I.

INTRODUCCION
En el presente informe de prctica se hace conocer que el Centro
de investigacin para el Desarrollo biotecnolgico de la Amazonia (CIDBAM),
es un centro de investigacin orientado a fomentar el desarrollo de los diversos
recursos naturales que existe en nuestro ecosistemas de la amazonia, a la vez
se describe los procedimientos realizados en los trabajos de investigacin
como tambin el reconocimiento de las instalaciones, reas, equipos, reactivos
y los mtodos de los anlisis.
El CIDBAM viene desarrollando investigaciones en frutas,
vegetales y plantas, que presentan propiedades funcionales medicinales ya
que ayuda a prevenir las enfermedades de las persona. Productos elaborados
en forma natural a base de estas plantas estn siendo comercializados como:
frmacos, jarabes, bebidas, productos atomizados entre otros productos, el
consumo y la alta demanda existente, es por ello que se enfoc sobre la
cuantificacin de sus propiedades qumicas y capacidad antioxidante en hojas
de ajos sacha (Mansoa alliacea L.) deshidratado y liofilizado.
En el desarrollo de la prctica se plante los siguiente objetivos:
- Conocer el funcionamiento del centro de investigacin.
- Caracterizacion fisico quimico, determinacion de polifenoles totales y
capacidad antioxidante en hojas de ajos sacha, por el metodo del radical
DPPH.
2
II. REVISION BIBLIOGRAFICA
2.1. Aspectos generales de ajos sacha
Crece en zonas tropicales con precipitacin pluvial de 1800 a
3500 mm/ao, temperaturas entre 20 a 26 C, son de suelo arenoso o
arcilloso con abundante materia orgnica. Habita en faldas de altura, alejada
de cuerpos de agua, chacras nuevas, reas sombreadas o poco
sombreadas tanto de purmas como de bosque primario. No es resistente a la
inundacin. Comparte su hbitat con las siguientes especies: aguaje, algodn,
bijao, caa agria, carahuasca, castaa, cedro, cetico, cordoncillo,
charichuelo, chiricsanango, chuchuhuasi, espintana, huacap,
huamansamana, huito, limn, patiquina, pijuayo, poma rosa, pona, sangre de
grado, sapohuasca, shapaja, ubos, umar, ua de gato, uvilla, yarina, zapote.
Su rea de distribucin se extiende desde Mxico a Per incluyendo toda
Centroamrica, en Per se encuentra distribuida en los departamentos de
Amazonas, Hunuco, Loreto (Tamshiyacu, Valentn e Indiana, ro
Amazonas; Llachapa y Corazn de Jess, ro Napo; Padre Cocha, ro
Nanay; Contamana, ro Ucayali) y San Martn (IIAP, 1995).
En Nicaragua, en la medicina tradicional de la isla de Ometepe, se
usa para curar las cefaleas haciendo vaporaciones de la decoccin de este
vegetal, la cual es respirada durante varios das despus de disminuir la fiebre.
3
Los amerindios de la Amazona peruana usan las hojas, races y corteza del
bejuco, macerados en agua fresca, contra problemas sistmicos como gripe,
fiebre y reumatismo. Tambin se tiene el conocimiento de que posee
propiedades repulsivas de insectos (insecticida), para lo cual se usa una
maceracin de sus hojas y races en fro durante un da, tras lo cual sta se
pulveriza directamente sobre las plantas impidiendo que sean invadidas por
molestos insectos patgenos y otros desfoliadores en cultivos (LOPEZ Y
PEREZ, 2010)
2.1.1. Clasificacin taxonmica
Segn RENGIFO (2001), menciona que el ajo sacha est
clasificado:
Familia: BIGNONIACEAE
Nombre cientfico: Mansoa alliacea L.
Nombre comn: Ajos del monte





Figura 1. Ajos sacha (Mansoa alliacea L.)

4
2.1.2. Caractersticas morfolgicas
Arbusto semitrepador de 3 m de altura o ms, partes vegetativas
con olor a ajos o cebolla, pseudo estpulas pequeas, aplanadas y cnicas.
Hojas bifolioladas con zarcillo trfido, foliolos abovados a elpticos de 5-27 x 2-
18 cm, de pice agudo a obtuso y base cuneada. Inflorescencias axilares en
racimos o panculas pausifloras; cliz cupular de 5-10 cm x 6-11 mm; corola
violeta tubular campanulada de 6 a 9 cm de largo. Fruto cpsula lineal oblonga
lignificada, fuertemente angulada, de superficie lisa. Semillas con dos alas
membranceas, parduzcas y subhialinas en el borde (TAYLOR, 2006).
2.2. Antioxidantes
Un antioxidante es una sustancia capaz de neutralizar la accin
oxidante de los radicales libres, liberando electrones que son captados por los
radicales libres, manteniendo su estabilidad (AVELLO Y SUWALSKY, 2006).
Estos compuestos prolongan la vida til de los alimentos, protegiendo contra el
deterioro causado por la oxidacin, evitando la rancidez de las grasas y los
cambios de color (SEIS, 1997). Deben estar presentes en el organismo en una
concentracin suficiente que permita prevenir la acumulacin de elementos
pro-oxidantes (HALLIWELL Y GUTTERIDGE, 1985).
2.2.1. Funcin de los antioxidantes
El antioxidante al reaccionar con el radical libre, le cede un
electrn, oxidndose a su vez y transformndose en un radical libre dbil no
txico, que en algunos casos, puede volver a su estado inicial mediante la
5
actuacin de otros antioxidantes (SEIS, 1997). Pueden actuar previniendo la
formacin de radicales libres, interceptando el ataque de las mismas, captando
los metabolitos reactivos y convirtindolos en molculas menos reactivas,
facilitando la reparacin del dao provocado y manteniendo un ambiente
favorable para la actuacin de otros antioxidantes (HALLIWELL Y
GUTTERIDGE, 1985).
2.2.2. Tipos de antioxidantes
- Antioxidantes endgenos
Son los antioxidantes que se encuentran normalmente en el
organismo se llaman endgenos y generalmente son sistemas enzimticos
como la superxido dismutasa (mitocondrial, citoplasmtica y extracelular), la
catalasa y el complejo glutatin peroxidasa (PINEDA, 2005).
- Antioxidantes exgenos
Los antioxidantes exgenos o no enzimticos, transforman los
radicales libres en menos agresivos. Entre ellos tenemos: Flavonoides, alfa
tocoferol (vitamina E), beta caroteno, vitamina C, glutatin y urato reporta que
las plantas producen una gran variedad de productos secundarios que
contienen grupos de fenoles, flavonoides, lignina, y taninos condensados
(POKORNY et al., 2005).



6
2.2.3. Polifenoles
VON (2011), hace mencin que los polifenoles son un amplio grupo
de metabolitos secundarios que abundan en las plantas. Cumplen importantes
funciones como agentes de defensa contra estrs biticos (patgenos y
herbvoros) y abiticos (radiaciones ultravioletas y sequa). Los compuestos
fenlicos son metabolitos secundarios de las plantas, estos compuestos son
importantes en el crecimiento y reproduccin, proveen proteccin contra los
patgenos y depredadores, tambin contribuyen en el color y las caractersticas
sensoriales de las frutas y vegetales.
Los compuestos fenlicos exhiben un amplio rango de propiedades
fisiolgicas, tales como antialrgico, anti-artherogenic, antiinflamatorio,
antimicrobiano, antioxidante, antitrombotico, proteccin cardiovascular y
efectos vasodilatador, estos compuestos han sido asociados con la salud por
los beneficios que aportan en el consumo de frutas y vegetales, esto es
atribuido a su actividad antioxidante (BALASUNDRAM et al., 2005).
2.3. Radicales libres
ANDERSON Y PHILLIPS (2001) mencionan que cualquier
molcula o tomo que contiene uno o ms electrones desapareados es un
radical libre; por lo tanto, los radicales libres intentaran arrancar un electrn de
otra molcula y en este proceso rompen otras parejas de electrones para
conseguir su propio apareamiento creando as molculas inestables
generndose una reaccin en cadena.
7
Los procesos de oxidacin producen radicales libres que pueden
interferir en los procesos normales y daar las clulas corporales causando
estrs oxidativo. El estrs oxidativo, se define como el desbalance entre la
produccin de radicales libres y la cantidad de antioxidantes presentes en el
ambiente intracelular (ELEJALDE, 2001). Muchas sustancias txicas son
capaces de producir radicales libres y de disminuir nuestra defensa
antioxidante (MURILLO, 2006).
2.3.1. Radical 1,1 difenil-2-picril-hidrazil (DPPH)
Es un radical libre estable y se utiliza como indicador para medir la
capacidad de secuestro de cualquier compuesto que posea actividad
antioxidante. El principio del mtodo del DPPH consiste en la sustraccin de un
tomo de hidrogeno proveniente de un fenol donador (ejemplo compuesto
fenlicos) para generar el compuesto definilpicrihidrazina y un radicalfenoxil. En
este proceso, la reaccin desarrolla un cambio de color de violeta a amarillo a
medida que disminuye la absorbancia detectable a 515 nm. (LEBEAU, et al.,
2000).






8
III. PLAN DE TRABAJO
3.1. Funcionamiento del Centro de Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico de la Amazona - CIDBAM
3.1.1. Ubicacin
3.1.2. Organizacin
3.1.3. Reconocimiento de reas de trabajo, materiales,
equipos y reactivos
3.2. Caracterizacin fisico - qumica y capacidad antioxidante de las hojas
de ajos sacha
3.2.1 Mtodo de anlisis
Para cumplir con este propsito se realizar diversos anlisis de
estudio como: qumico proximal, polifenoles totales y capacidad antioxidante.
3.2.2. Caracterizacin fisicoqumica de las hojas de ajos sacha
Para cumplir con este propsito se preparar la muestra y luego se
caracterizar fisicoqumicamente.
9
3.2.3. Polifenoles totales y su capacidad antioxidante de las
hojas de ajos sacha
- .Determinacin de polifenoles totales
- Determinacin de la capacidad antioxidante




10
IV. DESARROLLO DEL PLAN DE TRABAJO
4.1. Del funcionamiento del Centro de Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico de la Amazona (CIDBAM)
4.1.1. Ubicacin
El Centro de Investigacin para el Desarrollo Biotecnolgico de la
Amazona (CIDBAM) se encuentra ubicado en la avenida universitaria s/n 1.5
km. de la carretera central Tingo Mara- Hunuco, a 650 m.s.n.m. con una
humedad relativa de 80% y una temperatura promedio de 25 C.
4.1.2. Organizacin
El Centro de investigacion para el desarrollo Biotecnologico de la
amazonia (CIDBAM) es un organo desconcentrado del vicerrectorado de la
universidad nacional agraria de la selva cuya mision es la formacion cientifica y
tecnicas a profesionales de distintas especialidades en ciencia y se encuentra
conformado con un organigrama como se muestra en el anexo 01.

11
4.2. Reconocimiento de reas de trabajo, materiales, equipos y
reactivos
Centro de Investigacin para el Desarrollo Biotecnolgico de la
Amazona (CIDBAM) consta de 5 reas de trabajo que son:
- rea de micro propagacin in vitro de vegetales.
- rea de antioxidantes.
- rea de HPLC.
- rea de cultivo celular.
- rea de biologa molecular.

4.2.1. rea de micropropagacin in vitro de vegetales
El rea de micropropagacin realiza cultivo de clulas vegetales
para multiplicar cualquier parte de la planta para trabajo de investigacin y se
da las condiciones ambientales para dicho proceso.
Esta rea cuenta con 3 ambientes que son: sala de preparacin
(ah se realiza la desinfeccin de la muestra, materiales y se preparacin de
medios de cultivo), de siembra (este ambiente tiene que estar asptico para la
siembra respectivamente) y de incubacin (en este ambiente se da las
condiciones adecuadas tanto de temperatura, humedad, y de fotoperiodo para
el respetivo crecimiento de la muestra).



12
a) Materiales
- Asa de siembra.
- Baguetas de vidrio.
- Fiolas de 1000mL, 500mL, 50mL y 10mL.
- Matraces.
- Mecheros.
- Placas Petri.
- Pipetas de 1 mL.
- Probetas.
- Termmetros.
- Tubos de ensayo Genx Mate (10mL, 50 mL).
- Vasos de precipitacin (100mL, 500mL, 100mL).
b) Equipos
- Autoclave NAPCO model 9000 D, 32 psi, 130C, 230 V, 6,3 A, 1430
w, USA.
- Balanza analtica AE 163 (ADAM TOLEDO, Switzerland).
- Equipo de flujo laminar marca PIDESTAL modeloODH4- 9340A, 220-
110 V.
- Equipo de PCR marca BIOMETRA modelo T personal TVL-312A, 220-
240 V.
- Equipo de electroforesis marca ESPECTROLINE modelo 25x-2, 220-
240 V.

13
4.2.2. rea de antioxidantes
En esta rea se realizaba la determinacin de la capacidad
antioxidante, polifenoles totales, carotenoides, etc. De plantas de la amazonia
para conocer y determinar los compuestos activos presentes en ellos.
a) Equipos
- Autoclave NAPCO modelo 9000 D, 32 psi, 130C, 230 V, 6,3 A, 1430
w, USA.
- Bao mara modelo YCW-010E (Associated With Cannic, Inc, USA).
- Balanza analtica: digital Precisin, capacidad mxima 210 g., modelo
ESJ 210-4.
- Balanza analtica digital, sensibilidad 0.0001g. U.S.A. marca
Sartorius.
- Balanza analtica modelo AE 163 (METLER TOLEDO, Switzerland).
- Centrifuga marca Hettich modelo MIKRO 22R y velocid. 10,000 rpm.
- Congelador FFV-2065FW (Frigidaire, USA).
- Congelador vertical BOSCH.
- Desionizador modelo D 7035 (Barnstead).
- Espectrofotmetro modelo Genesys 6 (Thermo Electrn Corporation).
- Estufa modelo ODH6- 9240A (TOMOS Heatring Drying Oven).
- Homogenizador modelo VORTEX GENIE-2 (Scientific industrias SI
TM
).
- Horno microondas SANSUNG.
- pH metro marca METTLER TOLEDO.
- Micropipetas de 0.1-1.0
14
- Refrigerador Icebeam Door Cooling LG GR-5392QLC.
- Rotavapor BUCHI R-200.
- Sonicador JAC ULTRASONIC 1002.
4.2.3. rea de HPLC
El rea de Cromatografa Lquida de Alta Performancia (HPLC),
tiene un ambiente de 50.08 m2. Ah se realiza la separacin de compuestos,
que permite aislar, identificar y cuantificar los compuestos desconocidos tales
como vitaminas, protenas y compuestos activos como flavonoides, alcaloides y
esteroles en una muestra o solucin conocida. Para la cuantificacin de estos
compuestos se utiliza estndares especficos.
a) Materiales
- Fiolas de 1000mL, 500mL, 100mL, 50mL y 10mL.
- Matraces Erlenmeyer, PIREX.
- Micropipetas, Gene Mate de 1000 L, 200L y 100L.
- Probetas.
- Termmetros.
- Tips, FISHERBRAND de1000L, 200L y 100 L.
- Vasos de precipitacin de 1000 mL, 500 mL, 100 mL, 50 mL y 10mL.
b) Equipos
- Equipo de cromatografa lquida de alta performancia (HPLC) modelo
LC-10AVP (ShimadzuScientific, MD, USA.). Equipado con:
Desgasificador modelo FCV 10AL VP, Bomba modelo LC-10ATVP,
15
Columna cromatogrfica C18-110R Gemini, Horno de columna modelo
CTO 10ASVP Detector UV-Vis modelo SPD-10AVVP, Controlador
Modelo SCL 10AVP, Software de interfase CLASS-VP, Computadora
compatible USB-52X, Inyector de muestra de capacidad 20 L.
- Homogenizador modelo VORTEX GENIE-2 (Scientificindustrias SITM).
c) Reactivos y solventes
- cido actico, Sigma Chemical.
- Acetonitrilo (grado HPLC), Sigma Chemical.
- Etanol (grado HPLC), Sigma Chemical.
- L(+) cido ascrbico puro, Sigma Chemical.
- (+)-catequin, Sigma Chemical.
- Metanol (grado HPLC), Sigma Chemical.
4.2.4. rea de cultivo celular
El rea de cultivo celular tiene 30.08 m
2
,

est enfocada en la
bsqueda de microorganismos productores de enzimas, de inters las lipasas.
a) Materiales
- Asa de siembra.
- Baguetas de vidrio estriles.
- Erlenmeyer estriles.
- Gradillas.
- Matraz.
- Mecheros.
16
- Micro pipetas.
- Pipetas bacteriolgicas estriles.
- Placas petri.
b) Equipos
- Agitador orbital de bandeja BAMSTEAD internacional Lab-Line, Modelo
MaxQ2000, 220 240V, 0.4 A, 45 w, 50/60 Hz, 500 rpm USA.
- Incubadora Labor MUSZERIPARI MUVER LP 111, 220V, 0,19 Kw,
HUNGARA.
c) Medios de cultivo
- Agar-agar Merck GERMANY.
- Agar OGY Merck GERMANY.
- Agar glucosa Merck GERMANY.
- Agar Sabouraud Merck GERMANY.
- Extracto de carne seco granulado Merck GERMANY.
- Extracto de levadura BIOGEN.
- Glicerina Merck GERMANY.
- Goma arbiga SIGMA ALDRICH.
- Peptona de carne obtenida por digestin pancretica granulado Merck
GERMANY.




17
4.2.5. rea biologa molecular
Es un ambiente de 50,08 m
2
, es el encargado de realizar los
ensayos de determinacin de ADN.
a) Materiales
- Erlenmeyer estriles de 500 ml de capacidad.
- Gradillas.
- Mecheros.
- Pipetas bacteriolgicas estriles.
b) Equipos
- Equipo de electroforesis marca ESPECTROLINE modelo TVL-312A,
220-240 V.
- Destilador modelo D 7036 (Barnstead).
- Equipo de PCR marca BIOMETRA modelo T personal TVL-312A, 220-
240 V.
- Equipo de termociclador marca MINICYCLER TM modelo MJ Research
- PTC-150, 220-240 V.
4.3. Mtodos de anlisis realizados en el CIDBAM
4.3.1. Anlisis qumico proximal
La Materia prima seleccionada se someti a las siguientes
determinaciones:

18
- Humedad, mtodo 23.003 AOAC (1997).
- Protena, mtodo 991.29 AOAC (1997).
- Grasa, mtodo 935, 60 AOAC. (1997).
- Fibra, mtodo 930.20 AOAC (1997).
- Cenizas, mtodo 942.50 de calcinacin directa AOAC (1997).
4.3.2. Cuantificacin de polifenoles Totales
Se emple el Mtodo de Folin-Ciocalteu reportado por SANDOVAL
et al., (2001).
- Curva patrn
La curva patrn se prepar a partir de una solucin stock de 10
mL de cido glico a una concentracin de 2 mg/mL, a partir de esta solucin
stock se prepararon diluciones de 0,0625; 0,125; 0,25; 0,50; 1,00; 1,25
mg/mL. En cada tubo de ensayo se adicion 1580 L agua destilada, 20 l de
las soluciones patrones diluida, 100 L de reactivo de fenol follin-ciocalteu y
finalmente 300 L Na
2
CO
3
al 20%. Se dej reaccionar por 2 horas a
temperatura ambiente y luego se realiz la lectura en el espectrofotmetro
UV/VIS, a una longitud de onda de 700 nm.
- Cuantificacin de polifenoles totales en hojas de ajos
sacha
Se tom 1580 L de H
2
O destilada y se agreg en un tubo de
ensayo, luego se adiciono 20 l de la muestra centrifugada de hojas de ajos
19
sacha deshidratadas (45 mg/mL) y liofilizado (40 mg/mL), seguidamente se
adiciono 300 l de Carbonato de sodio (Na
2
CO
3
) para neutralizar la reaccin y
finalmente 100 l de reactivo de fenol follin-ciocalteu; vortear toda la solucin
y luego se incubo por 2 horas en la oscuridad y ser leda a 700 nm. Los
resultados se expresaron en miligramos equivalentes de cido Glico (EAG)
por 100 gramos de muestra.
4.3.3. Determinacin de la capacidad antioxidante mediante
la prueba DPPH.
Se utiliz el Mtodo de inhibicin del radical DPPH (2,2-diphenyl-1-
picrilhydrazyl), descrito por Brand- Williams modificado por Sandoval et al.,
(2001).
Se prepar la solucin stock de 10 mL a 1 mM del reactivo DPPH
con metanol, luego se homogeniz la solucin (con Vortex) de 2 a 5 minutos
hasta una completa solubilizacin y se almacen a 4 C. A partir de la solucin
stock 1 mM se prepar 40 mL de solucin a 100 M DPPH con metanol. Luego
se prepar soluciones de trabajo a partir del extracto (60, 200, 400, 800 g/mL)
y liofilizado (40, 250, 500, 700 g/mL). Despus se hizo reaccionar cada
solucin de trabajo con 50 L de cada extracto con 950 L de la solucin de
DPPH (100 M) en una cubeta de poliestireno. La inhibicin de los radicales
libres DPPH se determin por la decoloracin de la solucin violeta a amarillo,
la cual se monitore por espectrofotmetro a 515 nm. A medida que hay un
mayor secuestro de los radicales libres por un antioxidante, la absorbancia
disminuye. Para la determinacin del porcentaje de inhibicin se utiliz la
siguiente ecuacin:
20
( )
100 %
(

=
AbsControl
AbsMuestra AbsControl
DPPH Inhibicion

Dnde: Abs. Control: Absorbancia del control
Abs. Muestra: Absorbancia de la muestra en 10 min.
4.4. Caracterizacin fisicoqumica de las hojas de ajos sacha
4.4.1. Recoleccin y preparacin de Materia prima
Las hojas de ajos sacha fueron recolectadas en horas de la
maana sortilegio, perteneciente al departamento de Hunuco, provincia de
Leoncio prado, distrito de Hermilio Valdizn, en la finca Milagros en el Km
27.8 de la carretera Tingo Mara- Aguayta.
Las hojas de ajos sacha recolectadas y seleccionados se
trasladaron al Laboratorio del Centro de Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico de la Amazonia (CIDBAM). Las hojas de ajos sacha se
llevaron a un secado directo (65 C/12 horas) en estufa y a un liofilizado.
Las hojas deshidratadas y liofilizadas se molieron en un molinillo
elctrico, luego pes y fue envasado en bolsas de polietileno, codificadas y
almacenadas. Para el anlisis de protena, fibra, grasa, ceniza, se usaron
hojas secas. En la Figura 2, se muestra los pasos realizados para obtencin
de las muestras.




21
















Figura 2. Preparacin de la muestra.
4.4.2. Preparacin de los extractos
Se pes 2 g muestra deshidratada y liofilizada se aadi 20 mL de
solucin hidroalcoholica (alcohol a 96/ agua; 50/50 v/v) haciendo 100 mg/mL,
estas muestras fueron transferidas a unos frascos de color mbar; a
temperatura ambiente, se llev al agitador por 24 horas, luego se filtr cada

Hojas de ajos sacha
Recepcin
Seleccin
Deshidratado Liofilizado
Molido
Envasado
Almacenado
Tiempo: 20horas


Temperatura: 65C
Tiempo: 12 horas
Molinillo elctrico

100 g de muestra

Temperatura ambiente

22
muestra, los extractos filtrados se colocaron frascos mbar y fueron
almacenados a -20 C, hasta su posterior anlisis.









Figura 3. Preparacin del extracto.
4.4.2 Caracterizacin fisicoqumico de las hojas de ajos
sacha
Se realiz el anlisis fisicoqumico de las hojas de ajos sacha,
siguiendo los mtodos ya descritos en el mtodo de anlisis. Los resultados
se muestran en Cuadro 1.
Cuadro 1. Anlisis fisicoqumico de la hoja ajos sacha.
Anlisis Hojas de ajos sacha
Humedad (%) 52,21 0,27
Protena (%) (N x 6.25) 6,48 0,13
Grasa (%) 5, 44 5,8 E-5
Extraccin hidroalcoholica
Agitacin por 24 horas

Extraccin
(100 mg/mL)

Filtrado
Almacenado
Papel whatman N 40

-20C

Muestra seca y liofilizada
23
Fibra (%) 24,29 0,006
Ceniza (%) 6,48 0,13
Los datos representan al promedio SD, n = 3.
4.5 Capacidad antioxidante de las hojas de ajos sacha
4.5.1 Cuantificacin de polifenoles totales en hojas de ajos
sacha
- Curva patrn
Los resultados obtenidos de la curva patrn del cido glico se
muestran en el cuadro 2 y figura 4.
Cuadro 2. Anlisis fisicoqumico de la hoja ajos sacha.
Concentraciones
(mg AG/mL)
Absorbancias
Promedio
R
1
R
2
R
3

0,0625 0,060 0,074 0,075 0,0697
0,125 0,136 0,183 0,138 0,1523
0,250 0,250 0,315 0,295 0,2867
0,500 0,469 0,549 0,569 0,5290
1,00 0,986 1,176 1,158 1,1067
1,50 1.568 1,64 1,469 1,559

24


Figura 4. Curva de cido glico.


- Cuantificacin de polifenoles totales.
Los resultados obtenidos en la cuantificacin de polifenoles totales
se muestran en el Cuadro 3. Se observa que en hojas de ajos sacha liofilizado
el contenido de polifenoles totales es mayor al deshidratado por estufa, siendo
1,38 y 1,17 g EAG/100 g respectivamente.
Cuadro 3. Contenido de polifenoles totales en hojas de ajos sacha.
Tratamiento g EAG/100 g
Secado 1,17 0,03
Liofilizado 1,38 0,07
Los datos representan al promedio SD, n = 3.

y = 1.0437x + 0.0193
R = 0.9983
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
A
b
s
o
r
v
a
n
c
i
a

mg/mL
Curva de cido Glico
25
4.5.2 Determinacin de la capacidad antioxidante de las
hojas de ajos sacha mediante la prueba DPPH
Los resultados de la determinacin de la actividad antioxidante
mediante la prueba de DPPH, expresado en porcentaje de inhibicin y IC
50

(g/mL) se muestra en el Cuadro 4. El IC
50
representa la cantidad de muestra
deshidratada y liofilizada de ajos sacha (g/ml), requerido para inhibir el 50%
de DPPH utilizado en la reaccin.



Cuadro 4. Efecto de las hojas de ajos sacha frente a la actividad antioxidante.
Tratamiento % inhibicin IC
50
(ug/mL)
Deshidratado 85,08 0,42 348,74 2,60
Liofilizado 86,11 0,43 246,67 3,57
Los datos representan al promedio SD, n = 3.



26
V. DISCUSIONES
5.1. Reconocimiento del Centro de Investigacin para el
Desarrollo Biotecnolgico de la Amazona (CIDBAM)
El Centro de Investigacin para el Desarrollo Biotecnolgico de la
Amazonia (CIDBAM), es de la Universidad Nacional Agraria de la Selva
orientado a promover el desarrollo socio-econmico sostenible de la amazonia
a travs de la ciencia y tecnologa. Promueve el entrenamiento a estudiantes y
profesionales con el fin de transmitir el conocimiento y resultados cientficos de
las investigaciones biotecnolgicas de los pases desarrollados.
USC (2007), menciona que la funcin del laboratorio de
investigacin es apoyar las actividades de investigacin y/o desarrollo
tecnolgico adelantado por investigadores y estudiantes que desarrollan un
proyecto de investigacin vinculado a una lnea de investigacin de la
institucin, en temas referidos a la validacin de principios, leyes y fenmenos
cientficos y tecnolgicos. Y apoyar con desarrollo tecnolgico de instituciones
y entes externos a la Universidad, como una forma prctica de materializar la
extensin y el apoyo a la comunidad.
El CIDBAM cuentan con equipos, materiales y reactivos las cuales
se encuentran en las diferentes reas, los equipos cuenta con su manual y
27
registro de uso, as mismo cuenta con un cuaderno de asistencia y control de
trabajos realizados en el centro (describen la actividad que se realiza, entrada y
salida de la persona que ingresa al laboratorio).
Segn las NTP-ISO/IEC 17025 (2001), menciona que el laboratorio
debe tener instrucciones para el use y operacin de todo el equipo pertinente, y
para la manipulacin y preparacin de los objetos para el ensayo y/o
calibracin, o ambos, cuando la ausencia de tales instrucciones puede poner
en riesgo los resultados de los ensayos y/o calibraciones. Las instrucciones,
normas, manuales y datos de referencias pertinentes al trabajo del laboratorio
deben mantenerse actualizados y estar fcilmente disponibles para el personal.
5.2. Capacidad antioxidante de las hojas de ajos sacha
5.2.1. Cuantificacin de polifenoles totales en hojas de ajos
sacha.
- Curva patrn

Para realizar la cuantificacin de polifenoles totales se elabor una
curva patrn en base a cido glico cuyas concentraciones fueron 0,0625;
0,125; 0,25; 0,50; 1,00; 1,25 mg/mL; los resultados se presenta en el Cuadro 0
y figura 0, en ella se puede apreciar el diagrama de dispersin de las
absorbancias, obteniendo una ecuacin matemtica de dos variables y un
coeficiente de determinacin R
2
= 0,9983.
28
WEBSTER (2000), menciona que la regresin simple establece
que y es una funcin de solo una variable. Solo hay dos variables una
dependiente y una independiente. Es habitual colocar la variable independiente
en el eje horizontal. Cuando los valores de (x, y) se mueven en la misma
direccin se dice que es una relacin lineal y positiva.
MURRAY (1969) indica que si Y tiende a incrementarse cuando
incrementa X la correlacin se dice positiva o correlacin directa. CRDOVA
(2003), manifiesta que los diagramas de dispersin o nube de puntos se le
denomina a la grfica de los valores (x, y), que pueden ser de relacin lineal,
no lineal o no tener ninguna relacin lineal; as mismo, el coeficiente de
correlacin R
2
es una medida de la proximidad del ajuste de la recta de
regresin. Cuanto ms alto sea el valor de R
2
mejor ser el ajuste y ms til la
recta de regresin.
- Cuantificacin de polifenoles totales.

En el cuadro 3, muestra que el mayor contenido en polifenoles
totales lo posee el liofilizado 1,38 0,07 g EAG/100g, mientras que en hojas
deshidratadas el contenido es menor 1,17 0,03 g EAG/100g, ya que se pierde
por efecto de la temperatura, est perdida es explicado por CHITINDINGU et
al., (2007), que indica que en algunos vegetales que son fuente rica en
polifenoles que contribuyen a la actividad antioxidante, son afectado por la
exposicin a diferentes procesos y tcnicas de secado. MADRAU et al., (2009)
en su estudio demostr que el contenido de polifenoles disminuye a medida
que aumenta la temperatura del aire caliente de secado.
29
La variacin de los resultados encontrados en hojas de ajos sacha
puede ser explicado por KATIYAR y MUKHTAR (1997) quienes mencionan que
los factores que influyen en la cantidad de polifenoles presentes en una hoja
puede variar de acuerdo a las condiciones geogrficas y procesamiento.
ROJAS et al., (2012), menciona que la liofilizacin preserva las
caractersticas funcional (capacidad antioxidante), debido a que las condiciones
de secado protegen los compuestos bioactivos presentes en la muestra.
5.3. Determinacin de la capacidad antioxidante de las hojas de
ajos sacha mediante la prueba DPPH
Los resultados de la prueba de DPPH se presenta en el cuadro 00,
indicando que la mayor capacidad antioxidante lo presenta el liofilizado con un
IC
50
246,67 3,57 ug/mL y la menor capacidad antioxidante es para hojas
deshidratado con un IC
50
348,74 2,60 ug/mL, como se puede apreciar a
menor valor existe mayor actividad antioxidante esto concuerda con
VILLANUEVA et al., (2010) que indica que IC
50
menores refleja una alta
actividad para inhibir radicales libres.
Esta variacin encontrada en la capacidad antioxidante puede ser
explicado por RAMOS et al., (2009) que indica que la variabilidad entre los
valores IC
50
puede atribuirse a la diferencia entre la metodologa para
determinar la actividad antioxidante, la localizacin geogrfica de la muestra,
temperatura y tratamiento de proceso.
Las hojas secadas posiblemente no presento la desactivacin de la
enzima polifenoloxidasa ya que estas protegen a las sustancias fenlicas
30
contra la oxidacin catalizada por las enzimas lo que conlleva a la formacin de
quinonas con escasa o nula actividad antioxidante (POKORNY et al., 2005).








31
VI. CONCLUSIONES

- Se logr conocer las diferetes reas, funcionamiento de equipos,
materiales y reactivos utilizados para los anlisis realizados.
- Se conoci los metodos de analisis para determinar polifenoles totales,
analisis quimico proximal y actividad antioxidante, que se realizan en el
CIDBAM.
- La caracterizacion qumica de las hojas de ajos sacha, mostr una
humedad de 52,21 %, protena 6,48 %, grasa 5,44 %, fibra 24,29 % y
ceniza 6,48 %.
- La cuantificacin de polifenoles totales presenta mayor en la hoja
liofilizada de 1,38 0,07 g AGE/100 g de muestra seca y para la hoja
deshidratada es de 1,17 0,03 g AGE/100 g de muestra seca.
- La mayor eficiencia frente al radical DPPH presentan las hojas
liofilizadas con IC
50
246,67 3,57 g/ml y la menor eficiencia lo presenta
las hojas deshidratadas con IC
50
348,74 2,60 g/ml.





32
VII. RECOMENDASIONES
- Elaborar un manual y establecer un sistema de calidad de
procedimientos para la manipulacin segura, el uso y el mantenimiento
planificado de los equipos de medicin.
- Cuantificar los compuestos bioactivos responsables de la actividad
antioxidante presentes en las hojas de ajos sacha.
- Realizar estudios de extraccin slido lquido para optimizar parmetros
de extraccin de los compuestos bioactivos de hojas de ajos sacha.
- Realizar investigaciones otras partes de la planta (tallos y races) que
puedan contener mayor actividad y concentracin de antioxidantes tiles
en diferentes industrias.








33
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

ANDERSON, D; PHILLIPS, B. 2001. Comparative in Vitro and in Vivo Effects of
Antioxidants. Food Chem. Toxicol. 37:1015 1025 p.
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Farmacia, Universidad de Concepcin. 3 p.
BALASUNDRAM, N.; SUNDRAM, K.; SAMMAN, S. 2005. Phenolic compounds
in plants and agro-industrial by-products: Antioxidant activity, occurrence,
and potential uses. Analytical, Nutritional and Clinical Methods. Food
Chemistry. 99: 191-203 p.
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1995. Plantas Medicinales de la Amazonia Peruana, Estudio de su Uso y
Cultivo. Iquitos Per. 315 pag.
KATIYAR, Y.; MUKHTAR, H. 1997. Tea polyphenos prevention of cncer and
optimizing
34
LOPEZ S, J.A; PEREZ S, J. 2010. Fitoquimica y Valor Ecologico del Olor a Ajo
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Medicina Naturista Vol. 4 - N 1: 15-23 pag.
MADRAU, M.A.; PISCOPO, A.; SANGUINETTI, A.M; POIANA, M.; ROMERO,
F.V.; PIGA, A. 2009. Effect of drying temperatura on polyphenolic content
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NTP-ISO/IEC 17025. 2001. Requisitos generales para la competencia de
laboratorios de ensayo y calibracin. 1' Edicin. 20-26p.
PINEDA, A. 2005. Determinacin de las propiedades antioxidantes de
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Guatemala. Tesis, Universidad de San Carlos de Guatemala. Guatemala.
79 p.
POKORNY, J.; YANISHLIEVA, N.; GORDON, M. 2005. Antioxidantes de los
alimentos. Aplicaciones prcticas. Zaragoza, Espaa, Editorial ACRIBIA,
S.A. 364 p.
RAMOS E, F.; CONDEZO H, L.A.; RAMOS E, M.; YAEZ, J.A. 2009. Design
and Assessment of the in Vitro Antioxidant Capacity of a Beverage
Composed of Green Tea (Camellia Sinensis L.) and Lemongrass
(Cymbopogon Citratus Stap). Universidad San Martin de Porres. Per. Ed.
H. McKinley and M. Jamieson. 81-101 p.
35
RENGIFO E 2001. Plantas medicinales y biocidas de la amazonia
peruana.Instituto de la Investigacion de la Amazonia
Peruana.Iquitos.Peru.165p.
ROJAS, D; PALACIO, A. M; OSPINA, S. P; ZAPATA, P; ATEHORTA, L.
(2012). Biotecnologia de hongos basidiomicetes en el desarrollo de
alimentos funcionales: procesos de secado vs capacidad antioxidante.
Universidad de antioquia. Medellin colombia. Vitae vol 19. 3 pag.
SANDOVAL, M.; OKUHAMA, N.; ANGELES, F.; MELCHOR, V.; CONDEZO, L.;
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(Lepidium meyenii).Publicacin aceptada. Food chemistry. 1-23 p.
SEIS, H.1997.Antioxidantas in Disease Mechanisms and
Therapy.Vol.38.USA.Academic Press Inc.293.
TAYLOR, L. 2006. Technical Data Report for Ajos Sacha (Mansoa
alliacea).Carson city. 19 pag.
UNIVERSIDAD SANTIAGO DE CALI (2007).Normatividad internapara el uso
de los laboratorios con fines investigativos. Direccin general de
laboratorios. Direccin general de investigaciones. 2p.
VILLANUEVA T, J.E.; CONDEZO H, L.A.; RAMIRES A, E. 2010. Antocianinas,
cido ascrbico, polifenoles totales y actividad antioxidante, en la cscara
de camu-camu (Myrciaria dubia (H:B.K) McVaugh). Universidad Nacional
Agraria de la Selva. Centro de Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico de la Amazona. Tingo Mara Per. 1: 150-160 p
36
VON STASZEWSKI, M. 2011. Impacto de la interaccin entre polifenoles de t
verde y protenas del lactosuero sobre las propiedades biolgicas y
funcionales de las mezclas. Tesis. Universidad de Buenos Aires. 250 p.
WEBSTER, A. 2000. Estadstica aplicada a los negocios y la economa. Trad.
por Yelka Garca. 3 ed. Bogot, Colombia, McGraw-Hill. 638 p.



















37













ANEXO











38
RECTOR
VICERRECTOR
COORD.FIIA
ASISTENTE DE
INVESTIGACIN
JEFE DEL
CIDBAM
COORD.
AGRONOMIA
COORD.
ZOOTECNIA

COORD.
AMBIENTE



A1. Organigrama del Centro De Investigacin para el Desarrollo Biotecnolgico
De La Amazonia (CIDBAM)























39







INDICE GENERAL
I. INTRODUCCION ....................................................................................... 1
II. REVISION BILBIOGRAFICA ..................................................................... 2
2.1. Aspectos generales de ajos sacha ..................................................... 2
2.1.1. Clasificacin taxonmica ...................................................... 3
2.1.2. Caractersticas morfolgicas ................................................ 4
2.2. Antioxidantes ...................................................................................... 4
2.2.1. Funcin de los antioxidantes ................................................ 4
2.2.2. Tipos de antioxidantes ........................................................... 5
2.3. Radicales libres .................................................................................. 6
2.3.1. Radical 1,1 difenil-2-picril-hidrazil(DPPH) ............................. 7
III. PLAN DE TRABAJO .................................................................................. 8
3.1. Funcionamiento del Centro de Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico de la Amazonia . CIDBAM8
3.1.1. Ubicacin8
3.1.2. Organizacin..8
3.1.3. Reconocimiento de reas de trabajo , materiales, equipos y
reactivos..8
3.2. Caracterizacin fsico-qumica y capacidad antioxidante de las hojas
de ajos sacha.8
3.2.1. Mtodos de anlisis.8
40
3.2.2. Caracterizacin fisicoqumica de las hojas de ajos
sacha.8
3.2.3. Polifenoles totales y su capacidad antioxidante de
las hojas de ajos sacha
9

IV. DESARROLLO DEL PLAN DE TRABAJO ............................................. 10
4.1. Del funcionamiento del Centro de Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico de la Amazonia (CIDBAM).10
4.1.1. Ubicacin ........................................................................... 10
4.1.2. Organizacin ..................................................................... 10
4.2. Reconocimiento de reas de trabajo , materiales, equipos y
reactivos .......................................................................................... 11
4.2.1. rea de micropropagacion in vitro de vegetales ................. 11
4.2.2. rea de antioxidantes........................................................... 13
4.2.3. rea de HPLC ...................................................................... 14
4.2.4. rea de cultivo celular15
4.2.5. rea de biologa molecular....17
4.3. Mtodos de anlisis realizado en el CIDBAM ................................. 17
4.3.1. Anlisis qumico proximal .................................................... 17
4.3.2. Cuantificacin de polifenoles Totales .................................. 18
4.3.3. Determinacin de la capacidad antioxidante mediante la
prueba DPPH ...................................................................... 19
4.4. Caracterizacin fisicoqumica de las hojas de ajos sacha.20
4.4.1. Recoleccin y preparacin de Materia prima.20
41
4.4.2. Preparacin de los extractos.21
4.4.3. Caracterizacin fisicoqumico de las hojas de ajos sacha...22
4.5. Capacidad antioxidante de las hojas de ajos sacha23
4.5.1. Cuantificacin de polifenoles totales en hojas de ajos
sacha....23
4.5.2. Determinacin de la capacidad antioxidante de las hojas de
ajos sacha mediante la prueba DPPH.24
V. DISCUSIN ............................................................................................. 26
5.1. Reconocimiento del Centro de Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico de la Amazonia (CIDBAM) ............................................ 26
5.2. Capacidad antioxidante de las hojas de ajos sacha ........................ 27
5.2.1. Cuantificacin de polifenoles totales en hojas de ajos
sacha27
5.3. Determinacin de la capacidad antioxidante de las hojas de ajos
sacha mediante la prueba DPPH ......................................................... 29
VI. CONCLUSIONES .................................................................................... 31
VII. RECOMENDACIONES ............................................................................ 32
VIII. REFERENCIAS CONSULTADAS ........................................................... 33
ANEXOS .......................................................................................................... 37










42

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA
FACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
DEPARTAMENTO ACDEMICO DE CIENCIA Y TECNOLOGA E INGENIERIA DE
ALIMENTOS








PRACTICA PRE - PROFESIONAL

DETERMINACION DE POLIFENOLES TOTALES Y
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN HOJAS DE AJOS SACHA
(Mansoa alliacea (Lam.) A. Gentry.) EN EL CIDBAM-UNAS

EJECUTOR : MEZARINO TARAZONA, Jork Lee Michael
ASESOR : Ing. Msc Roberto Dvila Trujillo
LUGAR : Centro de Investigacin para el Desarrollo
Biotecnolgico de la Amazonia (CIDBAM)
FECHA DE EJECUCIN : Enero Abril del 2013


TINGO MARIA - PERU

2013