PRCTICA 4. CULTIVOS MONOSPORICOS 1.

INTRODUCCIN La aplicacin de un producto microbiolgico contra una plaga determinada debe tener, entre otras condiciones, una pureza de 100%. En la naturaleza no se encuentran estos valores para una especie en particular, debido a las mltiples interacciones que se presentan entre los organismos. Por tal razn, la implementacin de tcnicas que conlleven a aislar y purificar una especie es fundamental para poder evaluar, posteriormente, se verdadero potencial biocontrolador. 2. OBJETIVO Adquirir conocimientos bsicos en tcnicas necesarias para la obtencin de colonias nicas con el fin de producir cultivos monospricos. 3. MATERIALES PARTE A. 1 Frasco con perlas de vidrio y agua destilada estril (todo estril) 5 Cajas de petri con PDA Acidificado Asa bacteriolgica (Tringulo) Mechero Insecto micosado Tubo eppendorf con ADE (1 ml)

PARTE B. Caja de petri con cultivo de hongo 1 Tubo con 10 ml de ADE. Pipetas y pipetiadores 6 tubos con 9ml de ADE 4 cajas con PDA Acidificado Asa bacteriolgica (Tringulo) Tween estril

4. METODOLOGA A. AISLAMIENTO DE HONGOS A PARTIR DE INSECTOS MICOSADOS. Adicionar 2 gotas de tween a frascos que contienen, previamente, microperlas y 10 ml de ADE. Poner los insectos micosados y agitar con el fin de homogenizar la muestra y

liberar las esporas del tejido. Esta ser la suspensin madre de la cual se harn siembras sucesivas en cajas de petri, de la siguiente manera: 1. Marcar cajas de Petri con PDA acidificado utilizando la nomenclatura -1, -2, -3, -4, -5. Adicionar 100 l de ADE partir de la caja -2 hasta la -5. 2. En la caja -1 (la primera caja) agregar 100 l de la suspensin madre, previa agitacin. 3. Utilizar una sola asa bacteriolgica flameada, homogenizar la muestra en la caja -1 y SIN FLAMEAR sembrar en superficie en forma sucesiva desde la caja -2 hasta la caja -5. Homogenizar bien cada siembra. 4. Incubar a Temperatura ambiente por 4- 5 das, posterior a las cuales se escoger la caja que tenga el crecimiento de colonias ms separadas. Se escoger una solo colonia, la cual ser repicada a un medio de PDA acidificado. B. AISLAMIENTO MULTIESPRICOS. DE HONGO(S) A PARTIR DE CULTIVOS

La suspensin madre se prepara a partir de un cultivo previamente purificado y sembrado en cajas de Petri. Se tendrn previamente 5 tubos tapa rosca, cada uno con 9 ml de Agua Destilada Estril (ADE) y marcados desde 10 -1 hasta 10-5.Luego se procede de la siguiente manera: 1. La solucin madre se prepara al tomar una caja de petri con cultivo purificado y adicionar de 10 a 15 ml de ADE + 2 gotas de Tween y raspar las esporas de la superficie del medio, por medio de un asa bacteriolgica. 2. Tomar 1 ml de la solucin madre y pasarlo al tubo marcado como 10-1 , de este tubo tomar 1 ml y llevarlo al tubo 10-2 y continuar en forma sucesiva hasta la dilucin 10-5. Mezclar con vortex y pasar en forma sucesiva 1ml hasta la dilucin 10-5.Tener presente que entre tubo y tubo se agite bien la suspensin. 3. A continuacin sembrar en cajas de Petri con PDA acidificado, 100 l de las diluciones -4 y -5 por duplicado.