Deteccin de mutaciones cromosmicas.

La INESTABILIDAD GENTICA constituye uno de los fenmenos asociados al inicio y progresin de tumores y de algunas enfermedades hereditarias con predisposicin al cncer. Los mecanismos que caracterizan la inestabilidad gentica son: La INESTABILIDAD DE MICROSATLITES, manifestado por un elevado porcentaje de errores en la replicacin de nucletidos repetidos no reparados y la INESTABILIDAD CROMOSMICA, donde las alteraciones, de todo tipo, ocurren a nivel de segmentos cromosmicos. INESTABILIDAD DE MICROSATLITES Los microsatlites son excelentes marcadores genticos y constituyen una valiosa herramienta para el estudio indirecto de errores en la reparacin/replicacin ya que su estructura repetitiva prop icia que la ADN polimerasa se equivoque al copiar la hebra molde del ADN. Existe una gran variedad de metodologas para la determinacin de la inestabilidad de los microsatlites. Se basan, fundamentalmente, en la amplificacin mediante PCR de microsatlites preferiblemente mononucletidos y monomrficos, tanto en ADN procedente de sangre (lnea germinal) como en ADN procedente de muestra tumoral (lnea somtica). La deteccin de nuevos alelos en la muestra tumoral indica la inestabilidad de microsatlites (Fig. 1). INESTABILIDAD CROMOSOMICA La inestabilidad cromosmica es un proceso progresivo de prdida y ganancia de todo o parte de uno o muchos cromosomas en cada ciclo celular. Esta inestabilidad puede derivar en la adquisicin de mutaciones en genes responsables del mantenimiento de la integridad del genoma (Housekeeper genes) y/o en genes que controlan directamente la proliferacin celular (Gatekeeper genes). La hiptesis aceptada del origen de la inestabilidad cromosmica, se inicia por el proceso conocido como acortamiento de los telmeros (determinado por la ausencia de secuencias TTAGGG). Este fenmeno compromete a los extremos terminales de los cromosomas que quedan desprotegidos provocando la formacin de anillos y cromosomas dicntricos. Estas alteraciones cromosmicas pueden originar, en la siguiente divisin, puentes anafsicos que daran lugar a nuevas roturas cromosmicas (alteraciones estructurales) y/o induciran fallos en la cariocinesis como clulas binucleadas y mitosis multipolares en la siguiente divisin (alteraciones numricas). Se inicia as el caos cromosmico que define la inestabilidad cromosmica. (Fig.2) Las mutaciones cromosmicas se clasifican, por tanto, en: Mutaciones numricas; pueden ser causadas por prdida o gan ancia de unos pocos cromosomas en metafase/anafase (aneuploida) o por divisiones multipolares o errores en la cariocinesis asociadas con prdidas y ganancias de gran nmero de cromosomas y estructura de centrosomas. (Figura 3) Mutaciones estructurales; Las inversiones y las translocaciones pueden causar rupturas en los genes supresores de tumores, fusionar genes que producen protenas cancergenas o mover genes a nuevas ubicaciones, donde quedan bajo la influencia de diferentes secuencias reguladoras (Figura 3). Un incremento en el porcentaje de mutaciones cromosmicas resulta en una elevada frecuencia de otras anomalas, algunas de ellas pueden promover la proliferacin de las clulas tumorales y su viabilidad. Este elevado nmero de mutaciones cromosmicas parecen ser un prerrequisito para el proceso oncogentico -inactivacin de genes supresores de tumor y amplificacin de oncogenes-. En cualquier caso, el total de alteraciones cromosmicas es proporcional al riesgo de metstasis. TCNICAS CITOGENTICAS CARIOTIPO Los cromosomas poseen una serie de caractersticas, como la forma, el tamao, la posicin del centrmero y las bandas que presentan al teirse. Este conjunto de particularidades que permite identificar los cromosomas, recibe el nombre de cariotipo. Esta tcnica incluye: Cultivo celular, sacrificio del mismo mediante choque hipotnico y limpieza de la muestra. Los cromosomas as obtenidos son bandeados segn tcnicas convencionales y analizados al microscopio. (Figura 4)

Con esta tcnica se diagnostican las mutaciones cromosmicas estructurales y numricas. Este mismo procedimiento, con algunas modificaciones, puede detectar fenmenos citogenticos que indican la inactivacin de genes supresores y amplificacin de oncogenes: o Prdida de heterocigosidad (LOH) proceso importante en la inestabilidad cromosmica ya que acelera la inactivacin de genes supresores o Microncleos dobles (DM) incluyen copias extra de oncogenes (Myc, Ras, receptor del factor de crecimiento epitelial,..) o Regiones de tincin homognea (HSR) fenmeno por el cual aparecen mltiples copias de un segmento de ADN. o Incremento en el nmero de intercambios de cromtidas hermanas TCNICAS DE CITOGENTICA-MOLECULAR La mayora de stas tcnicas estn basadas en la hibridacin del ADN. Tienen dos principales ventajas: 1. Se pueden obtener resultados tanto de todo un genoma en un microarray, como de un simple loci en una clula. 2. Es posible analizar la organizacin genmica, la estructura y el comportamiento en una simple clula a nivel de ADN y ARN. FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) Esta metodologa consiste en hibridar sondas marcadas con fluorescencia con ADN p ara su visualizacin cromosmica tanto en metafase como en interfase. o CEP-FISH (Chromosome-specific centromeric Enumeration Probes - FISH) Las sondas corresponden a secuencias repetidas (secuencias alfa y beta) localizadas en los centrmeros de los cromosomas. Tcnica empleada para el anlisis de parejas de homlogos en interfase o detectar alteraciones numricas. (Figura 5) o TEL-FISH (Telomeric-FISH), Las sondas contienen la secuencia repetida TTAGGG para hibridar con cada uno de los telmeros cromosmicos (Figura 5). o LSI-FISH (Locus Specific Identifier-FISH) Emplea sondas de ADN especficas (YACs, BACs, PACs, cosmidos) y generalmente se utiliza para el mapeo cromosmico, deteccin de microdeleciones y de microduplicaciones y estudio de locis no mayores de 1Mb. En interfase se puede analizar la organizacin de los genes en el ncleo y su impacto en la actividad transcripcional (Figura 5). o WCP-FISH (Whole Chromosome Painting Probes - FISH) Este mtodo consiste en la hibridacin de todo un cromosoma. Es utilizado en el diagnstico citogentico-molecular para la deteccin de alteraciones tanto numricas como estructurales. o M-FISH (Multiplex- FISH) Las sondas se obtienen por microdiseccin de locis cromosmicos que son marcadas con combinaciones de varios fluorocromos. Con un mnimo de 5 se pueden diferenciar los 24 cromosomas. Para el anlisis de las seales de hibridacin son necesarios diferentes filtros para cada uno de los fluorocromos. Se obtienen as bandas de colores llamadas pseudo-G. (Figura 6) o Fiber-FISH Esta tcnica est basada en la hibridacin fluorescente in situ en fibras de ADN alargadas artificialmente. Es la tcnica de citogentica molecular de ms alta resolucin (alrededor de 2.3Kb). Esta tcnica se aplic primero para el mapeo fsico de fragmentos de ADN y ahora, es frecuentemente empleada, en el anlisis de la organizacin genmica en cromosomas metafsicos, incluyendo grandes deleciones en secuencias gnicas.

o SKY (Spectral Karyotyping) genera un cariotipo codificado por colores. Se hibridan simultneamente los 24 cromosomas. Cada cromosoma es amplificado por PCR con un oligo-primer, para luego marcarlos con una combinacin de fluorocromos hasta detectar 31 variantes de colores. PNA (Peptide Nucleic Acid probing) y PRINS (Primed In Situ labelling reaction) Estas tcnicas de marcaje de sondas tambin pueden aplicarse al anlisis de secuencias hibridadas en cromosomas. Sus ventajas frente a las sondas habitualmente utilizadas en citogentica molecular derivan de su menor tamao. CGH (Comparative Genomic Hybridization) La CGH es una tcnica cuantitativa que compara las seales d e hibridacin en clulas cromosomicamente normales, de un ADN control, marcado con fluorocromo verde y otro ADN tumoral marcado con fluorocromo rojo. Los ADNs compiten por hibridar dando seales que van del el rojo al verde pasando por el amarillo. La CGH permite, por tanto, slo la deteccin de ganancias y prdidas de regiones cromosmicas en todo el genoma del tumor por la comparacin de las intensidades de las seales de hibridacin. (Figura 7) La posibilidad de combinar m-FISH con SKY y con CGH permite conocer en detalle todos los estadios que originan las alteraciones cromosmicas en clulas tumorales y es una poderosa herramienta para investigar el proceso de transformacin neoplsica. INDICACIONES DE TCNICAS CITOGENTICAS Y DE CITOGENTICA-MOLECULAR 1. Una mutacin cromosmica germinal RETINOBLASTOMA. Es un sndrome gentico con un incremento del riesgo de cncer de retina. Las formas hereditarias se transmiten de forma dominante con un 90% de penetrancia. Se caracteriza por la presencia en lnea germinal de una delecin del cromosoma 13, en la regin q14, donde se localiza el gen RB. Este gen acta como supresor de tumor; la mutacin germinal sera la primera mutacin de Knudson (desaparece un alelo del gen RB) y la segunda, la mutacin del otro cromosoma 13 (desaparece la segunda copia del supresor), en este caso adquirida. Dependiendo de la magnitud de la delecin puede detectarse por cariotipo convencional o por LSI-FISH. (Figura 8) Tumor de Wilms (Nefroblastoma). Es la neoplasia urogenital ms frecuente en la infancia (80%) La edad media de diagnstico es 3,5 (50%). La etiologa de este tumor es similar al retinoblastoma. La primera mutacin (Knudson) consiste en la inactivacin del primer alelo del gen supresor WT1 localizado en el cromosoma 11, regin p13. La segunda mutacin puede depender de ms de un gen supresor: WT2 (11p15.5), WT3 (16q), WT4 (17q12-q21), y WT5 (7p15-p11.2). El tumor de Wilms puede ser espordico (80%-90%), asociados a sndromes genticos (10%) o familiar (2%). Los tumores espordicos se originan fundamentalmente por deleciones cromosmicas en 11p13 y 11p15. El riesgo de desarrollar este tumor se incrementa en nios con el sndrome de Beckwith Wiedemann, el sndrome de Denys-Drash, el sndrome de Bloom y en el sndrome WAGR. 2. Los sndromes clsicos de inestabilidad cromosmica Son sndromes caracterizados por un alto porcentaje de roturas cromosmicas y un incremento en la incidencia de tumores con respecto a la poblacin normal. Se deben a mutaciones germinales que dan lugar a la prdida de funcin de enzimas de reparacin, originando un incremento espectacular de mutaciones de todo tipo. Estos sndromes presentan un patrn hereditario autosmico recesivo. Los heterocigotos tambin presentan un mayor riesgo de cncer (Tabla 1). Por ejemplo, la anemia Fanconi es un sndrome de inestabilidad cromosmica originado por mutaciones en al menos 8 loci implicados en la reparacin de ADN. Del mismo modo, las mujeres portadoras de Ataxia Telangiectaxia muestran un riesgo del 100% de padecer cncer de mama. 3. Algunas mutaciones cromosmicas adquiridas o heredadas

Algunas alteraciones cromosmicas adquiridas o heredadas son especficas de tumor y constituyen marcadores de ayuda para confirmar el diagnstico y establecer el pronstico. Estas anomalas son caractersticas en leucemias y sarcomas: t (9;22) en leucemia mieloide crnica, t(3;13)(q35;q14) en el rabdosarcoma alveolar, etc. En tumores slidos son muchos los marcadores identificados: en cncer de cabeza y cuello, la amplificacin del gen CCND1, localizado en 11q13, esta asociado a puentes anafsicos del cromosoma 11. Otros tumores presentan LOH en muchos supresores de tumores, por ejemplo, FHIT en 3p14, INK4A en 9p21 y TP53 en 17p13. En tumores lipomatosos en la mayora de los puentes anafsicos se encuentra amplificadas secuencias en 12q13 incluyendo los oncogenes (SAS, CDK4, HMGIC y MDM2) (Tabla 2). Otros sndromes genticos clsicos que implican prdidas o ganancias de cromosomas tambin tienen un mayor riesgo de padecer determinados tipos de tumores con respecto a la poblacin tumoral (Tabla 3). 4. Mapeo gentico El mapeo gentico consiste en la asignacin fragmentos de ADN a cada cromosoma creando as un mapa gentico. Existen dos tipos: el mapeo gentico que da lugar a una estimacin indirecta de la distancia entre dos grupos de fragmentos, utilizando como unidad de medida los centimorgans, y el mapeo fsico (Figura 9) que estima una distancia real medida en pares de bases. La resolucin de estos mapas comenz con los mapas citogenticos con la resolucin de 1 banda cromosmica de ms o menos 10.000.000 pares de bases, al mapeo de restriccin mediante el empleo de enzimas con un resolucin 10 veces mayor, ms tarde el mapa csmido que emplea secuencias solapadas de ms de 40.000 pares de bases y que consigue resoluciones entre 10.000 y 100.000 pares de bases y por fin el mapeo de secuencias que emplea todas las secuencias conocidas colocndolas en orden en los 46 cromosomas humanos. Supone ms de 3 billones de pares de bases y contiene entre 20.000 y 25.000 genes que codifican para protenas. Para ello se emplean las tcnicas ms modernas de biloga molecular, muchas de ellas englobadas en la citogentica molecular.

Figura 1. Inestabilidad de microsatlites A) Estabilidad de microsatlites en lnea germinal. Los pentanucletidos C y D tienen alelos hipervariables y sirven para confirmar origen comn de los dos tipos de muestras. B) Inestabilidad de microsatlites en lnea somtica. Todos los microsatlites tienen un nuevo alelo.

Figura 2. Inestabilidad cromosmica A) Degradacin de telmeros que provoca la formacin de cromosomas dicntricos y anillos. B) En la siguiente generacin mittica se forman puentes anfasicos C) Los cromosomas con los extremos terminales rotos se fusionan formando en las clulas hijas nuevos dicntricos y anillos D) Del mismo modo los puentes anafsicos provocan alteraciones en la cariocinesis o mitosis multipolares que dan lugar a las alteraciones numricas.

Figura 3. Tipos de mutaciones cromosmicas A) Alteraciones estructurales. En el cariotipo obtenido de mdula sea se seala una translocacin que implica a tres cromosomas. Las flechas indican los cromosomas alterados: un derivado de un cromosoma 9, un derivado del cromosoma 14 y un derivado del cromosoma 22 (cromosoma Filadelfia). B) Alteraciones numricas. Cariotipo triploide obtenido de mdula sea.

Figura 4. Cariotipo Humano A) Corresponde a una metafase obtenida de sangre perifrica B) Los cromosomas son colocados en parejas de homlogos alineados por el centrmero y de mayor a menor formando un CARIOTIPO

A) Ncleo en interfase hibridado con una sonda centromrica del cromosoma 21. B) Metafase hibridada con sondas telomricas. C) Metafase hibridada con una sonda LSI (WHSCR). D) Metafase hibridada con una combinacin de sondas FISH elegidas para identificar un mutacin cromosmica estructural.

Hibridacin in situ fluorescente mltiple (M-FISH). La flecha indica que el cromosoma derivado de un 4 presenta una duplicacin de la banda pseudo-G 4q21

A) ADN extrado de una muestra control (verde) y de una muestra del paciente (roja). B) Los fragmentos de ADN mezclados hibridan con la muestra control empleando como soporte metafases o microarrays. C) Metafase de la muestra control; mediante anlisis microscpico se identifican y localizan las regiones donde hay un exceso (rojo) o un defecto (verde) de ADN del paciente. D) Los fragmentos de ADN hibridan en un microarray, dando lugar a un gradiente de colores que va del rojo al verde pasando por el amarillo que pueden ser descifrados en un analizador de microarrays.

A) Se representa un cromosoma 13 normal junto a un derivado de un 13 originado por una mutacin constitucional que consiste en una delecin que engloba, al menos, la banda 13q14, donde se localiza el gen responsable RB. Esta alteracin se detecta a nivel microscpico. B) El cromosoma 13 normal ha adquirido una mutacin que incluye al menos al gen RB responsable. Esta mutacin puede detectarse por LSI-FISH