CIDOS NUCLEICOS

CIDOS NUCLEICOS
Los cidos nucleicos estn formados por nucletidos Los cidos nucleicos, cido desoxirribonucleico DNA y cido ribonucleico RNA, son macromolculas encargadas de almacenar y transferir la informacin gentica. Ambos estn formados por unidades llamadas nucletidos, cuya representacin aparece a continuacin.

Al analizar el producto de la hidrlisis total de un nucletido se obtienen siempre tres componentes: una pentosa, una base nitrogenada y un fosfato. La unin de estas tres molculas en relacin 1:1:1 constituye un nucletido, unidad bsica o monmero de los cidos nucleicos. La pentosa puede ser: ribosa o desoxirribosa. La diferencia entre ambas reside en que el grupo hidroxilo (-OH) del carbono 2 de la ribosa es sustituido por un hidrgeno en la desoxirribosa. Los nucletidos con ribosa (ribonucletidos) son los constituyentes del RNA, mientras que aquellos que tienen desoxirribosa (desoxirribonucletidos), constituyen el DNA. Los carbonos (C) de las pentosas se representan como C1 , C2, etc., a diferencia de las bases nitrogenadas que se designan como C1, C2, etc.

Las bases nitrogenadas, son una familia de molculas cclicas derivadas de dos anillos bsicos: purina y pirimidina. El DNA contiene dos bases pricas, adenina (A) y guanina (G) y dos bases pirimidnicas citosina (C) y timina (T). Las bases pricas son las mismas en el RNA y DNA, sin embargo en el RNA las bases pirimidnias, son la citosina y el uracilo (U)

32

CIDOS NUCLEICOS

Una base, una pentosa y un fosfato forman un nucletido En la formacin de un nucletido, la base nitrogenada se une al C 1 de la pentosa mediante un enlace Nglucosdico mientras que el grupo fosfato se une al C 5 de la pentosa mediante un enlace ster.

Los nucletidos pueden contener uno, dos o tres fosfatos, denominndose respectivamente nucletido mono, di o tri-fosfato. Algunas funciones de los nucletidos Una funcin de los nucletidos es el almacenamiento de energa qumica, logrado a travs de enlaces de alta energa.

El ATP es el nucletido ms usado a nivel celular, aunque el UTP, GTP, CTP y TTP se emplean tambin como donadores de energa en reacciones especficas y en la sntesis de cidos nucleicos. Otra funcin de los nucletidos es formar parte de las coenzimas. Muchas coenzimas, como el NAD, NADP y el FAD son dinucletidos que participan en reacciones redox. Estas molculas las estudiaremos ms adelante. La frmula de la coenzima A aparece abajo.

33

CIDOS NUCLEICOS

Muchas molculas sealizadoras especficas en la clula son nucletidos.

Una de las molculas con funcin de segundo mensajero ms comn es el AMP cclico (AMPc). El AMPc tiene funciones reguladoras en prcticamente todas las clulas animales, modificando actividades enzimticas en el interior celular, en respuesta a cambios extracelulares. El AMPc se forma a partir del ATP por la enzima adenilato ciclasa, que cataliza la esterificacin del fosfato 5 con el -OH 3. Esta enzima est asociada a la cara interna de la membrana plasmtica.

Los nucletidos se unen entre s para formar polinucletidos Los cidos nucleicos, DNA y RNA, son cadenas de desoxirribonucetidos o ribonucletidos respectivamente, unidos entre s por enlaces fosfodister entre los C 5y 3 de las pentosas de nucletidos consecutivos. De esta forma el extremo 5 de la cadena polinucleotdica tendr un grupo fosfato libre y el extremo 3 un grupo hidroxilo libre. La secuencia lineal de los nucletidos de un cido nucleico se abrevia con la letra correspondiente a la abreviatura de cada base nitrogenada comenzando desde la izquierda, por con el extremo 5de la cadena. As, el extremo 5 hace referencia al primer nucletido de la cadena y el extremo 3 al ltimo. La secuencia de bases constituye lo que se denomina estructura primaria y se lee en sentido 5-3de la cadena de nucletidos.

El DNA est formado por dos cadenas de desoxirribonucletidos En 1953 Watson y Crick publicaron un modelo de la estructura tridimensional del DNA y concluyeron que consista en dos cadenas de polinucetidos enrolladas alrededor del mismo eje, formando una doble hlice. La estructura primaria del DNA est definida por la secuencia de las bases en la cadena del polinucletido. Conocer esta secuencia de bases implica poder descifrar la informacin gentica del DNA. Las principales caractersticas de la molcula son: La polaridad de estas dos cadenas es opuesta, es decir el extremo 5de una cadena coincide con el extremo 3de la otra: son antiparalelas. La estructura fosfato-pentosa conforma el exterior de la hlice, mientras que las bases se sitan hacia el interior formando un ngulo recto con el eje de la hlice. Esta disposicin permite que las bases de ambas cadenas queden enfrentadas en el interior de la doble hlice. 34

CIDOS NUCLEICOS

Las dos hebras de la hlice se mantienen unidas por los puentes de hidrgeno entre las bases complementarias: la adenina forma dos puentes de hidrgeno con la timina y la guanina forma tres con la citosina, como se observa a continuacin.

Distintos factores que contribuyen a estabilizar la doble hlice a. Puentes de hidrgeno entre las bases complementarias. Los puentes de hidrgeno son interacciones dbiles pero estn presentes en gran cantidad, lo que permite estabilizar la estructura secundara del ADN. b. Interacciones hidrofbicas. Las bases son molculas aromticas planas y de naturaleza hidrofbica. Esta caracterstica permite interacciones hidrofbicas entre las bases enfrentadas de cada hebra. c. Cargas de los grupos fosfatos. Los grupos fosfatos tienen carga negativa que se encuentran en el exterior de la molcula, donde pueden interaccionar con el agua, una molcula polar sin carga. El DNA se desnaturaliza por efecto de la temperatura Las bases nitrogenadas estn orientadas hacia el centro de la molcula. La especificidad en el apareamiento de las bases se conoce como complementariedad. Las bases de una de las cadenas de polinucletidos son siempre complementarias de las bases de la otra cadena.

35

CIDOS NUCLEICOS

Temperaturas de 80 90C, as como valores de pH extremos, provocan la desnaturalizacin del DNA que consiste en la ruptura de los puentes de hidrgeno entre bases apareadas y la prdida de las interacciones hidrofbicas entre las bases apiladas. Como resultado de este proceso la doble hlice de DNA se desenrolla. Cuando la temperatura o las condiciones de pH retornan a valores fisiolgicos, los segmentos de DNA desapareados vuelven a enrollarse, es decir, sus bases complementarias se aparean nuevamente y se obtiene la estructura de doble hlice. Este proceso se denomina renaturalizacin del DNA. En el proceso de desnaturalizacin los enlaces covalentes del DNA se mantienen inalterados. Los DNA de distintos orgenes tienen una temperatura de desnaturalizacin o temperatura de fusin caracterstica que depende de la composicin de bases. Cuanto ms alto sea el porcentaje de bases G-C mayor ser la temperatura de fusin. Esto se debe a que el par de bases G-C con tres puentes de hidrgeno es ms estable que el par A-T y por lo tanto requiere ms energa calrica para disociarse. La transicin de DNA de doble hlice a monohebra puede detectarse por el efecto hipercrmico, que se debe al incremento de absorcin de luz UV por las bases del DNA.

Curva de Fusin. La absorbancia a 260nm de una solucin de DNA aumenta cuando se desnaturaliza.

Curvas de Fusin de diferentes DNA con distinto contenido de G+C

El DNA est asociado a protenas que permiten su empaquetamiento Tanto en procariotas como en eucariotas el DNA se condensa, proceso que permite una adecuacin a las dimensiones de las clulas. Por ejemplo, el DNA de la bacteria E. Coli, que forma un slo cromosoma debe condensarse unas 1000 veces. En eucariotas este proceso es ms evidente, debido al mayor contenido de DNA de sus clulas y consiste en el enrollamiento de la doble hlice sobre s misma, para dar lugar a fibras ms cortas y gruesas: DNA superenrollado. El DNA con grupos fosfatos cargados negativamente se asocia con molculas cargadas positivamente, para estabilizar su estructura. Estas molculas pueden ser protenas denominadas histonas, a otras protenas bsicas. Las histonas son protenas de pequeo tamao, con una alta proporcin de aminocidos bsicos que a pH neutro tienen carga positiva (lisina o arginina), lo que les permite interaccionar con el DNA, independientemente de la secuencia de nucletidos. La doble hlice se va enrollando a intervalos regulares alrededor de un complejo de histonas, dando lugar a los denominados nucleosomas. Cada nucleosoma, est formado por un segmento de DNA superenrollado de unos 200 pares de bases sobre un octmero de histonas. Las histonas son de cinco tipos: H1, H2A, H2B, H3 y H4. Un nuclesoma est formado por dos molculas de las histonas H2A, H2B, H3 y H4 segn se observa en la figura. La histona H1 se asocia con el DNA internucleosmico y favorece la aproximacin de nucleosomas adyacentes.

36

CIDOS NUCLEICOS

Sin embargo el DNA se debe condensar mucho ms para adaptarse al tamao celular. En la figura se resumen las sucesivas etapas de condensacin del DNA, desde la doble hlice a los cromosomas. Los nucleosomas constituyen las unidades bsicas de la cromatina.

El RNA est formado por ribonucletidos Los nucletidos del RNA se denominan ribonucletidos y se unen entre s del mismo modo que se unen los desoxinucletidos en el DNA: los nucletidos se unen por enlaces fosfodister entre el fosfato C5de la pentosa y el OH del C 3 de otra pentosa. Las molculas de RNA, en general constan de una cadena nica polinucleotdica y si bien no adoptan estructura de doble hlice como en el DNA, pueden tener regiones de apareamiento de bases complementarias en la misma hebra, como se muestra ms adelante en rRNA. Si bien en algunos los casos el RNA constituye el material gentico, como en algunos virus, las funciones del RNA estn asociadas a la sntesis de protenas. Los principales tipos de RNA son el mensajero (mRNA), el ribosmico (rRNA), el de transferencia (tRNA) y el nuclear de pequeo tamao (snRNA). En la tabla se resumen las funciones de cada tipo de RNA.

37

CIDOS NUCLEICOS

RNA mensajero: transportador de la informacin gentica El mRNA es una nica cadena polinucleotdica que resulta de la transcripcin de un gen, es decir de un segmento de DNA. La funcin del mRNA es transportar la secuencia de nucletidos de un gen determinado hasta el ribosoma, donde ocurre la traduccin del mRNA en el proceso de sntesis proteica. El RNA ribosmico asociado a protenas forma los ribosomas Los ribosomas estn formados por protenas asociadas a molculas de RNA. En el cuadro que aparece abajo se indican las diferencias entre ribosomas eucariotas y procariotas as como el tamao de los rRNA que los conforman. El rRNA contribuye a dar al ribosoma una estructura capaz de acomodar al mRNA y a la protena durante su proceso de sntesis. Los ribosomas de las clulas eucariotas son muy similares a las procariotas en cuanto a diseo y funcin. Ambos estn formados por una subunidad grande y una pequea que se acoplan formando un ribosoma.

Observe en la figura que aparece a continuacin las estructuras espaciales complejas que adoptan los rRNA, donde se ve la alternancia de regiones apareadas y no apareadas en forma de bucles.

RNA de transferencia: adaptador entre los nucletidos y los aminocidos Los tRNA son molculas de tamao pequeo que tienen aproximadamente unos 80 nucletidos. Estas molculas se pliegan formando una estructura tridimensional compleja, presentan 4 segmentos en doble hlice, que en una representacin sencilla tiene un parecido con una hoja de trbol, segn se ve en la figura. La forma en hoja de trbol se pliega sobre si misma y adopta una estructura ms compacta y estable en forma de L, tambin representada en la figura.

38

CIDOS NUCLEICOS

Modelo de tRNA en forma de hoja de trbol.

Modelo de tRNA en forma de L.

Las principales caractersticas de la molcula de tRNA se resumen a continuacin: Regin anticodn, triplete de bases complementario al codn de la molcula de mRNA. Extremo 3, es una regin corta de tRNA de simple hebra, que interviene en la unin de la molcula de tRNA con el aminocido correspondiente. Los tRNA contienen bases que no son comunes en otros RNA como la pseudouridina, dihidrouridina e inosina. Estas bases se generan por modificaciones de las bases comunes, posteriores a la sntesis del tRNA. El extremo 5 presenta una guanina fosforilada.

snRNA: pequeas molculas de RNA nuclear El snRNA (small nuclear) contiene pocos nucletidos y est asociado a protenas formando complejos. Su localizacin es en el ncleo celular y como se ver ms adelante estn implicados en el proceso de maduracin del mRNA: participan en el corte de intrones y ensamble de exones. TECNOLOGA DEL DNA RECOMBINANTE El desarrollo de la tecnologa de DNA recombinante o ingeniera gentica, ha cambiado el concepto de la biologa dado que ha permitido, no solo comprender a nivel molecular los seres vivos, sino modificar en forma controlada su informacin gentica. Los trabajos de Watson y Crick que permitieron descifrar la estructura del DNA en los aos -50 fueron el punto de partida para el desarrollo de esta nueva rama de la biologa. Al mismo tiempo se han dado importantes desarrollos cientficos que son fundamentales en la tecnologa del DNA recombinante: 1. La capacidad de introducir DNA en una clula, proceso conocido como transformacin, as como la seleccin de las clulas transformadas. 2. Purificacin de DNA con altos rendimientos. 3. Descubrimiento y purificacin de enzimas de restriccin y enzimas de modificacin del DNA. Bsicamente con estos tres procedimientos se han podido modificar genticamente organismos como bacterias, plantas y animales con el objetivo que, tras la introduccin de un gen forneo no presente en su genoma, el organismo sea capaz de expresar la protena codificada por dicho gen. Si bien existen numerosos ejemplos de las aplicaciones biotecnolgicas derivadas de la tecnologa del DNA recombinante, solo vamos a hacer referencia a los procedimientos ms usados para generacin de plantas transgnicas. 39

CIDOS NUCLEICOS

El principal objetivo de la biotecnologa vegetal es la generacin mediante ingeniera gentica de nuevas variedades de plantas que presentan alguna caracterstica que mejore su valor frente a la especie ya existente. Por ejemplo, plantas resistentes al ataque de diferentes patgenos y/o resistentes a determinados herbicidas, asi como plantas capaces de tolerar a condiciones adversas de cultivo. Un ejemplo particular del uso de las tcnicas de DNA recombinante es el desarrollo de lneas de maz transgnico. Estas plantas transgnicas tienen la capacidad de producir molculas con accin insecticida en forma endgena y se denominan maz Bt. La resistencia al ataque de insectos como los taladros fue lograda por la introduccin en el genoma del maz del gen que codifica para la protena CryIAb. La fuente natural de esta protena es una bacteria, Bacillus thuringensi, que ha sido empleada en forma de aspersin para el control de estos insectos en el cultivo de maz desde hace ms de 30 aos. Para lograr las plantas transgnicas se debe introducir primero el gen de inters en un vector: un plsmido. Los plsmidos son DNA extracromosmico que se encuentran con frecuencia en bacterias y se usan en ingeniera gentica para clonar el gen de inters, obtenindose un plsmido recombinante. Posteriormente el plsmido recombinante se usa para ser transferido a la clula hospedadora. Para llevar adelante la introduccin del gen Bt al vector es necesario: a) cortar el DNA de inters con enzimas de restriccin, en nuestro ejemplo el gen Bt, b) cortar el plsmido vector con enzimas de restriccin para incorporar el gen en cuestin, c) unir el DNA de inters al plsmido vector. Las enzimas de restriccin o endonucleasas son enzimas de origen bacteriano, que reconocen secuencias especficas en el DNA e hidrolizan el enlace pentosa-fosfato, produciendo un corte en la molcula de DNA. El esqueleto pentosa-fosfato se rompe entre dos bases en una hebra y en otras dos bases equivalentes en la otra hebra lo que puede generar un corte a distinta altura en cada hebra y formar extremos cohesivos como se ve en la figura.

En la actualidad se conocen cientos de enzimas de restriccin y en la mayora de los casos la secuencia que se reconoce es un palndromo o secuencia simtrica de 4, 5, 6 o ms nucletidos. Si se digiere el DNA de inters y el vector plasmdico con la misma enzima de restriccin se generaran extremos cohesivos complementarios y de este modo las molculas de DNA pueden aparear sus bases. De todas formas para que se una el esqueleto pentosa fosfato se necesita una enzima de modificacin del DNA denominada DNA ligasa. La ligacin es un paso fundamental para la generacin de DNA recombinante ya que permite la unin del esqueleto de DNA de distinto origen. Esta enzima sella tanto extremos cohesivos como romos y requiere la presencia de un grupo fosfato en el extremo 5y de un OH en un extremo 3. Como consecuencia de la accin de la ligasa se producirn molculas del vector, es decir del plsmido bacteriano, que contienen el gen de inters, en este caso el gen Bt. Una vez obtenido el plsmido recombinante, se procede a transformar las clulas maz. Con el plsmido recombinante, que lleva el gen de inters, se debe introducir en clulas vegetales, para lo que hay diferentes estrategias, una es usar una bacteria que infecta plantas: Agrobacterium. A partir de 40

CIDOS NUCLEICOS

una clula transformada con el gen exgeno se obtiene una planta que se denomina transgnica, que son clones respecto a la clula original. El proceso se simplificado se representa a continuacin.

Las variedades de maz transgnicos con la protena Bt han demostrado ofrecer un control eficaz de los taladros de maz, primero en ensayos de campo que se viene realizando desde comienzo de los 90, y posteriormente en la experiencia comercial, con millones de hectreas cultivadas desde 1997. Electroforesis de DNA Cuando se aplica un campo elctrico a molculas con carga neta, stas se desplazarn hacia el polo contrario a su carga. En este principio se basa la tcnica denominada electroforesis y el desplazamiento de la molcula en cuestin depende de su carga y su tamao. Un equipo de electroforesis consta de una fuente de poder que genera el campo elctrico y una cuba, recipiente con dos compartimentos con un electrodo cada uno. En la foto que aparece abajo se indican los componentes del sistema.

41

CIDOS NUCLEICOS

Los geles van en la cuba sumergidos en un tampn, con pH superior a 8. De esta forma, las molculas de DNA o RNA sometidas a electroforesis se desplazarn al polo positivo, porque poseen carga neta negativa a pH superiores a 5. Cuando la electroforesis se realiza en un gel, este se comporta como un tamiz y permite separar molculas segn su tamao y forma. As una mezcla de molculas de DNA de diferente tamao, que pueden resultar de una reaccin con enzimas de restriccin se separarn en funcin de su tamao. En la figura que aparece a continuacin se observa un gel de agarosa teido con bromuro de etidio, donde se visualizan bandas que corresponden a fragmentos de DNA con diferente masa molecular.

Las molculas de DNA de mayor tamao migran menos que las molculas de DNA de menor tamao, que quedan ms prximas al polo positivo. El empleo de un marcador de masa molecular conocido permite calcular el tamao de las bandas de DNA.

42