METODOLOGIA LOCALIZACION DEL PROYECTO Esta investigacin fue de tipo experimental cuantitativo, la cual se desarroll en dos lugares importantes:

: Las muestras de queso costeo pasteurizado fueron elaboradas en la Planta Procesadora del SENA, ubicada en el Centro de la innovacin, la tecnologa y los servicios, sede la Gallera kilmetro 5 va a Sampues, jurisdiccin del municipio de Sincelejo, Departamento de Sucre. Los anlisis microbiolgicos se realizaron en la Planta de Operaciones Unitarias de la Universidad de Sucre, sede Granja Los Pericos, la cual se encuentra localizada a 9 12 40 Latitud Norte y 75 24 10.7 Longitud Oeste, del meridiano de Greenwich a una altura de 213 msnm, presenta una humedad relativa del 77% y una temperatura promedio de 29C. 1

Figura 4. Ubicacin geogrfica de la Granja Los Pericos, Universidad de Sucre.

Fuente: Vista satelital. Google earth.

METODOS Y PROCEDIMIENTOS 1 Materiales. Los materiales y equipos utilizados para los ensayos durante el desarrollo experimental del proyecto son:

COLOMBIA. Gobernacin de Sucre. Disponible en internet: http://sucre.gov.co/index.shtml

 Leche de vaca, fue suministrada por COLQUESOS S.A, (sede Sincelejo) estandarizada con un porcentaje de grasa de 4%. Para el proceso de elaboracin de quesos durante la coagulacin se emple Cuajo lquido, sal refinada para el proceso de salazn y carbonato de calcio para neutralizar o reducir la acidez. METODOS NMP, SIEMBRA EN PLACA LO Q SE UTILIZO MATERIALES Y EQUIPOS PROCEDIMIENTOS Para el anlisis microbiolgico sern utilizados los procedimientos establecidos y recomendados por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas (ICONTEC) para quesos frescos y los exigidos por el Ministerio de salud de Colombia. Las tcnicas utilizadas sern las recomendadas y aprobadas por el Instituto de vigilancia de medicamentos y alimentos, INVIMA, de la Repblica de Colombia. 6.1. Pesaje de las muestras El pesaje de las muestras ser dependiendo del tipo de anlisis que se utilizara, variando desde 5 gr hasta 25 gr, de la siguiente forma:

6.1.1 Para Aerobios Mesfilos, Coliformes Totales, Coliformes Fecales, Staphylococcus aureus, Mohos y levaduras: Se pesaron 10 gr de queso costeo y se diluyeron en 90 ml de agua peptonada estril, se homogeniz suavemente en licuadora previamente esterilizada. 6.1.2 Para investigacin de Salmonella sp Se pesaran 25 gr de queso costeo y se diluirn en 225 ml de caldo BHI y se homogenizara. 6.2. Preparacin de diluciones A partir del homogenizado en agua peptonada estril se harn 4 diluciones consecutivas en tubos que contienen 9 ml de agua peptonada estril para el anlisis respectivo. Para el caso de salmonella se continuara con el protocolo que se describe a continuacin. 6.3. Anlisis microbiolgico del queso costeo

Los anlisis microbiolgicos que se llevaran a cabo son los siguientes: 6.3.1 Recuento de Aerobios Mesfilos 6.3.1.1 Siembra Se pipeteara por duplicado en cajas petri cantidades de 1 ml de las diluciones (103, 10-4) que se le realizara a las muestras. Posterior a esto se vertern 20 ml aproximadamente de agar S.P.C (Stndar Plate Cound) fundido y estril, a una temperatura no superior a 45 C que no lesione los microorganismos. Posteriormente se homogenizara el inculo con el medio fundido y girando las cajas petri con movimientos parecidos y contrarios al de las manecillas del reloj. Una vez solidificado el agar, se invierten las cajas petri y se incubara de 35 - 37 C durante 48 horas en condiciones de aerobiosis. Recuento de Mohos y Levaduras 6.3.2.1 Siembra Se pipeteara por duplicado en cajas petri cantidades de 1 ml de las diluciones (103, 10-4), luego rpidamente se vertern en cajas de petri 20 ml de agar O.G.Y (Oxitetraciclina - extracto de levadura-glucosa) fundido a 45 C aproximadamente, se homogenizara inmediatamente el inculo con el agar con movimientos circulares repetitivos, en sentido y en contra de las manecillas del reloj. Al cabo de unos minutos ya solidificado el agar, se invierten las cajas petri y se incubara a 25 - 28 C durante 3 - 5 das en aerobiosis. 6.3.3 Recuento de Estafilococos Coagulasa Positiva 6.3.3.1 Siembra Se pipeteara por duplicado en cajas petri cantidades de 1 ml de las diluciones (104, 10-5) de las muestras, seguidamente se vertern de 20 ml aproximados de agar Baird Parker con solucin de clara de huevo y telurito de potasio, fundido y estril, se homogenizara. Al cabo de haberse solidificado el agar, se invierten las cajas petri y se incubaran 35 - 37 C durante 48 horas en aerobiosis. 6.3.3.2 Produccin de Coagulasa Se elegirn colonias presuntivas de estafilococos desarrolladas en el agar Baird Parker y con un asa, se inocularan en 5 ml de caldo B.H.I y se incubaran a 37 C durante 24 horas. Posteriormente al cabo de las 24 horas, se pasaran 0.5 ml del cultivo en tubos de ensayo pequeos y se les agregara 0.5 ml de plasma de conejo, se incubaran a 37 C con monitoreo constante durante 4 - 24 horas. Finalmente se examinaran los tubos y se registraran aquellos que muestran coagulacin total o presencia de cogulos suspendidos y se darn como positivos para la produccin de la enzima coagulasa.

6.3.4 Recuento de Coliformes Totales y Fecales 6.3.4.1 Siembra Se pipeteara 1 ml de cada una de las diluciones homogenizadas (10-1, 10-2, 10-3) en tubos taparroscas, con tubos de fermentacin de Durham invertidos, con 10 ml de caldo Brilla, utilizando tres tubos por cada dilucin. Se incubaran los tubos en un rango de temperatura de 35 - 37 C durante 24 - 48 horas. Pasadas las primeras 24 horas, se registraran aquellos tubos que muestran produccin de gas y turbidez, los que no muestran dicha caracterstica se vuelven a incubar durante 24 horas ms y al cabo de las 48 horas se registran aquellos que muestran ser positivos. Al tener todos los tubos positivos, se confirmaran por medio del mtodo de MacKensey, para verificar la existencia de coliformes fecales. De cada tubo positivo se tomara un asa y se sembrara en cajas de E.M.B. y se incubaran a 44 C durante 24 horas y se observara la produccin de coliformes fecales. Investigacin de Salmonella La determinacin de Salmonella sp se llevara a cabo mediante la tcnica de siembra en placa en superficie de la siguiente forma: 6.4.1 Enriquecimiento no selectivo Para esta etapa se tomaran 25 gr de queso y se diluirn en 225 ml de caldo BHI y se homogenizaran debidamente. Posteriormente se incubara a 35 - 37 C durante 18 24 horas. 6.4.2 Enriquecimiento selectivo Se pipeteara 1 ml del cultivo pre enriquecido en 10 ml de caldo tetrationato, se agitara de tal manera que se asegure la dilucin y se incubara a 35 -37 C durante 24 horas. 6.4.3 Siembra en placa en medio de agar XLD (Xilosa - Lisina - Desoxicolato) selectivo Finalmente se llevara a cabo la siembra en placa superficial en agar X.L.D; tomando con un asa de punta circular la muestra del tubo con el medio enriquecido y frotando en el medio. Posteriormente se incubara a 37 C durante 24 horas. 6.4.4 Confirmacin de Salmonella sp

La confirmacin de la presencia de Salmonella sp se llevara a cabo mediante la realizacin de pruebas bioqumicas, para lo cual se seguirn los siguientes pasos: se tomaran colonias presuntivas desarrolladas sobre el agar X.L.D. y se sembrara en dos tubos con agar Lisina Hierro y agar Triple Azcar Hierro inclinados por la tcnica de puncin y estra y luego sern incubados a temperatura de 35 - 37 C durante 24 horas, al cabo del cual se espera confirmar bioqumicamente la presencia de la bacteria en cuestin.

Procesamiento y anlisis de los datos: Para el procesamiento de datos se empleara el software R 2.7.1 versin libre. Diseo Experimental

Factores Relacin Temperatura-tiempo de pasteurizacin Tamao del corte de la cuajada Peso de prensado Tiempo de prensado

Variables dependientes Recuentos microbiolgicos de Mohos y Levaduras, Aerobios Mesfilos, Coliformes Totales, Coliformes Fecales, Staphylococcus aureus y Salmonella sp.

Para evaluar los efectos de los factores estudiados y examinar las interacciones entre sus distintos niveles en cada uno de los recuentos microbiolgicos de Mohos y Levaduras, Aerobios Mesfilos, Coliformes Totales, Coliformes Fecales, Staphylococcus aureus y Salmonella sp. en el queso costeo; se desarrollo un diseo experimental completamente al azar con arreglo factorial 3x3x2x2, en donde el primer factor es Relacin Temperatura-tiempo de pasteurizacin con 3 niveles (63C-30 min; 73C-15 s. y 83C-1 s.), el segundo factor corresponde al tamao del corte de la cuajada en 3 niveles (1cm, 3cm y 5 cm), en el tercer factor est el peso de prensado en 2 niveles (6 veces el peso del queso y 18 veces el peso del queso) y por ltimo en el cuarto factor est el tiempo de prensado en 2 niveles (1hora y 3horas). Para establecer los efectos de las interacciones de los distintos factores estudiados, asi como sus efectos principales en cada una de las variables dependientes dadas por los recuentos microbiolgicos realizados, se realiz un anlisis de varianza ANAVA y para analizar la interaccin se realizaron pruebas verticales y horizontales en donde a travs de pruebas de comparacin mltiple se analiz un factor a cada nivel de otro factor.