenaciones, que
generan 3 NADH y 1 FADH
2
.

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MITOCONDRIA: estructura, compartimentacin y funcin.

Las mitocondrias son orgnulos del tamao de una bacteria que se encuentran
en el citoplasma de todas las clulas eucariotas aerbicas. Son los centros de la
respiracin celular y donde tiene lugar la mayor parte de la produccin de energa en
forma de ATP, para cubrir todas las necesidades celulares.
La mitocondria est limitada por dos membranas altamente especializadas, con
propiedades y funciones biolgicas distintas. La membrana externa es permeable a
molculas de bajo peso molecular (menor de 10000). La membrana interna, por el
contrario, es prcticamente impermeable a sustancias polares e inicas. Estas
sustancias entran en la mitocondria nicamente por la mediacin de protenas
transportadoras especficas. Los complejos proteicos de la cadena respiratoria
transportadora de electrones estn localizados en la membrana mitocondrial interna,
igual que la enzima que sintetiza ATP: la ATP sintasa.
La membrana interna mitocondrial est replegada en numerosas crestas que
aumentan considerablemente su superficie total.
El espacio entre las membranas externa e interna se conoce como el espacio
intermembrana. Como la membrana externa mitocondrial es permeable a molculas
pequeas, este espacio tiene prcticamente la misma composicin inica que el citosol.
La regin limitada por la membrana interna es la matriz mitocondrial. La matriz
contiene una mezcla altamente concentrada de cientos de enzimas diferentes,
includas las necesarias para la oxidacin del piruvato y de los cidos grasos y para el
ciclo de Krebs. Tambin posee varias copias idnticas del genoma de DNA
mitocondrial, ribosomas mitocondriales especiales y varias enzimas necesarias para la
expresin de los genes mitocondriales. La mitocondria no es, sin embargo,
genticamente autnoma, y los genes que codifican para la mayora de las protenas
mitocondriales estn en el DNA nuclear.

Complejo multienzimtico de la piruvato deshidrogenasa (PDH)

El piruvato procedente de la oxidacin de los hidratos de carbono es tan slo
uno de los principales suministradores de acetil CoA para la oxidacin en el ciclo de
Krebs. La degradacin de las grasas, mediante la -oxidacin de los cidos grasos, y
algunas rutas del catabolismo de los aminocidos tambin generan acetil CoA.
Antes de entrar en el ciclo de Krebs el piruvato ha de sufrir una descarboxilacin
oxidativa para formar acetil CoA. Esta reaccin est catalizada por un complejo
multienzimtico denominado piruvato deshidrogenasa (PDH), que est localizado en la
matriz mitocondrial. Puesto que la gluclisis transcurre en el citoplasma, el piruvato
tiene que entrar al interior de la mitocondria, y lo hace gracias a un transportador
especfico que existe en la membrana interna mitocondrial.
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En la reaccin global catalizada por la PDH el grupo carboxilo del piruvato se
pierde como CO
2
, mientras que los dos carbonos restantes forman la porcin acetilo
del acetil CoA.

Pyr + NAD
+
+ CoA-SH Acetil CoA + NADH + CO
2
G= - 33.5 kJ/mol

La reaccin es altamente exergnica e, in vivo, es bsicamente irreversible.

La PDH es un complejo multienzimtico formado por 3 enzimas diferentes:
E
1
Piruvato deshidrogenasa (PDH)
E
2
Dihidrolipoil transacetilasa (DLT)
E
3
Dihidrolipoil deshidrogenasa (DLDH)
Y por 5 coenzimas, 3 de los cuales estn unidos a las enzimas y no aparecen en la
reaccin ajustada:
E
1
-TPP (pirofosfato de tiamina)
E
2
-cido lipoico
E
3
-FAD
Y los 2 restantes s aparecen en la reaccin ajustada:
CoA-SH
NADH
Veamos ahora cmo actan todos estos componentes de manera conjunta para
producir la conversin del piruvato en acetil CoA. En la figura se muestra la secuencia
de reacciones.

1) Descarboxilacin
E
1

Pyr + TPP hidroxietil-TPP + CO
2

En una primera etapa el enzima PDH (E
1
), con la participacin de TPP,
descarboxila el piruvato. El pirofosfato de tiamina (TPP) es el coenzima para
todas las descarboxilaciones de los -cetocidos. El mecanismo de esta
reaccin es semejante al de la pyr descarboxilasa (en la fermentacin
alcohlica). El tomo de carbono en posicin 2 del anillo de tiazol del TPP
reacciona con el grupo carbonilo del piruvato para dar CO
2
y un derivado
hidroxietil unido al TPP.

2) El derivado hidroxietil origina tras esta segunda reaccin el grupo acetilo del
acetil-CoA. El cido lipoico se une covalentemente, mediante enlace amida, a un
residuo de lisina de la DLT, formando un grupo lipoil-lisilo que acta como un
largo brazo que oscila entre la PDH y la DLDH. En primer lugar el grupo
hidroxietil se transfiere a la lipoamida (unida a DLT) y se oxida simultneamente
a grupo acetilo, en tanto que la lipoamida se reduce a su forma ditiol.
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S E
1
S-acetil
Hidroxietil-TPP + Lip TPP + Lip
S SH

3) A continuacin la DLT (E
2
) (una transferasa de grupos acetilo) transfiere el grupo
acetilo al grupo tiol del CoA, formndose acetil CoA, que ya puede entrar en el
ciclo de Krebs para ser oxidado.

S-acetil E
2
SH
Lip + CoA-SH acetil CoA + Lip
SH SH

4) La lipoamida se vuelve a oxidar a expensas de la tercera enzima del complejo, la
DLDH (E
3
), para completar el ciclo. Transfiere los electrones al coenzima FAD
(unido a DLDH).

SH E
3
S
Lip + FAD Lip + FADH
2

SH S

5) El FADH
2
producido en esta reaccin es entonces reoxidado por el NAD
+

generando NADH, que junto con el acetil CoA y el CO
2
son los productos finales
de la reaccin del complejo PDH.
E
3

FADH
2
+ NAD
+
FAD + NADH + H
+

El complejo PDH de eucariotas, con un peso molecular superior a los 8 millones,
contiene mltiples copias de cada una de las actividades enzimticas E
1
, E
2
y E
3
, as
como pequeas cantidades de dos enzimas reguladoras: PDH quinasa y PDH
fosfatasa.

Regulacin de PDH

La regulacin de la oxidacin del piruvato por el complejo PDH es un punto
fundamental de la regulacin del metabolismo de los hidratos de carbono. De ah que la
PDH est sometida a distintos tipos de regulacin.

La actividad de este complejo est controlada por una modulacin alostrica y
por una modificacin covalente que se controla, a su vez, por el estado energtico de la
clula.
E
2
(DLT) y E
3
(DLDH) estn reguladas alostricamente:
E
2
se inhibe por acetil CoA y se activa por coenzima A libre.
E
3
se inhibe por ATP y NADH y se activa por AMP y NAD
+

As pues, la actividad de la PDH est coordinada con la carga energtica, la
relacin NAD
+
/NADH y la relacin entre la forma de coenzima A acetilada y libre.
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El estado energtico neto de la clula influye directamente en la produccin de
acetil CoA: cuando el nivel energtico de la clula es bajo, el piruvato es oxidado por
PDH en la mitocondria, pero segn aumenta el nivel energtico de la clula, la
combinacin de ATP y NADH inhiben el ciclo de Krebs, por lo que se acumula acetil
CoA.

El acetil CoA y el NADH son activadores alostricos de la PDH quinasa, que es
la enzima que est involucrada en la modificacin covalente y en la regulacin de la
PDH de mamferos. La modificacin covalente consiste en una fosforilacin/
defosforilacin de residuos de serina de E
1
.
Cuando dentro de la mitocondria aumenta la concentracin de NADH y acetil-
CoA, stos activan alostricamente a la PDH quinasa, que fosforila residuos de serina
de E
1
, dando lugar a una prdida de actividad PDH.
Una PDH fosfatasa especfica elimina hidrolticamente el Pi unido y reactiva el
complejo. La fosfatasa se activa por Ca
2+
y Mg
2+
.
Dado que el ATP y el ADP difieren en sus afinidades por Mg
2+
(ATP tiene ms
afinidad por Mg
2+
que ADP), la concentracin de Mg
2+
libre refleja la relacin ATP/ADP
dentro de la mitocondria.
As pues, la PDH responde a las [ATP], quedando desactivada cuando el ATP es
abundante y no es necesaria una mayor produccin de energa.
La protena quinasa es parte integrante del complejo PDH mientras que la
fosfatasa slo est unida de forma laxa.

CICLO DE KREBS

La funcin primaria del ciclo de Krebs consiste en oxidar los grupos acetilo que
entran en el ciclo en forma de acetil CoA. Al entrar en el ciclo, el grupo acetilo de 2C se
combina con un compuesto de 4C, el oxalacetato (OAA), para formar otro de 6C, el
citrato, un cido tricarboxlico. En el curso de este ciclo, 2 de los 6C se oxidan a CO
2
y
se regenera el OAA, completndose as el ciclo. El CO
2
producido en estas reacciones
sale de la mitocondria por difusin y abandona la clula.
En cada vuelta el ciclo utiliza un grupo acetilo y regenera una molcula de OAA,
que queda lista para volver a iniciar el proceso. A lo largo de estos pasos, parte de la
energa liberada en la oxidacin de los tomos de carbono se utiliza para convertir ADP
en ATP (aunque el paso de succinil CoA a succinato produce GTP en lugar de ATP,
todos los nuclesidos trifosfato son energticamente equivalentes, debido a reacciones
de intercambio tales como ADP + GTP ATP + GDP). El resto de la energa de
oxidacin se utiliza para transformar NAD
+
en NADH (3 molculas por ciclo) y FAD en
FADH
2
(una molcula por ciclo).
Las molculas de NADH y FADH
2
van a transferir sus electrones ricos en
energa a la cadena respiratoria, al final de la cual los electrones se utilizan para reducir
el O
2
a H
2
O. En estas reacciones se libera una gran cantidad de energa que es
utilizada por la ATP sintasa para generar ATP (fosforilacin oxidativa).
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La reaccin global del ciclo de TCA es:

Acetil CoA + 3NAD
+
+ FAD + GDP + Pi + 2H
2
O 2CO
2
+ CoA-SH + 3NADH + 3H
+
+ FADH
2
+ GTP

De la misma forma que consideramos dos fases en la gluclisis, tambin
conviene considerar dos fases diferenciadas en el ciclo de Krebs. La primera fase
(reacciones 1 a 4) se emplea fundamentalmente para oxidar 2C a CO
2
, mientras que la
segunda fase (reacciones 5 a 8) sirve fundamentalmente para regenerar el OAA.

TCA-1
La primera reaccin del ciclo es similar a una condensacin aldlica entre el
grupo ceto del OAA y el grupo metilo del acetil CoA, catalizada por la citrato sintasa.

Acetil CoA + OAA + H
2
O citrato + CoA-SH + H
+

El mecanismo de reaccin es el siguiente: un residuo bsico de la enzima extrae
un H
+
del grupo metilo del acetil CoA, creando un carbanin nuclefilo que ataca al
carbono ceto del OAA. Esta reaccin genera el compuesto enormemente inestable
citroil CoA, que espontneamente se hidroliza mientras est unido al enzima para dar
los productos: citrato y coenzima A.
Como es de prever en el primer paso de entrada a una ruta, la reaccin es
altamente exergnica (la hidrlisis del tioster libera energa) G= -32.2 kJ/mol, y se
ha considerado que constituye un lugar de regulacin para el conjunto de la ruta. La
actividad de la citrato sintasa est determinada en gran manera por la disponibilidad de
sustratos: acetil CoA y OAA. Adems se inhibe alostricamente por NADH y succinil-
CoA (compite con acetil CoA).
La citrato sintasa es un dmero. Cada subunidad tiene dos dominios; el centro
activo est situado en una hendidura entre los dos dominios. La unin de los sustratos
provoca un cambio conformacional en la enzima que hace que los sustratos queden
ocultos, protegiendo as al anin intermediario, el carbanin, del H
2
O y, por tanto, de
una rpida protonacin. (ver modelo del ajuste inducido de la catlisis enzimtica)

TCA-2
La siguiente reaccin, catalizada por la aconitasa, isomeriza el citrato a
isocitrato, con el objetivo de obtener un grupo hidroxilo secundario capaz de ser
oxidado (pues el hidroxilo terciario no puede serlo).
La reaccin comporta una deshidratacin e hidratacin consecutivas, a travs
del cis-aconitato como intermediario deshidratado, que se mantiene unido a la enzima.

Citrato cis-aconitato isocitrato

Es una reaccin endergnica, su G es positivo (G = + 6.3 kJ/mol), sin
embargo se encuentra desplazada hacia la formacin de isocitrato porque la siguiente
reaccin es muy exergnica.
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8
La aconitasa contiene hierro no hemo y azufre que forman un centro hierro-
azufre en el centro activo. El hierro forma un complejo con el citrato, a travs de 2
grupos carboxilo y un grupo hidroxilo de la molcula de citrato. Cuando una enzima se
une al sustrato en tres puntos o ms, el lugar de fijacin es asimtrico y puede unir al
sustrato tan slo en una direccin. Esto hace que el citrato, una molcula simtrica
(tiene un plano de simetra, que pasa por C3) se haga asimtrica tras la unin a la
superficie asimtrica de la aconitasa.
Por eso se dice que el citrato es una molcula proquiral. La aconitasa convierte
el citrato, proquiral, en isocitrato, quiral. (una molcula quiral es aquella que contiene un
carbono asimtrico, un C con 4 sustituyentes distintos, y en consecuencia tiene
enantimeros, es decir, ismeros que son imgenes especulares no superponibles
entre s).
La aconitasa es, pues, estereoespecfica e introduce el grupo OH en el carbono
que no proviene del acetil CoA recin incorporado.

Un inhibidor especfico de la aconitasa es el fluorocitrato, que se forma por la
condensacin de OAA y fluoroacetato (fluoroacetil-CoA) catalizada por la citrato
sintasa. El fluoroacetato se encuentra en las hojas de una variedad de plantas
venenosas y se utiliza como veneno para ratas.
El fluoroacetato por s mismo no es txico para la clula, pero cuando se
convierte en fluorocitrato, ste se une y bloquea el centro activo de la aconitasa,
inhibiendo as el ciclo de Krebs.

TCA-3
La primera de las dos descarboxilaciones oxidativas del ciclo la cataliza la
isocitrato deshidrogenasa (dependiente de NAD
+
). En esta reaccin se forma un
intermediario inestable, unido al enzima, que es el oxalsuccinato. Este se descarboxila
espontneamente antes de ser liberado del enzima.

Isocitrato + NAD
+
-KG + NADH + CO
2
G = - 20.9 kJ/mol

La isocitrato deshidrogenasa cataliza, pues, la descarboxilacin del isocitrato,
convirtindolo en -cetoglutarato (-KG). Es una enzima alostrica, que requiere Mg
2+

como cofactor. Se activa por ADP (a medida que aumenta la [ADP] aumenta la afinidad
del enzima por el sustrato, disminuye la Km). Es fuertemente inhibida por ATP y NADH.

TCA-4
Es la segunda descarboxilacin oxidativa del ciclo. Est catalizada por la
-cetoglutarato deshidrogenasa, un complejo multienzimtico anlogo al de la PDH,
que contiene tambin tres actividades enzimticas y sus coenzimas asociados.
El mecanismo de accin tambin es anlogo. Una diferencia entre estos dos
complejos multienzimticos es que las actividades reguladoras asociadas con el
complejo PDH no estn presentes en el de la -KG deshidrogenasa.

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9
-KG + NAD
+
+ CoA-SH succinil CoA + CO
2
+ NADH

La reaccin, a semejanza de la catalizada por PDH, es altamente exergnica:
G = - 33.5 kJ/mol
Se inhibe por succinil CoA y NADH y se activa por AMP.

En este punto del ciclo se han introducido dos tomos de carbono en forma de
acetil CoA (por la citrato sintasa) y se han perdido otros dos en forma de CO
2
. Dada la
estereoqumica de la reaccin de la aconitasa (capaz de distinguir entre las ramas
proquirales del citrato), los dos tomos de carbono perdidos no son los mismos que se
introdujeron al comienzo del ciclo.
Ya tenemos, pues, un intermediario de 4C: el succinil CoA, que ahora ha de ser
convertido en OAA para as completar el ciclo.

TCA-5
La energa almacenada en el grupo tioster del succinil CoA, rico en energa, se
conserva acoplando la ruptura de este enlace con la sntesis de GTP. Esta reaccin
est catalizada por la succinil CoA sintetasa.

Succinil CoA + Pi + GDP succinato + GTP + CoA-SH G= - 2.9 kJ/mol

El Pi terminal de alta energa del GTP puede ser transferido al ADP por la
nuclesido difosfato quinasa, producindose una molcula de ATP.

GTP + ADP GDP + ATP

Este es otro ejemplo de fosforilacin a nivel de sustrato (transferencia de un
grupo fosfato desde un metabolito rico en energa al ADP) comparable a la generacin
de ATP durante la gluclisis, en el sentido de que la sntesis de ATP ocurre como parte
de una va catablica y no como resultado de la reoxidacin de coenzimas (fosforilacin
oxidativa).

El succinato generado en esta reaccin tiene una estructura idntica al OAA
excepto en el tomo de carbono 2, que en el OAA es un grupo carbonilo (C=O) y en el
succinato un grupo metileno (-CH
2
-). Por lo tanto, para que el succinato se convierta en
OAA requiere dos reacciones oxidativas: una que convierta el metileno en hidroxilo y
otra que lo lleve al nivel carbonilo. Esto es lo que van a llevar a cabo las tres ltimas
reacciones del ciclo.

TCA-6
La succinato deshidrogenasa (SDH) cataliza la oxidacin del succinato a
fumarato (compuesto insaturado), acompaada de la reduccin de FAD a FADH
2

Succinato + E-FAD fumarato + E-FADH
2
G = 0 kJ/mol
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La SDH es una flavoenzima, el FAD est unido de forma covalente a la enzima a
travs de un residuo de histidina especfico.
Es una protena integral de membrana interna mitocondrial (a diferencia del resto
de las enzimas del ciclo que estn localizadas en la matriz mitocondrial). Es un
componente de la succinato-ubiquinona reductasa, un complejo multiproteico que
participa en la cadena respiratoria transportadora de electrones (lo que explica que el
FADH
2
pueda ser reoxidado estando como est unido covalentemente a la enzima).
La reaccin es estereoespecfica y el compuesto resultante insaturado es
siempre el ismero TRANS (fumarato), nunca el CIS.
Dado que en esta oxidacin ambos electrones provienen de tomos de carbono
adyacentes (y no como de costumbre de un C y un O adyacente) y dado que la
oxidacin de la unin C-C no es lo suficientemente energtica para permitir la
transferencia de electrones al NAD
+
, el aceptor en este caso ser FAD (un coenzima de
menor energa).
Reoxidacin de NADH G = - 220 kJ/mol 3 ATP
Reoxidacin de FADH
2
G = - 181 kJ/mol 2 ATP

TCA-7
Una vez formado el doble enlace, se produce una hidratacin estereoespecfica,
catalizada por la fumarasa, formndose el L-malato. Esta enzima realiza siempre la
adicin en TRANS (el fumarato es una molcula plana y se aade OH y H por encima y
por debajo del plano).

Fumarato + H
2
O L-Malato G = - 3.8 kJ/mol

Al generar un enlace C-O se permite la ms fcil oxidacin de este carbono en el
siguiente paso.

TCA-8
Finalmente se regenera OAA a partir de malato, mediante la oxidacin del grupo
hidroxilo a carbonilo, siendo en este caso el NAD
+
el aceptor de electrones. La reaccin
est catalizada por la malato deshidrogenasa.

L-malato + NAD
+
OAA + NADH + H
+
G = + 29.7 kJ/mol

Es una reaccin altamente endergnica en condiciones estndar, pero
transcurre en el sentido de formacin de OAA debido a que la reaccin de la citrato
sintasa es muy exergnica y mantiene las concentraciones intramitocondriales de OAA
extremadamente bajas.
El secreto del flujo de energa en los sistemas biolgicos reside en que la
energa liberada en un proceso se encuentra acoplada a un segundo proceso que, de
otra manera, en las condiciones celulares no ocurrira espontneamente. As, la
energa producida en un proceso espontneo no es desaprovechada, sino que
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constituye la fuerza motriz de otro proceso no espontneo. La variacin estndar de la
energa libre total de un conjunto de reacciones acopladas es igual a la suma de los
G de cada una de las etapas.

Balance del ciclo

Resumiendo:
1. El acetil CoA, de 2C, entra en el ciclo mediante su condensacin con una
molcula aceptora de 4C: el OAA.
2. Hay dos reacciones de descarboxilacin por cada ciclo, de manera que la
entrada de 2C en forma de acetil CoA se equilibra con la prdida de 2C en
forma de CO
2
.
3. Hay 4 reacciones de oxidacin: en 3 de ellas se utiliza NAD
+
como aceptor
de electrones y en la otra se utiliza FAD.
4. En uno de los pasos del ciclo se genera 1 ATP (va GTP).
5. El ciclo se completa tras la regeneracin del aceptor original: el OAA.

Hasta aqu la produccin de ATP por mol de glucosa metabolizada no ha
aumentado mucho respecto a la produccin obtenida en la gluclisis: 2 moles de ATP
por glucosa en la gluclisis sola, frente a 4 moles en gluclisis ms ciclo de Krebs. La
mayor parte del ATP generado durante la oxidacin de la glucosa no se forma
directamente a partir de las reacciones de la gluclisis y del ciclo de Krebs, sino que se
forma a partir de la reoxidacin de los transportadores electrnicos reducidos en la
cadena respiratoria. Estos compuestos, NADH y FADH
2
, son de por s ricos en energa,
en el sentido de que su oxidacin es altamente exergnica. Cuando los electrones se
transfieren desde estos transportadores reducidos hasta el O
2
escalonadamente, se
produce de manera acoplada la sntesis de ATP a partir de ADP, con la formacin de
alrededor de 3 moles de ATP por NADH oxidado a NAD
+
y de alrededor de 2 moles de
ATP por FADH
2
oxidado a FAD. De modo que por la oxidacin completa de un mol de
glucosa a CO
2
y H
2
O se generan alrededor de 38 moles de ATP.
G para la oxidacin de la glucosa es 2870 kJ/mol
G para la hidrlisis del ATP es 31 kJ/mol
La eficiencia en condiciones estndar es de ~ 40 %. La eficiencia in vivo es
probablemente superior.

Regulacin del ciclo de Krebs

Dado que el ciclo de Krebs es una fuente de intermediarios biosintticos, as
como una ruta para la generacin de energa metablica, la regulacin del ciclo es algo
ms compleja que si se tratara solamente de una ruta de generacin de energa. Al
igual que en la gluclisis, la regulacin se produce a nivel de la entrada de combustible
al ciclo, y a nivel del control de las reacciones clave dentro del ciclo.
___________________________________________________________________________

12
El flujo a travs del ciclo de Krebs se controla mediante interacciones
alostricas, aunque las concentraciones de los sustratos desempean tambin un
papel crucial.
El factor ms importante que controla la actividad del ciclo es la relacin
intramitocondrial de [NAD
+
]/[NADH]. El NAD
+
es un sustrato de 3 enzimas del ciclo, as
como de la PDH. En las condiciones en las que disminuye la relacin NAD
+
/NADH,
como, por ejemplo, en presencia de una limitacin del aporte de O
2
, la baja
concentracin de NAD
+
puede limitar las actividades de estas deshidrogenasas.
La citrato sintasa se inhibe por ATP, NADH y succinil CoA.
La isocitrato deshidrogenasa se activa por el ADP y se inhibe por NADH.
La actividad de la -KG se inhibe por succinil CoA y NADH (los mecanismos son
comparables a los de la inhibicin de PDH por acetil CoA y NADH).
En resumen, el flujo a travs del ciclo de Krebs es sensible al estado energtico
de la clula, al estado rdox de la clula, a travs de la limitacin de la velocidad de
flujo causada por el descenso de [NAD
+
] mitocondrial, y a la disponibilidad de
compuestos de alta energa, mediante la inhibicin de enzimas relevantes por acetil
CoA o succinil CoA.

Reacciones anablicas

Hasta el momento slo hemos hablado de una de las funciones del ciclo de
Krebs: su funcin catablica, de generacin de energa. Ahora bien, el ciclo desempea
otra importante funcin: proporciona intermediarios de rutas biosintticas. La posibilidad
de utilizar el ciclo con una funcin catablica o anablica es lo que le da su carcter
anfiblico. En la figura se resumen las rutas anablicas ms importantes. Estas rutas
tienden a extraer carbono del ciclo mediante la utilizacin de algunos de sus
intermediarios.

El succinil CoA se utiliza en la sntesis del grupo hemo y de otras porfirinas.
El OAA y el -KG son los anlogos cetocidos de los aminocidos asprtico y
glutmico, respectivamente, y se utilizan en la sntesis de stos y otros
aminocidos mediante transaminacin.
En algunos tejidos, el citrato se transporta desde las mitocondrias al citosol, en
donde es fragmentado por la ATP citrato liasa para producir acetil CoA para la
biosntesis de cidos grasos.

Los intermediarios del ciclo de Krebs utilizados en las rutas biosintticas deben
reponerse para mantener el flujo a travs del ciclo. Las rutas anaplerticas sirven para
este fin.

___________________________________________________________________________

13
Reacciones anaplerticas (o de relleno)

Son necesarias para reemplazar aquellos compuestos que han sido utilizados
con propsitos biosintticos, as como para aumentar los niveles de intermediarios
cuando las necesidades celulares requieren una gran actividad del ciclo de Krebs.
Las ms importantes son:

La catalizada por la piruvato carboxilasa: se forma OAA a partir de piruvato y
CO
2
, con el gasto de una molcula de ATP. Es una enzima alostrica y se activa
por acetil CoA. Si disminuye la velocidad del ciclo porque no hay suficiente OAA,
el resultado es que aumentan los niveles de acetil CoA porque no puede ser
utilizado. El acetil CoA entonces activa la piruvato carboxilasa, que acta
metiendo OAA, recuperndose as la velocidad del ciclo.
En plantas y bacterias hay una ruta similar que conduce directamente desde el
PEP hasta el OAA. Est catalizada por la PEP carboxilasa. Dado que el PEP es
un compuesto de muy alta energa, esta reaccin no requiere ATP.
El enzima mlico o malato deshidrogenasa dependiente de NADP
+
rellena
metiendo piruvato en forma de malato. Esta enzima cataliza la carboxilacin
reductora del piruvato para dar malato.

Pyr + CO
2
+ NADPH + H
+
L-malato + NADP
+

Las reacciones de transaminacin, de las que ya hemos hablado, tambin
funcionan en la direccin inversa para producir OAA y/o -KG a expensas de los
aminocidos anlogos, dado que se trata de reacciones reversibles. Funcionan
as tambin como vas anaplerticas.

___________________________________________________________________________

14
CADENA RESPIRATORIA TRANSPORTADORA DE ELECTRONES

Es un sistema de complejos proteicos localizado en la membrana interna
mitocondrial que, mediante reacciones de xido-reduccin, van a llevar los electrones
desde el NADH y FADH
2
hasta el ltimo aceptor, el oxgeno, formndose H
2
O como
producto final. Se produce una serie de reacciones de oxidacin y reduccin acopladas,
con un paso de electrones a lo largo de una serie de transportadores: la cadena de
transporte electrnico o cadena respiratoria. El ltimo paso es la reduccin de O
2
a
H
2
O.

El transporte de electrones tiene lugar a favor de gradiente electroqumico, a
favor de cada de potencial, es decir, los electrones son cedidos por transportadores
con potencial redox ms negativo a transportadores de potencial ms positivo (ms
alto). El valor de E
o
de cada transportador aumenta en el mismo orden que la
secuencia de su uso en el transporte electrnico. Este orden sugiere que cada una de
las reacciones de oxidorreduccin del transporte electrnico es exergnica en
condiciones estndar (E > 0 G < 0). La secuencia global de transporte electrnico
es bastante exergnica. Un par de equivalentes reductores, generados a partir de un
mol de NADH basta para dar origen a la sntesis acoplada de unos 3 moles de ATP a
partir de ADP + Pi, mediante la fosforilacin oxidativa. En la fosforilacin oxidativa, el
potencial de reduccin (o potencial de transferencia de electrones) del NADH (y del
FADH
2
) proporciona una fuente de energa libre para guiar las reacciones de
transferencia de grupo fosfato asociadas con la produccin de ATP a partir de ADP+ Pi.
Durante la transferencia escalonada de electrones desde los coenzimas
reducidos al O
2
se libera la energa libre que permite la sntesis de ATP.
La cadena de transporte electrnico es necesaria para la reoxidacin de los
coenzimas reducidos, NADH y FADH
2
, regenerando as las molculas aceptoras de
electrones que se requieren en las reacciones oxidativas dentro de la clula.

Dado que la reoxidacin de los coenzimas se realiza a expensas del O
2
se
pueden considerar las siguientes reacciones globales:

NADH + H
+
+ O
2
NAD
+
+ H
2
O G= - 220 kJ/mol
FADH
2
+ O
2
FAD + H
2
O G= - 181 kJ/mol

As pues, durante la respiracin se consume O
2
y se genera H
2
O, que junto con
el CO
2
que se gener en el ciclo de Krebs, constituyen los dos productos finales del
metabolismo energtico aerobio.
Lo ms importante de estas reacciones es la gran cantidad de energa libre que
se libera durante la oxidacin del NADH y del FADH
2
, debido a que ambos coenzimas
tienen un potencial de reduccin muy negativo.

___________________________________________________________________________

15
Podemos calcular la eficiencia del transporte electrnico. Experimentalmente
sabemos que la oxidacin de 1 mol de NADH en la cadena respiratoria se produce
simultneamente con la sntesis de unos 3 moles de ATP a partir de ADP y Pi. Dado
que G para la hidrlisis del ATP es de 31 kJ/mol, la sntesis de 3 ATPs requiere 93
kJ/mol en condiciones estndar, con lo que se obtiene una eficacia de la fosforilacin
oxidativa de ~ 40 %. Puesto que el G de la hidrlisis de ATP en condiciones
intracelulares es significativamente mayor (- 40 kJ/mol o ms), es probable que la
eficacia intracelular sea algo mayor de 40 %.
Como vemos, la variacin de energa libre que se produce durante la oxidacin
de NADH y FADH
2
por O
2
es lo suficientemente grande para permitir la sntesis de
varias molculas de ATP. Se hace, pues, necesaria la existencia de una serie de
intermediarios para que la liberacin de energa sea escalonada y optimizar as la
generacin de ATP.

Para comprender el orden de los intermediarios en la cadena respiratoria hay
que observar los potenciales de reduccin de cada uno de ellos. Los componentes de
la cadena transportadora de electrones estn ordenados de acuerdo a sus potenciales
de reduccin, en el sentido de una creciente afinidad por los electrones. Todos estos
intermediarios son componentes de la membrana interna mitocondrial y se requiere
lgicamente su proximidad fsica, por lo que van a estar organizados en complejos. El
flujo de electrones ocurrir siempre en el sentido indicado en la figura mencionada. Los
electrones del NADH pasarn siempre primero al FMN, y luego al resto de la cadena en
el orden indicado. No es posible que el NADH transfiera sus electrones a otros
transportadores porque los intermediarios estn fsicamente ordenados en la
membrana en funcin de sus potenciales de reduccin y la transferencia de electrones
slo es posible entre transportadores contiguos.
En tres puntos de la cadena la transferencia de electrones de un transportador al
siguiente se acompaa de una variacin de energa libre suficiente para generar ATP
(FMNCoQ, cit bcit c
1
y cit aO
2
), lo que coincide con la observacin de que se
forman 3 molculas de ATP por cada par de electrones que fluyen del NADH al O
2
.

Transportadores de electrones

Excepto la ubiquinona o coenzima Q, todos los dems son protenas con grupos
prostticos especficos, capaces de ser oxidados y reducidos reversiblemente, que
estn organizados en complejos:

I NADH-ubiquinona reductasa: transfiere 2 electrones desde el NADH a UQ.
II Succinato-ubiquinona reductasa: transfiere 2 electrones desde FADH
2
a UQ.
III Ubiquinona-cit C reductasa: transfiere electrones desde UQH
2
hasta cit C.
IV Cit c oxidasa: cataliza la reduccin del O
2
a H
2
O.

___________________________________________________________________________

16
La transferencia de electrones desde un complejo a otro se efecta por las
formas reducidas de la ubiquinona y del citocromo c. Estos portadores de electrones,
ms pequeos, son mviles y difunden fcilmente en la bicapa de la membrana.

Complejo I NADH-ubiquinona reductasa

Es probablemente el componente proteico ms grande de la membrana interna
mitocondrial. Contiene unas 42 cadenas polipeptdicas distintas, una molcula de FMN
(mononucletido de flavina) que acta como grupo prosttico y algunos centros hierro-
azufre (6 7).

Los centros hierro-azufre estn formados por un hierro no hemo que forma un
complejo con azufre en 3 formas conocidas (ver figura). La forma ms sencilla,
denominada FeS, contiene un Fe que forma un complejo tetradrico con los S tilicos
de 4 cistenas. La segunda forma, Fe
2
S
2
, contiene 2 Fe, cada uno de los cuales forma
un complejo con 2 cistenas y 2 sulfuros inorgnicos. La tercera forma, que es la ms
compleja, Fe
4
S
4
, contiene 4 Fe, 4 sulfuros y 4 residuos de Cys.
La NADH-ubiquinona reductasa contiene centros Fe
2
S
2
y Fe
4
S
4
. En todos estos
centros, el Fe puede experimentar una oxidorreduccin cclica entre los estados ferroso
y frrico:
Fe
2+
Fe
3+

Varas protenas redox importantes contienen centros hierro-azufre. Se
denominan genricamente protenas sulfofrricas. Son componentes esenciales de
NADH-UQ reductasa (I), succinato-UQ reductasa (II) y ubiquinona-Cit c reductasa (III).
Tambin las vamos a encontrar en otras cadenas transportadoras de electrones, como
la fotosinttica.

En el complejo NADH-UQ reductasa la secuencia de cesin de electrones sera:

NADH + H
+
FMN Fe
2+
S UQ

NAD
+
FMNH
2
Fe
3+
S UQH
2

La flavina en FMN tiene tres estados redox oxidado, semiquinona y reducido-
por lo que puede actuar como transportador de 1 2 electrones, sirviendo as de
enlace entre NADH y FeS.
Este complejo proteico no slo cataliza una reaccin redox, sino que adems
bombea protones desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana.

___________________________________________________________________________

17
UBIQUINONA
Es una pequea molcula liposoluble (una benzoquinona ligada a diversas
unidades de isopreno, generalmente 10). Tambin llamada coenzima Q (CoQ). La cola
isoprenoide proporciona a la molcula su carcter apolar, que permite a la ubiquinona
una difusin rpida a travs de la membrana mitocondrial interna.
Dado que la ubiquinona pasa por un estado de semiquinona (como radical libre)
durante su ciclo de xido-reduccin, es una buena transicin entre los transportadores
de 2 electrones (FAD, NAD
+
) y los de un nico electrn (citocromos).

Complejo II Succinato-ubiquinona reductasa

En este caso el donador de electrones es el succinato, un intermediario del ciclo
de Krebs. El complejo II participa en la transferencia de electrones desde el succinato a
la ubiquinona (succinato + UQ fumarato + UQH
2
). El flujo de electrones desde el
succinato a la ubiquinona tiene lugar va el FADH
2
que es producido por la oxidacin
del succinato a fumarato en el ciclo de Krebs.

Succinato FAD Fe
2+
S UQ

Fumarato FADH
2
Fe
3+
S UQH
2

La succinato-UQ reductasa contiene 4 polipptidos, de los cuales los 2 mayores
son los que tienen el centro activo de la succinato DH (la enzima que oxida el succinato
a fumarato en el ciclo de Krebs), el grupo prosttico FAD y 3 centros Fe-S.
El paso de los electrones desde el succinato hasta la ubiquinona no est
acompaado de un transporte de H
+
de un lado a otro de la membrana (El E
o
de la
transferencia de electrones desde el succinato a la UQ es de + 0.069 v, mucho menor
que el E
o
de la reaccin de la NADH-UQ reductasa que es de + 0.42 v. La pequea
variacin de energa no permite al complejo II bombear H
+
a travs de la membrana
interna mitocondrial), por lo tanto este complejo proteico no contribuye a la creacin del
gradiente de H
+
. Por cada par de electrones que pasan desde el succinato a la cadena
transportadora de electrones se sintetizan ~ 2 molculas de ATP (a diferencia de los 3
ATPs que se consiguen con la oxidacin del NADH).

Complejo III Ubiquinona-citocromo C reductasa

Este complejo oxidorreductasa cataliza la transferencia de electrones desde la
UQH2 al citocromo c. Se trata de un oligmero de al menos 8 protenas distintas,
incluyendo un citocromo c, 2 citocromos del tipo b (que tienen distinto E
o
) y una
protena sulfofrrica.
___________________________________________________________________________

18
El complejo es transmembrana, atraviesa totalmente la membrana interna
mitocondrial, y bombea H
+
: una de las etapas de la transferencia de electrones implica
una gran disminucin de la energa libre. La energa liberada en este paso es
conservada en la forma de un gradiente de H
+
.

CITOCROMO C
Es una pequea protena perifrica de membrana, acepta los electrones de la
UQ-citocromo c reductasa, luego difunde lateralmente por la superficie de la membrana
y transfiere estos electrones a la citocromo c oxidasa.

Los citocromos son un grupo de protenas que contienen un grupo
hemo y que actan como portadores de 1 electrn en las cadenas
transportadoras de electrones respiratoria y fotosinttica. El tomo de Fe del
grupo hemo del citocromo puede fluctuar entre el estado de oxidacin
ferroso y frrico.
Hay 3 clases principales de citocromos, llamados a, b y c en funcin
de la naturaleza de las cadenas laterales de su grupo hemo. El grupo hemo
presente en el cit b es el tipo que se encuentra en la hemoglobina y en la
mioglobina. En el grupo hemo del cit a dos de las cadenas laterales estn
modificadas. En el cit c el grupo hemo est ligado de forma covalente al
componente proteico a travs de residuos de cistena.
Los citocromos, debido al grupo hemo, tienen unos espectros de luz
visible caractersticos, con 3 picos principales de absorcin (o bandas de
absorcin): , y . Se puede distinguir entre los 3 tipos de citocromos por
las diferencias de sus espectros de absorcin de luz.
Dentro de una misma clase, los citocromos pueden distinguirse entre
ellos por la longitud de onda de su banda de absorcin (est ausente en
los citocromos oxidados). Estas longitudes de onda se indican a veces con
subndices (cit b
560
) o directamente se le pone un subndice a la subclase: cit
a y a
3
.
En general son protenas integrales de membrana, salvo el cit c que
es una protena asociada dbilmente al lado externo de la membrana
mitocondrial interna.

Complejo IV Citocromo c oxidasa

Es el componente final de la cadena transportadora de electrones. Cataliza la
reduccin del O
2
a H
2
O y bombea H
+
al espacio intermembrana.
Para reducir una molcula de O
2
tiene que oxidar 4 molculas de citocromo c
consecutivamente, cada una de las cuales cede un electrn (son 4 los electrones que
se necesitan).

4 cit c
red
+ O
2
+ 4 H
+
4 cit c
ox
+ 2H
2
O
___________________________________________________________________________

19
Contiene entre 6 y 13 subunidades proteicas, 2 iones Cu
2+
y los citocromos a y
a
3
(estos dos citocromos tienen estructuras idnticas, pero estn en diferentes entornos
en el oligmero y tienen diferentes E
o
).
Casi el 90% del consumo celular de O
2
se debe a la accin de este complejo.

Determinacin de la secuencia de los transportadores electrnicos respiratorios.

Para establecer el orden de accin de los transportadores electrnicos en la
cadena respiratoria se han empleado una serie de tcnicas que incluyen:

Medidas espectrofotomtricas: ciertas molculas presentan distintos espectros
de absorcin segn se encuentren en su estado reducido u oxidado, es el caso
de NADH, FADH
2
y citocromos.

Utilizacin de inhibidores respiratorios especficos de algunos de los complejos
que participan en la cadena:

o Amital (barbitrico) y rotenona (toxina vegetal que se utiliza como
insecticida) inhiben al complejo I
o Antimicina A (antibitico) inhibe al complejo III
o Cianuro, azida y monxido de carbono inhiben al complejo IV

Han sido de mucha utilidad para determinar la secuencia de los intermediarios
que transportan los electrones. Una vez que se conoce el sitio de accin de un
determinado inhibidor se puede deducir si un transportador est antes o despus
de ese sitio dependiendo de si se acumula en su forma oxidada o reducida.

Utilizacin de aceptores de electrones artificiales, como el azul de metileno, el
DCPIP (2,6 diclorofenolindofenol) y el ferricianuro, que captan electrones en
puntos especficos de la cadena (en funcin de sus respectivos potenciales de
reduccin).

Fraccionamiento de la membrana interna mitocondrial mediante el uso de
detergentes como la digitonina, que permite aislar los distintos complejos
proteicos sin desnaturalizarlos. El anlisis de cada complejo con respecto a la
presencia de transportadores electrnicos, as como a las reacciones
catalizadas, ha ayudado a establecer la secuencia de transportadores aceptada
actualmente.

Lanzaderas metablicas

Las lanzaderas son sistemas de transporte de poder reductor a travs de la
membrana interna mitocondrial.
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20
El NADH generado en el citosol durante la gluclisis debe transferir los
equivalentes de reduccin a la mitocondria, para su reoxidacin por la cadena
respiratoria. Van a ser necesarios sistemas de transporte especficos, ya que el NADH
no puede atravesar por s mismo la membrana interna mitocondrial. Las lanzaderas son
esos sistemas de transporte especfico que transfieren los electrones del NADH
citoslico al interior de la mitocondria. Funcionan bsicamente de la siguiente manera:
el NADH citoslico transfiere sus electrones a una molcula orgnica que es capaz de
atravesar la membrana mitocondrial y llevar as los electrones al interior de la
mitocondria. All, en la matriz mitocondrial, esta molcula es reoxidada, donando sus
electrones a un coenzima oxidado. La molcula oxidada atraviesa la membrana de
vuelta al citoplasma, en donde puede experimentar de nuevo el mismo ciclo.
Las dos lanzaderas principales conocidas son: Glicerol-3-P / DHAP y Malato /
aspartato.

Glicerol-3-P / DHAP

Es el sistema de lanzadera ms primitivo que se conoce. Es especialmente
activo en el cerebro (y en el msculo de vuelo de los insectos).
Los electrones del NADH generado en el citosol se transfieren a la DHAP que
es, por tanto, reducida a glicerol-3-P. Esta reaccin est catalizada por la glicerol-3-P
DH citoplsmica. El glicerol-3-P pasa a la mitocondria, donde es reoxidado por una
flavoprotena, la glicerol-3-P DH, unida a la cara externa de la membrana interna
mitocondrial. El FAD de esta flavoprotena es reducido a FADH
2
mitocondrial y de all a
la cadena respiratoria.
En este punto hay que tener en cuenta que el FADH
2
tiene un potencial redox
menos negativo que el NADH, por lo que la generacin de ATP ser menor. Slo se
sintetizarn 2 ATP por cada NADH citoplsmico que transfiera sus equivalentes de
reduccin a la mitocondria por este sistema.

Malato / aspartato

Este sistema de lanzadera es especialmente activo en hgado y corazn. En este
caso, una isoenzima citoslica de la malato DH transfiere los electrones del NADH al
oxalacetato, que se reduce a malato, el cual pasa a la mitocondria a travs de un
sistema de transporte especfico de la membrana interna mitocondrial (antiporte con
KG). El malato es reoxidado a continuacin por la malato DH del ciclo de Krebs, que
utilizar tambin NAD
+
. Se genera as OAA, que no puede atravesar la membrana
interna. Se requiere una reaccin de transaminacin: el OAA se transamina a
aspartato, que s puede atravesar la membrana, y, una vez en el citosol, es de nuevo
transaminado para regenerar el OAA requerido como aceptor electrnico en el inicio del
ciclo. El aspartato sale de la mitocondria por un antiporte con glutamato.
El balance neto ha sido la transferencia de dos equivalentes de reduccin del
NADH del citosol a la matriz mitocondrial.

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21
FOSFORILACIN OXIDATIVA

Cul es el mecanismo por el cual la transferencia de electrones desde los
coenzimas al O
2
se acopla a la generacin de ATP?

Hablamos de fosforilacin oxidativa porque el ATP se genera mediante
reacciones de fosforilacin acopladas al transporte de electrones oxidativo y para
distinguirla de la fosforilacin a nivel de sustrato.

Fosforilacin y oxidacin estn estrechamente acopladas. Debido a este
acoplamiento existe una proporcin entre el ATP generado y el oxgeno molecular
consumido, la llamada relacin P/O, que es el nmero de molculas de ATP
sintetizadas por cada par de electrones transportado en la cadena. En mitocondrias
aisladas la relacin P/O es prxima a 3 por cada molcula de NADH oxidada, aunque
la estequiometra an no est muy clara. En cuanto al FADH
2
, la relacin es prxima a
2, con un menor rendimiento, como corresponde a su potencial redox ms positivo.
La relacin P/O de 3 para la oxidacin del NADH coincide con la observacin de
que tres de las reacciones individuales de la cadena respiratoria son lo suficientemente
exergnicas como para impulsar la sntesis de una molcula de ATP cada una. Tres de
estas reacciones tienen unos valores de G superiores a 31 KJ/mol, la barrera
mnima que debe superarse (en condiciones estndar) para hacer que la sntesis de
ATP sea exergnica.
Estas tres reacciones son la oxidacin del FMNH
2
por la ubiquinona, la oxidacin
del citocromo b por el citocromo c
1
y la reaccin de la citocromo c oxidasa.
Su identificacin experimental revel que cada una de estas tres reacciones es
capaz de dar, por s sola, energa a la membrana para la sntesis de ATP a pesar de
que no acte el conjunto de la cadena de transporte electrnico. Los experimentos
consistieron en limitar el transporte electrnico a determinadas partes de la cadena
mediante el empleo de aceptores y donadores electrnicos en presencia o ausencia de
inhibidores respiratorios especficos (fig. 15.12 Mathews). Para cada segmento aislado
de esta manera se determinaron las relaciones P/O.
En primer lugar, el succinato se oxida con una relacin P/O de 2, no de 3, lo que
sugiere la existencia de un lugar de acoplamiento previo a la ubiquinona en la cadena
respiratoria. Este hecho se confirm mediante el bloqueo del transporte electrnico
despus del cit b con antimicina A. Se aadi ferricianuro como aceptor electrnico
artificial, de manera que pudiera continuar el flujo electrnico. En estas condiciones, los
sustratos ligados al NAD
+
se oxidan con una relacin P/O de 1, lo cual confirmaba la
existencia de un lugar previo al cit b.
Cuando se utiliza como donador electrnico artificial el par ascorbato/TMPD
(tetrametil-p-fenilen diamina), pueden introducirse los electrones en la cadena
respiratoria a nivel del cit c. La oxidacin del cit c por la citocromo c oxidasa se produce
con una relacin P/O de 1, con lo que se localiza otro de los lugares de acoplamiento,
ms all del cit c.
___________________________________________________________________________

22
La adicin de un inhibidor de la citocromo c oxidasa, como el cianuro, fuerza la
salida de los electrones de la cadena respiratoria a la altura del cit c. En estas
condiciones, el succinato se oxida con una relacin P/O de 1, lo que localiza un lugar
entre los citocromos b y c.
En resumen, estos experimentos demuestran que los complejos I, III y IV son
capaces de impulsar la sntesis de ATP, mientras que el complejo II no lo es.

Previamente se coment que estos tres complejos proteicos de la cadena
respiratoria transportadora de electrones, I, III y IV, son bombas de H
+
que translocan
H
+
desde la matriz mitocondrial al espacio intermembrana, generando un gradiente de
H
+
a travs de la membrana interna mitocondrial, dado que sta es impermeable a H
+
.

Este movimiento de H
+
tiene 2 consecuencias principales:

1. Genera un gradiente de pH de ~ 1.4 unidades a travs de la membrana
interna mitocondrial, siendo ms cido fuera que dentro.
2. Genera un gradiente de voltaje: la existencia de un gradiente de
concentracin de una especie cargada, como es el H
+
, a travs de la
membrana tambin crea un potencial elctrico, llamado potencial de
membrana, de aproximadamente 0.14 v. Como resultado del flujo neto de
salida de iones positivos, el potencial ser negativo en el interior y positivo en
el exterior.

Ambas fuerzas, el gradiente de pH y el potencial de membrana, van a actuar
atrayendo a los H
+
hacia la matriz mitocondrial, y en conjunto constituyen un gradiente
electroqumico de H
+
. El gradiente electroqumico de H
+
ejerce una fuerza protn
motriz (fpm), la cual puede medirse en unidades de voltio:

H
= (2.3RT/F) pH

Este gradiente electroqumico de H
+
o fuerza protn motriz (
H
o fpm o p) se
puede descomponer en un potencial elctrico (el potencial de membrana), , y un
componente puramente qumico, de concentracin, que es el gradiente de pH, pH.

La fuerza protn motriz proporciona la energa necesaria para la sntesis de
ATP. La energa liberada por la descarga del gradiente electroqumico de H
+
puede
acoplarse con la fosforilacin de ADP para formar ATP.

Esta es la teora quimiosmtica de Mitchell, el modelo que mejor explica el
acoplamiento de la sntesis de ATP con el transporte de electrones (es el que mayor
apoyo experimental tiene). Fue propuesta por el bioqumico britnico Mitchell en 1961 y
le vali el Premio Nobel en 1978.
___________________________________________________________________________

23
Esta teora quimiosmtica afirma que el acoplamiento de la oxidacin con la
fosforilacin es indirecto. Los H
+
son translocados hacia el espacio intermembrana por
lo complejos de la cadena respiratoria transportadora de electrones. Estos H
+
luego
fluyen de nuevo, debido a su gradiente, hacia la matriz mitocondrial, a travs de un
canal de membrana formado por la enzima ATP sintasa. La fosforilacin del ADP est
de esta forma acoplada al movimiento de los H
+
hacia el interior.

La teora quimiosmtica consta de 3 postulados:

1. La cadena transportadora de electrones mitocondrial transloca H
+
a travs de
la membrana interna mitocondrial conforme los electrones fluyen desde un
complejo de la cadena al siguiente.
2. La ATP sintasa utiliza la fuerza protn motriz para llevar a cabo la
fosforilacin del ADP.
3. La membrana interna mitocondrial es impermeable a los H
+
. Si la membrana
es alterada no puede crearse una fuerza protn motriz y no se produce
sntesis de ATP.

Todava no se conoce la estequiometra exacta de la translocacin de H
+
ni los
mecanismos por los que se rigen las bombas de H
+
. Los primeros experimentos de
Mitchell sugirieron que cada oxidoreductasa que bombea H
+
transloca 2 H
+
pero datos
recientes sugieren que el nmero de H
+
translocados podra ser superior.

Si las protenas respiratorias han de actuar como bombas de H
+
, los
transportadores electrnicos que bombean H
+
, como la NADH-UQ reductasa, deben
estar en contacto tanto con la cara interna como con la cara externa de la membrana,
han de ser protenas transmembrana. Adems, estos transportadores deben estar
situados de manera asimtrica en la membrana, con objeto de facilitar el transporte en
una direccin, hacia fuera. El transporte de H
+
ha de ser unidireccional.

Uno de los postulados de la teora quimiosmtica de Mitchell se refiere al papel
que desempea la fuerza protn motriz en la sntesis de ATP. La validez de esta parte
del modelo se vio confirmada con unos experimentos en los que se demostraba que el
establecimiento de un gradiente de H
+
en mitocondrias aisladas bastaba para impulsar
la sntesis de ATP, incluso en ausencia de transporte electrnico. Uno de estos
experimentos consista en incubar las mitocondrias en un medio alcalino durante varias
horas y luego transferirlas rpidamente a un medio cido. De este modo se consegua
que el interior de la mitocondria estuviese a un pH ms bsico. Si entonces se aadan
ADP y Pi se produca sntesis de ATP, de manera simultnea con la disipacin del
gradiente de pH.

___________________________________________________________________________

24
ATP sintasa (H
+
-ATPasa o complejo V)

Es el complejo enzimtico que acopla la sntesis de ATP al transporte de H
+
a
travs de la membrana interna mitocondrial.
Consta de dos componentes F
1
y F
0
, constituidos a su vez por varias cadenas
polipeptdicas.
F
1
tiene forma globular y est expuesto hacia la matriz mitocondrial.
Posee la actividad cataltica de sntesis de ATP a partir de ADP y Pi.
F
0
es integral de membrana y constituye un canal o poro que permite el
paso de H
+
.

F
1
, el componente cataltico de la ATP sintasa, puede ser aislado como una
ATPasa muy activa. Cuando F
1
est unido a F
0
la enzima cataliza la sntesis de ATP.
Sin embargo, F
1
puede liberarse fcilmente a la matriz (se asocia dbilmente a la
membrana). Este componente F
1
libre cataliza la hidrlisis de ATP, se comporta como
una ATPasa. Por esta razn la ATP sintasa se denomina tambin H
+
-ATPasa. F
1
posee
5 tipos de cadenas polipeptdicas diferentes, denominadas: , (tres copias de cada
una), , , (una copia de cada una)
3
3

El componente F
0
que forma el poro protnico est constituido por tres
subunidades a, b y c, con la estequiometra ab
2
c
10-12
. Una de las protenas del complejo
F
0
es el lugar de unin del inhibidor de la sntesis de ATP: la oligomicina (un antibitico
producido por Streptomyces). Las subunidades c, pequeas y muy hidrofbicas, se
disponen en forma de anillo.

La estructura de la ATP sintasa es la de una mquina rotatoria molecular. El
componente rotor (o giratorio) de esta mquina est formado por las subunidades c
12
,
y , mientras que las subunidades a, b
2
, ,
3

3
forman el componente esttor (o
estacionario). La corriente de protones a travs del poro F
0
provoca que el cilindro
formado por las subunidades c y la subunidad anclada roten alrededor del eje mayor
de , que es perpendicular al plano de la membrana.
Cul es el mecanismo mediante el que la energa potencial de la entrada de
H
+
a travs del canal F
0
se utiliza para impulsar la sntesis de ATP por F
1
?: los cambios
conformacionales inducidos por el paso de H
+
. F
1
contiene 3 subunidades y 3
subunidades , y las 6 protenas estn dispuestas como los gajos de una naranja, de
forma alternada: , , , , , . Cada uno de los 3 complejos posee una
conformacin claramente diferente: L, T, O, de unin dbil, fuerte o no unin a los
sustratos. El paso de H
+
a travs del canal F
0
provoca un cambio conformacional que
se transmite a F
1
. El complejo en conformacin L (loose) une dbilmente ADP + Pi y
al producirse el cambio conformacional pasa a conformacin T (tight), que es la forma
catalticamente activa, por lo que se genera ATP. Este ATP se libera en el siguiente
cambio conformacional (nuevo paso de H
+
), quedando as la subunidad en
conformacin O (open). Se requieren distintas conformaciones para la unin de ADP, la
sntesis de ATP y la liberacin de ATP. El paso dependiente de energa no es la
sntesis de ATP sino su liberacin de un lugar de unin fuerte. Cada rotacin se
___________________________________________________________________________

25
produce por el paso de H
+
, y nunca coinciden dos subunidades en la misma
conformacin. Los cambios de conformacin, esenciales en este mecanismo, estn
impulsados por el paso de protones a travs de la porcin F
0
de la ATP sintasa. As
pues, el proceso de fosforilacin oxidativa es posible gracias a los cambios
conformacionales experimentados por la ATP sintasa.

Desacoplamiento de la fosforilacin oxidativa.

El transporte electrnico (la oxidacin de NADH y FADH
2
mediante el O
2
) y la
fosforilacin oxidativa (la sntesis de ATP) estn por lo general fuertemente acoplados.
En estado de reposo, cuando la fosforilacin oxidativa es mnima, el gradiente
electroqumico de protones a travs de la membrana interna mitocondrial crece hasta el
punto que impide ms bombeo de protones y, por tanto, inhibe el transporte
electrnico.
A lo largo de los aos, no obstante, se han encontrado muchos compuestos que
desacoplan estos procesos, que son capaces de disociar el proceso de transporte de
electrones del proceso de generacin de ATP. Entre estos compuestos se encuentran
el DNP (2, 4-dinitrofenol) y el FCCP (trifluorocarbonilcianuro fenilhidrazona). Son
llamados agentes desacoplantes.
La presencia en la membrana interna mitocondrial de un agente que aumente la
permeabilidad de los protones hace que la fosforilacin oxidativa se desacople del
transporte electrnico, proporcionando una va para la disipacin del gradiente
electroqumico de protones que no requiere de sntesis de ATP. El desacoplamiento,
por lo tanto, permite que el transporte electrnico contine libremente, incluso cuando
se inhibe la sntesis de ATP.
El DNP y el FCCP son cidos dbiles lipoflicos que por lo tanto pasan a travs
de las membranas. En un gradiente de pH unen protones en el lado cido, difunden a
travs de la membrana y los liberan en el lado alcalino, disipando as el gradiente.
Por lo tanto, estos desacoplantes son ionforos transportadores de protones.
Disipan el gradiente protnico al transportar los protones al interior de las mitocondrias
a travs de lugares distintos del canal F
0
de la ATP sintasa.

El desacoplamiento de la fosforilacin oxidativa tiene una funcin fisiolgica:
generar calor.
La disipacin de un gradiente electroqumico de protones, generado mediante
transporte electrnico y desacoplado de la sntesis de ATP, produce calor.
Muchos mamferos, en especial los que nacen sin pelo y los que hibernan
poseen un tejido adiposo especializado, denominado tejido adiposo marrn (grasa
parda), en la parte alta de la espalda. Las mitocondrias de este tejido estn
especializadas en la generacin de calor a partir de la oxidacin de la grasa de forma
desacoplada de la fosforilacin. El color marrn del tejido se debe a la presencia de
grandes cantidades de mitocondrias y, por tanto, de citocromos cuyos grupos hemo
absorben fuertemente la luz visible. En estas mitocondrias el transporte de electrones
___________________________________________________________________________

26
est parcialmente desacoplado de la fosforilacin oxidativa al existir una protena
transmembrana en su membrana interna, la termogenina (o protena desacoplante,
UCP), que permite el paso de protones a favor de gradiente, disipando la energa
liberada en forma de calor, lo que contribuye a mantener la temperatura corporal del
recin nacido.

El proceso completo de generacin de calor por la grasa parda, que se
denomina termognesis sin tiritera (nonshivering thermogenesis) o termognesis por
desacoplamiento viene regulada por va hormonal. La noradrenalina inicia un
mecanismo en cascada que finalmente aumenta la hidrlisis de los triglicridos. Los
cidos grasos libres en el lado intermembrana de la mitocondria son quienes activan
directamente la UCP.
Existe otro tipo de termognesis, la termognesis con tiritera, en la que se
genera calor por contraccin muscular involuntaria.

En el reino vegetal la produccin de calor tambin es a veces necesaria. En el
caso de ciertas plantas sirve para volatilizar determinados compuestos olorosos que
atraen a los insectos, favoreciendo as la polinizacin.

Regulacin de la fosforilacin oxidativa. Control respiratorio.

Al igual que cualquier otro proceso metablico, la fosforilacin oxidativa slo
puede producirse en presencia de cantidades adecuadas de sus sustratos. Se controla
no por mecanismos alostricos, sino simplemente por la disponibilidad del sustrato.
Estos sustratos incluyen el ADP, el Pi, el O
2
y un metabolito oxidable que pueda
generar transportadores electrnicos reducidos, NADH o FADH
2
. En diferentes
situaciones metablicas cualquiera de estos cuatro sustratos puede limitar la velocidad
de la fosforilacin oxidativa.
El factor ms importante a la hora de determinar la velocidad de la fosforilacin
oxidativa es el nivel de ADP. La velocidad de consumo de oxgeno por las mitocondrias
aumenta notablemente cuando se aade ADP y recupera su valor inicial cuando el
ADP aadido se ha convertido en ATP. El control de la respiracin aerobia por el ADP
se denomina control respiratorio.

La dependencia que presenta la respiracin del ADP revela una caracterstica
general importante es este proceso: la respiracin est fuertemente acoplada con la
sntesis de ATP. No slo existe una dependencia absoluta de la sntesis de ATP con
respecto al flujo continuo de electrones de los sustratos al oxgeno, sino que el flujo
electrnico en las mitocondrias normales se produce tan slo cuando se sintetiza
tambin ATP. Este control respiratorio tiene sentido desde el punto de vista biolgico,
puesto que asegura que los sustratos no se oxiden de manera intil, sino slo cuando
exista una necesidad fisiolgica de ATP.

___________________________________________________________________________

27
Si las demandas energticas de una clula hacen que se consuma el ATP de
manera rpida, la acumulacin resultante de ADP estimular la respiracin, con la
consiguiente activacin de la resntesis de ATP. Y a la inversa, en una clula relajada y
bien nutrida, el ATP se acumula a costa del ADP, y la deplecin de ADP limita la tasa
de funcionamiento del transporte electrnico y de su propia fosforilacin a ATP. As
pues, la capacidad de generacin de energa de la clula est armonizada con sus
demandas energticas.
Experimentalmente, el control respiratorio se demuestra valorando la utilizacin
de O
2
en mitocondrias aisladas. En ausencia de una adicin de sustrato o ADP, la
captacin de O
2
causada por la oxidacin de los sustratos endgenos es lenta (ver
figura). La adicin de un sustrato oxidable, como el glutamato o el malato, slo tiene un
efecto pequeo sobre la tasa de respiracin. Sin embargo, si se aade ADP, la
captacin de O
2
se produce con una velocidad muy superior, hasta que todo el ADP
aadido se ha convertido en ATP, con lo que la captacin de O
2
vuelve a la situacin
basal. Esta estimulacin de la respiracin es estequiomtrica, es decir, la adicin del
doble de ADP hace que aumente al doble la cantidad de captacin de O
2
.

Transmisin de energa mediante gradientes de protones.

Los gradientes de protones guan muchos procesos celulares, adems de la
sntesis mitocondrial de ATP. En clulas vegetales la fotofosforilacin del ADP es
impulsada por un gradiente de protones transmembranal y ocurre mediante un
mecanismo notablemente parecido al de la fosforilacin oxidativa mitocondrial. En
clulas bacterianas el gradiente de protones se utiliza para impulsar la rotacin de los
flagelos que permite el movimiento de la clula.

Los gradientes de protones impulsan tambin el transporte activo mitocondrial:

Intercambio de ATP/ADP a cargo de la nucletido de adenina translocasa,
en el que se exporta el ATP generado y se importa su precursor, el ADP.
Dado que este sistema intercambia ATP, con una carga de -4, por ADP,
con una carga de -3, el proceso est dirigido por el potencial de
membrana.
Intercambio de Pi por la fosfato translocasa, que puede actuar en modo
antiporte, acoplando la entrada de fosfato (H
2
PO
4
-
) a la matriz con la
salida de un OH
-
, o en modo simporte, transportando HPO
4
2-
a la matriz
junto con 2 H
+
.
El efecto neto de los sistemas de transporte de nucletido de adenina y de
fosfato es acoplar el transporte hacia el interior de los sustratos de la fosforilacin
oxidativa, el ADP y el Pi, con la salida del producto, el ATP.

En cuanto a los sustratos de la oxidacin, el principal en el catabolismo de los
hidratos de carbono es el piruvato que, como el fosfato, se intercambia por OH
-
.

Apuntes TEMA 8 - Metabolismo Oxidativo

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Bioqumica.

Carmen Martnez URJC Metabolismo oxidativo

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