2 Congreso Nacional de Qumica Mdica Acevedo-Rocha y col.

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DISEO Y CONSTRUCCIN DE UN MICROARREGLO
DE CDNA EMPLEANDO MARCADORES TUMORALES
RELACIONADOS CON CNCER CERVICOUTERINO
Acevedo-Rocha CG
1
, Snchez-Garca G
1
, lvarez E
1
, Ocdiz-Delgado R
1
, Daz-Badillo A
1
,

Muoz
ML
1
, Tapia J
1
, Orozco E
2
, Luna-Arias JP
3
, Rodrguez P
4
, Mendoza J
4
, Snchez F
4
, Herrera JL
5
,
Zafra G
6
, Monroy A
7
, Lizano-Sobern M
8
, Maldonado VA
8
, Melndez-Zajgla J
8
, Dueas-Gonzlez
A
8
, Garca- Carranc A
8
, De la Garza JG
8
y Gariglio P
1
.
1
Depto. de Gentica y Biologa Molecular,
2
Depto. de Patologa Experimental,
3
Depto. de Biologa Celular,
4
Depto. de Fsica, CINVESTAV-
IPN.
5
CICATA-IPN.
6
Hospital Espaol/Universidad Westhill.
7
FES-ZARAGOZA, UNAM.
8
INCan SS.
E-mail: carlos.acevedo@gaia.org.mx
RESUMEN
Los microarreglos de DNA constituyen una de las herramientas ms verstiles y
poderosas que nos permiten medir en una escala global, los cambios en los patrones de
expresin gnica de distintos tipos celulares en diversas condiciones, tales como salud y
enfermedad. Gracias a esta tecnologa, se ha mejorado el diagnstico y la posibilidad de
tratar de manera adecuada a muchos pacientes, se han identificado nuevos marcadores
potenciales para terapia y existe un mejor entendimiento en los mecanismos moleculares
de las enfermedades, especialmente del cncer. Entre las primeras causas de muerte en
mujeres mexicanas, se encuentra el cncer cervicouterino; se estima que cada 2 horas,
en promedio, muere en el pas una mujer en edad productiva. Los tratamientos actuales
como la radioterapia y quimioterapia no toman en cuenta la actividad de genes
especficos para cada paciente y no permiten abatir satisfactoriamente los efectos de esta
enfermedad. Por ende, es necesario recurrir a tecnologas alternas como la determinacin
de los perfiles de expresin gnica empleando microarreglos para identificar marcadores
relevantes en la patognesis que sern de gran valor para el diagnstico, pronstico y
terapia dirigida contra el cncer cervicouterino desde una perspectiva molecular. En el
presente trabajo se evalu la funcionalidad de un sistema de produccin y anlisis de
microarreglos de cDNA, a travs del diseo de un microarreglo empleando marcadores
tumorales involucrados en el desarrollo del cncer cervicouterino. As, se determinaron los
perfiles de expresin en lneas celulares y se confirmaron dichos resultados mediante RT-
PCR en tiempo real. Finalmente, se establecieron las bases para el uso general de esta
tecnologa de alto rendimiento y en particular para el estudio de los perfiles de expresin
de los genes empleados. Lo anterior permitir no slo un mayor y ms un amplio uso de
la tecnologa de los microarreglos de cDNA en poblaciones con recursos econmicos
limitados, sino tambin el estudio a nivel transcripcional de la enfermedad oncolgica ms
comn en la mujer mexicana.
Palabras Clave: Cncer Cervicouterino; Microarreglos de cDNA, Marcadores Tumorales.
INTRODUCCIN
Los microarreglos de DNA son un conjunto de secuencias (que pueden
corresponder a miles transcritos) ordenadas en una superficie plana. Hay dos tipos de
microarreglos de DNA: Los microarreglos de DNA complementario (cDNA) (1) y los
microarreglos de oligonucletidos (2); los ms conocidos son los de la empresa
Affymetrix. Por otro lado, el mRNA de un tejido de inters se convierte en cDNA y se
marca radiactiva o fluorescentemente; mediante la formacin de hbridos entre el cDNA
marcado y la sonda (cDNA u oligonucletidos no marcados y unidos a la superficie) y
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varios mtodos de deteccin, se identifican los genes expresados diferencialmente entre
dos muestras. Las distintas intensidades se pueden transformar en niveles de transcritos
correspondientes a cada muestra. Los datos numricos se analizan con un ordenador y
mediante algoritmos matemticos se determinan los genes que son capaces de definir un
Patrn o Perfil de Expresin Gnica (PEG) con relacin al fenotipo de las distintas
muestras. Dependiendo de las intensidades en las que se expresan los distintos genes
del PEG, la muestra tumoral o normal adquiere entonces un Retrato Molecular o Firma
de Expresin particular.
Microarreglos y Cncer. Gracias a la determinacin de perfiles de expresin
gnica, se ha podido llegar a una nueva clasificacin y subclasificacin molecular del
cncer, as como a una prediccin clnica y diagnstico de muchos tipos de cncer (3).
Asimismo, mediante los microarreglos de DNA se han identificado nuevos marcadores
potenciales para terapia y existe un mejor entendimiento de los mecanismos moleculares
del cncer (4). Hay estudios clsicos donde se ha demostrado el potencial de la
tecnologa de los microarreglos; el primero de ellos se hizo para la clasificacin molecular
precisa de las leucemias agudas mediante un patrn de expresin de 50 genes (5). Un
excelente ejemplo del uso de los perfiles de expresin gnica se ha demostrado en el
pronstico del cncer de mama. Por medio de un microarreglo de 25,000 oligonucletidos
y 78 muestras de tumores primarios de mama obtenidos de pacientes con estado de
ndulos linfticos negativo a metstasis, se identific una firma de mal pronstico con
tan solo 70 genes (6). Esta firma corresponde a una alta probabilidad de desarrollar
metstasis a corto plazo y muy probablemente morir por esta enfermedad. Lo interesante
de este estudio radica en que los tumores no se hacen buenos o malos conforme
progresa la enfermedad, como se propona hace pocos aos con el modelo del desarrollo
clonal, sino que una clula maligna desde muy temprano est predestinada a provocar
metstasis. Gracias a dicha firma gnica, se puede decidir qu pacientes deben tomar la
terapia adyuvante que puede consistir en tamoxifeno. Este mismo estudio fue validado
con 217 muestras nuevas, en las que reconfirmaron que la firma de 70 genes es el mejor
criterio para decidir si una paciente requiere terapia adyuvante o no (7). En el presente
existen kits comerciales que sirven para tomar esta decisin aunque no han sido
aprobados del todo y su precio es alto (8). Tambin existen distintas plataformas de
microarreglos de DNA que permiten tratar, de una forma personalizada, a pacientes con
cncer de mama (9).
Microarreglos y Cncer Cervicouterino. El origen gentico del cncer
cervicouterino (CaCu) est ligado a la infeccin por los Virus del Papiloma Humano de
Alto Riesgo (HR-HPVs) como los tipos 16 y 18. El genoma de estos virus se conforma de
8 oncogenes, 2 de los cuales codifican para las oncoprotenas de expresin temprana E6
y E7, que se unen e inhiben la actividad de las protenas antioncognicas TP53 y pRb,
respectivamente, desregulando as el balance necesario entre la proliferacin y la
apoptosis, lo cual promueve el desarrollo de cncer. Estos desbalances se han estudiado
a nivel transcripcional y de una manera global mediante microarreglos, empleado
muestras clnicas y lneas celulares derivadas de CaCu, tanto para el estudio de la
carcinognesis como de la terapia. Estos estudios han aportado valiosa informacin sobre
los mecanismos moleculares del CaCu y de esta manera se han identificado muchos
genes que participan en eventos clave del desarrollo de esta enfermedad como son la
infeccin por los HR-HPVs, la integracin de los genomas virales en el genoma celular y
el progreso de las lesiones de origen escamoso, glandular o ambos. As, mediante el
establecimiento de perfiles de expresin gnica, no nada ms se ha logrado clasificar y
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subclasificar molecularmente el CaCu sino que tambin se ha podido identificar
marcadores tumorales (10).
Marcadores Tumorales en CaCu. Toda la informacin disponible en la
transcriptmica del CaCu, usando un lenguaje universal, ha permitido la identificacin de
genes cuyos niveles de expresin son comunes entre varios estudios. Lo anterior sugiere
que dichos genes pueden tener un papel como marcadores tumorales (MTs) para el
diagnstico, pronstico y terapia dirigida del CaCu; algunos de stos son el inhibidor de
cinasas dependientes de ciclinas p16, el gen supresor de tumores p21 y el gen
survivina; respectivamente (10).
METODOLOGA
Seleccin de Marcadores Tumorales. Para la seleccin de los genes se tomaron
en cuenta diversos criterios: Funcin, nmero de reportes de anlisis global
(determinados con microarreglos de DNA) y nmero de reportes convencionales
(determinados con tcnicas diferentes a los microarreglos).
Produccin y Anlisis del Microarreglo. Amplificacin de sondas: En el laboratorio
de Oncologa Molecular del CINVESTAV-IPN se cultivaron las lneas celulares ViBo
(HPV-), SiHa (HPV16+) y HeLa (HPV18+), todas derivadas de CaCu. Las lneas celulares
se dejaron crecer hasta una confluencia entre 80 y 90% y se extrajo el RNA total mediante
el mtodo de TRIzol (Invitrogen, USA) segn las instrucciones del fabricante. Se
sintetiz el cDNA in vitro a partir del RNA total empleando la enzima transcriptasa reversa
Superscript II RNAse H- RT (Invitrogen, USA) segn las instrucciones del fabricante. A
partir del cDNA se amplificaron los productos de PCR (sondas) y se purificaron con ayuda
del kit: GFX PCR and Gel Purification (Amersham Biosciences, UK) segn las
instrucciones del fabricante. Impresin de sondas: Se emple el robot GenTAC G
3

(Genomic Solutions, USA) y laminillas comerciales, planas, de vidrio y cubiertas
qumicamente con gama-amino-propilsilano (Corning, USA) para fijar las sondas. Marcaje
de los blancos: El cDNA de las lneas celulares antes mencionadas se marc
fluorescentemente mediante el kit: Fluoroscript cDNA labelling System (Invitrogen,
USA) segn las instrucciones del fabricante. En la reaccin se incorporaron directamente
los nuclotidos modificados Cy3 y Cy5 (Amersham Biosciences, UK). El cDNA marcado
se purific mediante el kit: CyScribe GFX Purification (Amersham Biosciences, UK)
segn las instrucciones del fabricante. Hibridacin: Las laminillas se colocaron en la
cmara de hibridacin (Corning, USA) con los blancos en solucin. Finalmente se obtuvo
la imagen con el escner GeneTAC LS IV (Genomic Solutions, USA).
RT-PCR en Tiempo Real (qRT-PCR). Se seleccionaron algunos genes y se
determinaron sus niveles de expresin mediante el sistema 7300 Real-Time PCR
(Applied Biosystems, USA), segn las instrucciones del fabricante.
RESULTADOS
Diseo y Construccin del Microarreglo. En la Figura 1 se observa el microarreglo
diseado, cada uno consta de 10 MTs (negro), 3 controles positivos (amarillo) y 3
controles negativos (rosa); por duplicado. Los criterios de seleccin de los MTs se
describen brevemente en la Tabla 1.
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Figura 1. Microarreglo diseado. Los controles positivos
incluyen: Un pool de los MTs (1), el gen constitutivo
B2M (11) y GAPDH (13). Los negativos: Secuencias
repetitivas de DNA (4); solucin de impre-sin sin DNA
(6) y el gen RABB de amiba (no relacionado con el
humano) (16).
Tabla 1. MTs seleccionados.


T
a
b
l
a

1
.

s
e
l
e
c
c
i
o
n
a
Figura 2. Hibridacin. El cDNA de HeLa se ha
marcado con Cy5.

Tabla 2. Perfiles de expresin
+++ = mucha expresin, ++ = expresin considerable,
+ = expresin detectable, - = sin expresin
Perfiles de Expresin en Lneas Celulares. En la Figura 2 se observa el resultado
de la hibridacin entre las sondas del microarreglo y los blancos marcados
fluorescentemente de la lnea celular HeLa. Los niveles de expresin para las distintas
lneas celulares se encuentran en la Tabla 2.
Genes
c
cc
-
--
m
mm
y
yy
c
cc


p
pp
1
11
6
66


B
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M
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1
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u
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# Reportes
Convencionales
1
5
0

1
2
5

1
5

3

4
0

-

8
0

-

-

-

# Reportes de
Anlisis Global
1

6

5

2

2

1

6

2

1

2

Tipo
de
Marcador
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o
n

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Figura 3. qRT-PCR. Niveles de
expresin relativos para algunos
MTs seleccionados.
Resultados con qRT-PCR. En la Figura 3 se observan los niveles de expresin
relativos de algunos MTs en las lneas celulares ViBo, SiHa y HeLa.
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
1. El sistema de produccin y anlisis de micro-
arreglos de cDNA funciona satisfactoriamente.
2. Se estandarizaron los mtodos empleados en la
produccin y anlisis del microarreglo.
3. Los resultados obtenidos por PCR en tiempo real
confirman parcialmente los resultados obtenidos
con el microarreglo para algunos marcadores
tumorales.
4. Se determinaron diferencias entre los perfiles de
expresin de las lneas celulares ViBo, SiHa y
HeLa con base en el microarreglo diseado.
5. Es factible la construccin de un microarreglo
con una mayor cantidad de marcadores tumorales.
La creacin de un microarreglo conformado por marcadores tumorales clave en el
desarrollo del CaCu podr ser una herramienta til tanto para el diagnstico como el
pronstico molecular de esta enfermedad y permitir, potencialmente, comprender ms de
esta enfermedad a nivel transcripcional.
REFERENCIAS
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complementary DNA microarray. Science 1995; 270:467-70.
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arrays. Nat Biotechnol. 1996; 14 (13):1675-1680.
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cncer cervicouterino: Identificacin de marcadores tumorales. Ginecol Obstet Mx (en prensa).