INSTITUTO PASTEUR

Bucharest ROMANIA Gnotobiology Laboratory

PRIMER ESTUDIO INFORMATIVO SEMESTRAL DE ACUERDO CON EL No. 510/14.02.2002

MATERIA A ESTUDIAR: LA PRUEBA DE LAS PROPIEDADES ANTI-INFECCIOSAS DEL CAROMIC SI SE UTILIZA EN LA DIETA DE LECHONES

Realizadores: Eugen Bucur, DVM, PhD Marius Necsulescu, DVM, PhD Ana Virgilia Popa, DVM, PhD Andrei Popovici, DVM, PhD candidate Mihai Samarineanu, DVM, PhD Ionut Sorescu, DVM, PhD Andreea Stanica, DVM, PhD candidate

INSTITUTO PASTEUR
Bucharest ROMANIA Gnotobiology Laboratory

Resumen
del primer estudio informativo semestral referido a la prueba de las propiedades anti-infecciosas del CAROMIC (DE ACUERDO CON No. 510/14.02.2002)

- Los productos analizados: CAROMIC (2%, 5%, 10%) designados como C2, C5, C10 y sus dos componentes principales: - AZCARES (2%, 5%, 10%) designados como S2, S5, S10 - TANINOS (2%, 5%, 10%) designados como T2, T5, T 10 - La cepa utilizada en las pruebas : Una cepa altamente patgena (Ref. No. 9055) de Salmonella choleraesuis var kunzendorf (la cual produce septicemia en lechones). - Los animales utilizados : - 5 cerdas embarazadas - 62 cerdos (0-30 das de edad) - Los resultados de las pruebas: 1. Pruebas In vitro: 1.1. Test de aglutinacin rpida (RAT) El CAROMIC dio aglutinacin en E. coli y Salmonella choleraesuis (cepa 9055 y otras) principalmente debido a su contenido en taninos. La aglutinacin en la cepa 9055 tambin se demostr en un extracto antignico (protocolo especial de extraccin). Las dos clases de antgeno (el vivo y el extrado) dieron aglutinacin en RAT. 1.2. Test de inhibicin del crecimiento - Se observ una inhibicin del crecimiento de la cepa 9055 de Salmonella choleraesuis debido al contenido en taninos del CAROMIC.

1.3.

Test de aglutinacin lenta (SAT) La prueba demostr que los 3 productos (C, S, T) concentrados en un 5 y 10% tuvieron una aglutinacin lenta en el antgeno extrado de la cepa 9055 de la Salmonella choleraesuis mediante un protocolo especial. La aglutinacin se pudo observar por SAT incluso en el caso del subproducto S del CAROMIC. Las dos (cuatro) variantes del antgeno extrado dieron resultados similares en SAT lo que dio fiabilidad a los resultados. Test de transformacin linfoblstica (LTT) El componente S del CAROMIC amplific la mitognesis in vitro (las estimulaciones de T y de C fueron bajas ); esto demostr el efecto inmuno-amplificador del CAROMIC. Test de adherencia in vitro/ ensayo de citoadherencia (Girardeau, 1980) Los productos del CAROMIC (C, T, S) (a les tres concentraciones estudiadas) inhibieron significativamente la adherencia de la bacteria de la Salmonella a los entericitos porcinos cuando estaban concentrados en un 50%, en las mezclas utilizadas (clulas + bacteria + producto). El ndice de adherencia (AI) fue negativo (< 0.5) en las tres variantes probadas significando que la adherencia fue inhibida en las tres variantes que se probaron. Entonces el CAROMIC inhibi la adherencia in vitro de la Salmonella choleraesuis, cepa 9055 a los enterocitos porcinos; esto demostr que el CAROMIC par el primer paso de la patognesis que consiste en la adhesin de la Salmonella a los enterocitos.

1.4.

1.5.

2. Pruebas In vivo: 2.1. Test del loop El CAROMIC y sus dos componentes (particularmente el componente S) mostraron un efecto anti-Salmonella enterotoxina. 2.2. Test de adherencia in vivo Slo el producto C10 inhibi la adherencia de la Salmonella a la mucosa intestinal, pero algunos de los otros productos (C5, T5, T10 y S2) presentaron una tendencia hacia esta inhibicin.

II

2.3.

Challenge tests Los productos C2, C5 y C10 dados diariamente per os a los lechones de 4 semanas de vida pararon o disminuyeron la colonizacin del intestino o facilitaron el aclaramiento de la bacteria de la Salmonella. El CAROMIC aument la resistencia a la colonizacin (CR) de Salmonella y tuvo un efecto de exclusin competitiva (CE). Los productos del CAROMIC probados por el challenge test dieron una total inhibicin de la migracin de la Salmonella desde el intestino a los ndulos linfticos mesentricos y al bazo. LTT in vivo La prueba fue ms convincente con las muestras de sangre que mostraron un (muy) alto ndice de estimulacin (SI) con respecto a las del bazo e intestino. El CAROMIC podra ser confirmado por esta prueba corroborada con la misma que se hizo in vitro como poseedor tanto de un efecto inmuno-amplificador como de un efecto antiinfeccioso (Salmonella). X X X

2.4.

III

Los productos probados (*): suspensiones del 2, 5 y 10% en agua destilada esterilizada (SDW) del CAROMIC y sus dos componentes como muestra la tabla siguiente: Designado como C2 C5 C10 S2 S5 S10 T2 T5 T10

CAROMIC

(C)

FRACCIONES DE AZCAR (S)

FRACCIONES DE TANINO S (T)

- 2% - 5% - 10% - 2% - 5% - 10% - 2% - 5% - 10%

N.B. Para la adherencia (in vivo, in vitro), el test del loop y el test de la transformacin linfoblstica (LTT) los productos se esterilizaron por autoclavacin a 121oC durante 15 minutos. La cepa probada (usada en todos los tests tanto in vitro como in vivo): - Ref. no. 9055 (coleccin del Instituto Pasteur), una cepa altamente patgena de la Salmonella choleraesuis var kunzendorf, grupo serolgico C (que produce septicemia en lechones), aislada de la mdula sea de un lechn. - Caractersticas de la cepa 9055 en el test API 20E:

1. Pruebas in vitro : 1.1. Test de aglutinacin rpida (RAT) 1.1.1. Cepa 9055 de Salmonella choleraesuis C2 : + S2 : + T 2: ++ C5 : + S5 : T 5: + C10 : + S10 : + T 10: +++ Observaciones: - Debido al contenido en taninos que posee el CAROMIC se observ una aglutinacin en la cepa 9055. - La aglutinacin es proporcional a la concentracin creciente. 1.1.2. Otras cepas de Salmonella choleraesuis (coleccin del Instituto Pasteur) Cepa vacunal Campos de cepas Sm 237 Cepa 3311 Cepa 21747 C2 C5 C10 1.1.3. Cepas de E.Coli (coleccin del Instituto Pasteur) Cepa 890 Cepa Cepa 193 no patgena (EPEC) hemoltica usada como control en el test del loop C2 + C5 + C10 + Observaciones generales: el CAROMIC tiene efecto de aglutinacin en E. coli y en Salmonella choleraesuis que depende, sin embargo, de la cepa y de la concentracin del producto.

1.2. La prueba de inhibicin del crecimiento de la cepa 9055 en placa de agar SS Inhibicin del crecimiento en agar SS C2 + (cultivo no muy abundante) C5 + (cultivo no muy abundante) C10 + (cultivo no muy abundante) S2 - (cultivo abundante) S5 - (cultivo abundante) S10 - (cultivo abundante) T2 + (solo 5 colonias) T5 ++ (solo 1 colonia) T 10 ++ (solo 1 colonia) Observaciones: Hay una inhibicin del crecimiento de la cepa 9055 de la Salmonella choleraesuis debido al contenido de taninos en el CAROMIC. 1.3. Test de aglutinacin lenta (SAT) N.B. El antgeno fue extrado mediante un protocolo especial y fue usado tambin para un RAT. SAT VarianteI (4% antgeno) Variante II (antgeno como en el tubo II, escala Brown) Antgeno Antgeno Antgeno Antgeno RAT entero diludo entero diludo 1:50 1:50 1/40 + 1/50 ++ 1/40 ++ 1/50 ++ 1/80 ++ + 1/50 +++ 1/80 ++ 1/100 ++ 1/160 ++ + 1/50 + 1/20 ++ 1/50 + 1/40 ++ 1/40 + 1/50 ++ 1/40 ++ 1/100 ++ 1/80 ++ 1/50 ++ 1/40 ++ 1/50 ++ 1/40 ++ 1/100 ++ 1/80 ++ + 1/100 ++ 1/80 ++ 1/200 ++ 1/160 ++ +++

C2 C5 C10 S2 S5 S10 T2 T5 T10

Observaciones: a) RAT con extracto antignico (protocolo especial) fue positivo solo para C y T, y solo para las concentraciones del 5 y 10%. Este resultado tiene una correlacin relativamente buena con el RAT llevado a cabo con el antgeno vivo de la cepa 9055 (ver 1.1.1.).
3

b) El SAT muestra que los tres productos (C, S, T) presentan a las concentraciones del 5 y 10% una aglutinacin lenta en el antgeno extrado de la Salmonella choleraesuis, cepa 9055. Esto significa que incluso el subproducto S del CAROMICpodra dar, por SAT, aglutinacin. Las dos variantes del antgeno dieron resultados similares en SAT lo que confirma la validez de los resultados. 1.4. Test de transformacin linfoblstica (LTT) - Los linfocitos sanguneos de 2 cerdos fueron cultivados en un medio 199 + 10% de suero fetal bovino (FBS) + 80 g/ml de gentamicina. - Variantes de cultivos de linfocitos sanguneos son estimulados con fitohemoaglutinina (PHA) y tratados con CAROMIC (C), sus componentes (S y T) y ciclofosfamida (CPA): 1. PHA (30 g/ml) 2. PHA (30 g/ml) 3. PHA (30 g/ml) + C (50 g/ml) 4. PHA (30 g/ml) + C (100 g/ml) 5. PHA (30 g/ml) + C (200 g/ml) 6. C (100 g/ml) 7. PHA (30 g/ml) + T (50 g/ml) 8. PHA (30 g/ml) + T (100 g/ml) 9. PHA (30 g/ml) + T (200 g/ml) 10. T (100 g/ml) 11. PHA (30 g/ml) + S (50 g/ml) 12. PHA (30 g/ml) + S (100 g/ml) 13. PHA (30 g/ml) + S (200 g/ml) 14. S (100 g/ml) 15. PHA (30 g/ml) + ciclofosfamida (CPA) (100 g/ml) 16. PHA (30 g/ml) + CPA (100 g/ml) + C (100 g/ml) 17. Control negativo (linfocitos sanguneos en la media) Los resultados se observan en la siguiente tabla.

Variantes Cerdo I

PHA 30 x 1+2 (16.3) 100 76

PHA+ C50 3

PHA + C100 4

PHA + C200 5

C100 6 -

PHA + T 50 7

PHA + T100 8

PHA + T 200 9

T 100 10 -

PHA + S50 11

PHA + S100 12

PH S

143.5 14.5

200.6 19.7

58.3 30

21.5 171.0

46.0 ?

23.9 255.2

97.5 ?

165.0 178.9

19

Cerdo II 100

11

NB1 - La mitognesis (transformacin blstica) fue evaluada mediante examen microscpico. - Con las variantes tratadas (C, T, S, CPA) la mitognesis se expresa como % de la variante tratada solo con PHA la cual se considera el 100%. Observaciones a) S amplific la mitognesis, p ero T y C lo hicieron parcialmente o en una proporcin menor. b) S inmunoestimul los linfocitos independientemente del potencial inmunolgico, pero la inmunoestimulacin de C depende del potencial inmunolgico. c) El resultado de la inmunoestimulacin de C puede deberse a su componente T (). d) Por su componente S, C tiene un potencial de inmunoestimulacin tambin. NB2 - La LTT in vitro ser repetida.

1.5. Test de adherencia in vitro /ensayo de citoadherencia Se hizo uso de los enterocitos porcinos y de la Salmonella choleraesuis, cepa 9055. Despus de tres lavados y centrifugaciones consecutivas, se prepararon tres variantes de mezclas (tabla de abajo). Las muestras fueron preparadas a partir de todas las mezclas y despus tintadas con las tcnicas de May-Grnwald-Giemsay Gram. Las muestras se observaron bajo la luz del microscopio(x 1000). El ndice de adherencia (AI) fue determinado para todas las variantes calculando el nmero medio de bacterias adheridas a los microvilli de 100 enterocitos. El test de citoadherencia es positivo cuando AI > 0.5. Smbolo del producto C2 C5 C10 T2 T5 T 10 S2 S5 S10 Control A Control B Variante I AI 0.49 0.38 0.27 0.33 0.36 0.45 0.42 0.48 0.44 0.94 0.49 Variante II AI 0.29 0.27 0.19 0.30 0.24 0.21 0.25 0.18 0.23 0.94 0.49 Variante III AI 0.14 0.15 0.22 0.06 0.24 0.10 0.07 0.20 0.18 0.94 0.49

pH del producto 3.80 3.24 3.60 4.66 4.79 4.78 4.58 4.32 4.46 -

Variante I: 800 l de clulas + 4 l de producto + 800 l de bacteria (concentracin del producto final = 0.25%) Variante II: 800 l de clulas + 400 l de producto + 400 l de bacteria (concentracin del producto final = 25%) Variante III: 800 l de clulas + 800 l de bacteria + 800 l de producto (concentracin del producto final = 50%) Control A: Clulas + bacteria Control B: Clulas + 0.5% D manosa + bacteria x = valores medios SD = desviacin estndar VC = coeficiente de variabilidad

Observaciones en las tres variantes Variante I El examen citolgico de las preparaciones a estudiar revel la presencia intracelular de un gran nmero de bacterias con respecto a otras variantes. Se situaron perinuclearmente o alrededor del pice final de los entericitos; su nmero oscila entre 2 a 4/10 enterocitos. El AI era parecido al del control: x = 0.42, SD = 7.31, VC 18.17%. Variante II La bacteria intracelular detect entre 1-3 clulas/20 enterocitos. Algunas estructuras esferoides (20-40 micras de dimetro), a las que estaban adheridas un nmero variable de bacterias, fueron detectadas en el campo de visin del microscopio. Parte de estas estructuras fueron localizadas en la superficie de los microvilli de los entericitos que se encontraban entre ellas y las bacterias. El AI fue ms bajo que el de la variante I: = 0.24, SD = 4.21, VC = 17.55%. Variante III No se detectaron bacterias intracelulares. Numerosas estructuras bacilares o esferoides dispuestas en lnea o en agregaciones y a las cuales se adhirieron grupos de clulas bacterianas, se detectaron en el campo de visin del microscopio. Parecidas a las que se hallaron en las preparaciones de la variante II, stas estaban cubriendo el borde del cepillo de los entericitos dificultando la adhesin bacteriana. El AI detectado fue el ms bajo: = 0.15, SD = 6.47, VC = 42.81%. Observaciones generales en el test de citoadherencia - La concentracin del producto final del 50% del CAROMIC inhiba significativamente la adherencia de la bacteria a los enterocitos (ver variante III). El AI, sin embargo, es negativo (< 0.5) en las 3 variantes, lo que significa que la adherencia fue inhibida en las tres.

2. Pruebas In vivo 2.1. Test del loop Inoculacin del loop Control positivo (medio + cepa 9055) Negative control (medio) C2 + cepa 9055 C5 + cepa 9055 C10 + cepa 9055 T2 + strain 9055 T5 + cepa 9055 T10 + cepa 9055 S2 + cepa 9055 S5 + cepa 9055 S10 + cepa 9055 Control negative (medio) Control positivo (medio + cepa 9055) Cerdo 1 + + + + + Cerdo 2 + +? + + + +? + Cerdo 3 + + + + +

+ El loop es ms grande y est lleno de lquido (la Salmonella estimuldebido a su enterotoxina una reaccin positiva del loop) - El loop es normal (la enterotoxina de la Salmonella est ausente o inhibida por el CAROMIC ) N.B. Con los controles negativos del cerdo 2, el resultado +? puede explicarse por la inoculacin difusa de los loops. Observaciones: El CAROMIC (y sus componentes T y especialmente S ) mostr cualidades anti-Salmonella enterotoxina. 2.2. Test de adherencia in vivo N.B. La prueba se llev a cabo en los loops que resultaron del test del loop despus de lavarlos 5 veces con 10 ml de solucin salina.

Contenido del Loop antes de los lavados (ver el test del loop)

Cerdo 1 Agar Agar SS Rambach

Cerdo 2 Agar Agar SS Rambach

Cerdo 3 Agar Agar SS Rambach

Control positivo 1 + + + + + + Control positivo 2 + + + + + + C2 + + + + + + C5 + + + + C10 + + T2 + + + + + T5 + + + + T10 + + + + S2 + + + + S5 + + + + + + S10 + + + + + + + Las colonias de Salmonella estn presentes - Las colonias de Salmonella estn ausentes Observaciones: Solo C10 inhibi la adherencia de la Salmonella a la mucosa intestinal, pero se poda observar una cierta tendencia hacia la inhibicin con C5, T5, T10 e incluso S2. 2.3. Challenge tests 2.3.1. El challenge test comparativo - 9 lechones, sin la Salmonella (comprobado por el examen bacteriolgico del fluido rectal en Agar SS y en Agar Rambach) divididos en 3 grupos (Tabla): a) Cy-, Salm. +, CAR- (3 cerdos) b) Cy+, Salm. +, CAR - (3 cerdos) c) Cy+, Salm. +, CAR + (3 cerdos) Cy (ciclofosfamida) (inmunosupresor) - 2 comprimidos (= 100 mg)/da/cerdo, suspensin en solucin salina, per os, 4 das (Tabla). Salmonella choleraesuis (cepa 9055) - 1 x 108 CFU/cerdo/da, per os, 5 das (Tabla) mezclado con bilis (1 parte de bilis + 9 partes de caldo de cultivo de Salm. )
CAROMIC

- 5 ml de suspensin 5% en SDW/cerdo/da x 14 das (Tabla), per os.

- Los supervivientes fueron sacrificados el da 15 del experimento (da 8 despus de la infeccin por Salmonella ) y fueron recogidas muestras para exmenes bacteriolgicos (colonizacin, translocacin), exmenes histopatolgicos, exmenes TEM y LTT. - Exmenes clnicos todos los das. - Las tomas de temperatura y los lavados rectales se hicieron 1 da antes de la infeccin por Salmonella y 4 das despus de la ltima infeccin por Salmonella .

10

Grupos de cerdos Cy-, Salm. +, CARCerdos 1, 2 y3 Cy-, Salm. +, CARCerdos 4, 5 y6 Cy-, Salm. +, CARCerdos 7, 8 y9 1 2 3 Infeccin por Salm. 4 Infeccin por Salm 5 Infeccin por Salm

Das experimentales
6 Infeccin por Salm 7 Infecci n por Salm 8 9 10 11 12 13 14 15 sacrifi cio

Cy

Cy

Salm. + Cy

Salm. + Cy

Salm. + Cy

Salm.

Salm.

Muere el cerdo 4 (no apropiado para los tests)

CAR

sacrifi cio

Cy +
CAR

Cy +
CAR

Salm. + Cy +
CAR

Salm. + Cy +
CAR

Salm. + Cy + CAR

Salm. +
CAR

Salm. + CAR

CAR

CAR

CAR

CAR

CAR

CAR

sacrifi cio

11

Los resultados de los exmenes bacteriolgicos en el challenge test comparativo: - Los resultados negativos de colonias de Salmonella en agar SS y en agar Rambach en los fluidos rectales recogidos un da antes de la infeccin por Salmonella confirmaron que los 9 cerdos estaban libres de Salmonella. - Los resultados del examen bacteriolgico en las placas de agar SS de los fluidos rectales recogidos 4 das antes de la ltima infeccin por Salmonella confirmaron la presencia de infeccin por Salmonella en los cerdos 1, 2, 3, 4, 5 y 6 (no tratados con CAROMIC) y la ausencia de Salmonella en los cerdos 7, 8 y 9 que fueron tratados con CAROMIC (!). - Los resultados del examen para la colonizacin (en los intestinos grueso y delgado) y para la translocacin (en los ndulos linfticos mesentricos y en el bazo)son presentados a continuacin:
Cerdo n. Colonias de Salmonella en agar Rambach Colonias de Salmonella en agar SS Intestino Intestino Bazo Ndulos Intestino Intestino Bazo Ndulos delgado grueso linfticos delgado grueso linfticos mesentr mesentr icos icos + + + +++ + +++ + Muertos antes del examen + + ++ ++ +++ +++ -

1 2 3 4 5 6 7 8 9

N.B: Los resultados son parecidos en los dos tipos de medio de agar! Observaciones: 1. El CAROMIC par la translocacin, no la colonizacin (ver credos 7, 8 y 9 tratados con CAROMIC ). 2. La influencia de la ciclofosfamida fue inconcluyente, por lo que renunciamos a ella en los siguientes challenge tests. Los resultados de la LTT en el challenge test comparativo fueron inconcluyentes. Los resultados de los tests histolgicos de los exmenes TEM en este challenge test comparativo estn en progreso.

12

2.3.2. Los challenge tests para C2, C5, C10 El esquema general aplicado a las pruebas del challenge - Grupos de hasta 10 cerdos de dos grupos de edades (2 y 4 semanas de vida). - Los productos que van a ser probados (C, S, T en concentraciones de 2, 5 y 10% en SDW) fueron y sern dados diariamente per os en las siguientes cantidades: - 1-3 das de edad: 1 ml/cerdo/da - 4-9 das de edad: 2 ml/cerdo/da - 10-20 das de edad: 5 ml/cerdo/da - 21-28 das de edad: 8 ml/cerdo/da -Las categoras de cerdos de 2 semanas: - Alrededor de los 6 das de edad: Los animales sern checkeados para comprobar que no tienen Salmonella usando fluidos rectales lavados y el agar SS y/o el agar Rambach. - La infeccin por Salmonella se llev y se llevar a cabo los das 7, 8, 9 y 10 de vida con un caldo de cultivo 1 x 108 CFU por cerdo al da usando una mezcla inocula (1 parte de bilis + 9 partes de cultivo); la presencia de infeccin por Salmonella fue confirmada por los exmenes de los fluidos rectales lavados en placas de agar. - Alrededor de los 15 das de edad los animales fueron examinados clnicamente (con medida de la temperatura) y despus sacrificados para tomar muestras (sangre para suero, sangre con heparina para LTT y partes de rganos), y para los exmenes bacteriolgico, histolgico y TEM. El examen bacteriolgico se hace para la colonizacin del intestino (grueso y delgado) y para la translocacin de la bacteria en los ndulos linfticos mesentricos y en el bazo. - Las categoras de cerdos de 4 semanas de edad - Alrededor de los 16 das de edad: examen clnico, medida de la temperatura y anlisis de los animales sin Salmonella. - Infeccin por Salmonella : Los das 17-22 de vida de la misma forma que se hizo con las categoras de cerdos de 2 semanas de edad. - Alrededor de los 29 das de vida los animales fueron sacrificados por las mismas rezones que los animales que tenan 2 semanas de vida.

Los resultados del challenge test realizado en el primer semestre del perodo acordado: El challenge test para C2 (4 semanas)
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- La prueba empez con una cerda que dio a luz a 10 cerdos, solo 2 cerdos permanecieron con vida, teniendo en cuenta los accidentes tecnolgicos, hasta el final de la prueba. - Los cerdos en esta prueba no tenan Salmonella antes del challenge test. - A los 32 das de su nacimiento los 2 cerdos que gozaban de buena salud fueron sacrificados para hacer pruebas. - La presencia de infeccin por Salmonella en el grupo fue confirmada por RAT llevado a cabo con el suero de los 2 cerdos: - Cerdo 1: + - Cerdo 2: +++ - Los resultados del examen bacteriolgico:
Colonizacin Intestino delgado Intestino grueso Cerdo nmero Cerdo 1 Cerdo 2 Agar SS + Agar Rambach Agar SS + Agar Rambach Translocacin Ndulos linfticos Bazo mesentricos Agar SS Agar Agar SS Agar Rambach Rambach +? (1 colonia H2 S+)

Observaciones: C2 par la translocacin en los 2 cerdos y la colonizacin en uno de los dos animales. La concentracin tan reducida (2%) se podra explicar porque C2 fue ineficiente en el aclaramiento de la bacteria del intestino en ese caso ?! El challenge test para C10 (4 semanas) - Animales: una cerda que dio a luz a 9 cerdos (solo 5 cerdos siguieron viviendo al final de la prueba, el resto murieron teniendo en cuenta los accidentes tecnolgicos). - Ningn animal tena la Salmonella antes del challenge test. - Los 5 cerdos supervivientes estaban muy bien de salud cuando fueron sacrificados a los 29 das para realizar otras pruebas. N.B: Esta prueba con C10 demostr que CAROMIC fue tolerado por los credos cuando slo tenan 1 da de vida (100% de fiabilidad).

- Los resultados del RAT llevado a cabo con el suero de 5 animales confirmaron la presencia de infeccin por Salmonella en este experimento: Cerdo 1: ++ Cerdo 2: ++
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Cerdo 3: ++ Cerdo 4: + Cerdo 5: + - Los resultados del examen bacteriolgico (la Tabla siguiente) confirman que el CAROMIC (10%) tena una buena actividad anti-Salmonella en el cuerpo de los cerdos lactantes porque el aclaramiento de los grmenes del intestino fue bueno y porque par la translocacin de la bacteria.
Colonizacin Intestino delgado Intestino grueso Cerdo nmero 1 2 3 4 5 Agar SS +? +? Agar Rambach +? Agar SS +? +? Agar Rambach +? +? Translocacin Ndulos linfticos Bazo mesentricos Agar SS Agar Agar SS Agar Rambach Rambach -

El challenge test para C5 (4 semanas) - Animales: una cerda que dio a luz a 13 cerdos (solo 8 cerdos sobrevivieron al final de del experimento). - Los 8 supervivientes no tenan Salmonella antes del challenge test y fueron sacrificados en un buen estado de salud a los 29 das para realizar otras pruebas. - Los resultados del RAT mostraron que la infeccin por Salmonella estaba presente en los cerdos: Cerdo 1: ++ Cerdo 5: ++ Cerdo 2: ++ Cerdo 6: + Cerdo 3: + Cerdo 7: ++ Cerdo 4: ++ Cerdo 8: + - Los resultados de los exmenes bacteriolgicos (la tabla siguiente) confirmaron que el producto C5 produca un buen aclaramiento de la Salmonella del intestino (excepto cerdo n. 5) y par la translocacin de la bacteria del intestino.

Colonizacin Intestino delgado Intestino grueso Cerdo nmero 1 Agar SS Agar Rambach Agar SS Agar Rambach 15

Translocacin Ndulos linfticos Bazo mesentricos Agar SS Agar Agar SS Agar Rambach Rambach -

2 3 4 5 6 7 8

-? -

+ -

N.B: El resultado + en el intestino delgado fue confirmado, por RAT y por tests bioqumicos, que era Salmonella del grupo C. El challenge test como control de la infeccin por Salmonella - Animales: Una cerda que dio a luz a 8 cerdos (uno todava vive). - 6 animales murieron por salmonelosis septicmica natural a los 9 das, el sptimo se sacrific para realizar pruebas a los 12 das, siendo positivo, gracias al examen bacteriolgico, para la translocacin bacteriana. Se confirm que estas bacterias eran Salmonella choleraesuis, cepa 9055-infectada; la infeccin fue natural (se guardaron los animales en una habitacin contaminada). Observaciones: Esta infeccin natural confirm el poder patolgico de la cepa 9055 utilizada en los challenge tests. El challenge test para C5 (2 semanas) Animales: una cerda que di a luz 8 cerdos, uno de los cuales muri por un accidente tecnolgico. De los 7 que quedaron, 6 estaban libres de Salmonella y uno tena Salmonella del grupo C en el fluido rectal; el examen se hizo en agar SS antes de la infeccin de Salmonella cepa 9055. Este caso nico positivo se confirm por RAT (con un suero monovalente del grupo C). Los 7 cerdos se sacrificaron para realizar otras pruebas a los 18 das. Los resultados del examen bacteriolgico (tabla de abajo) confirmaron que el producto C5 par la colonizacin del intestino (o ayud al aclaramiento de la bacteria) de 5 de los 7 cerdos y tambin par la translocacin de la Salmonella del intestinote 6 de los 7 cerdos.

Colonizacin Intestino delgado Intestino grueso Cerdo nmero 1 Agar SS + Agar Rambach + Agar SS + Agar Rambach + 16

Translocation Ndulos linfticos Bazo mesentricos Agar SS Agar Agar SS Agar Rambach Rambach -

2 3 4 5 6 7

+ -

+ -

+ -

Observaciones generales de los challenge tests para C (2, 5, 10) - Los productos C2, C5, C10 dados diariamente per os a credos de hasta 4 semanas mostraron un buen efecto anti-Salmonella en el intestino porque pararon o disminuyeron la colonizacin del intestino (una resistencia incrementada a la colonizacin por Salmonella) o facilitaban el aclaramiento de la bacteria del intestino (el efecto de exclusin competitiva). Incluso si la colonizacin no est totalmente parada, el mejor efecto de los productos del CAROMIC se demostr por el bloqueo de la translocacin de la Salmonella desde el intestino hasta los ndulos linfticos mesentricos y el bazo. 2.4. LTT in vivo Esta prueba se llev a cabo en muestras de sangre heparinizadas, en el bazo y en fragmentos terminales del yeyuno recogidos de algunos cerdos matados al final de los challenge tests. Los resultados del LTT son dados en la tabla como ndice de estimulacin (SI) : Categora y Intestino nmero de cerdo C2 (4 semanas) Cerdo 1 3 Cerdo 2 2 Cerdo 3 1.5 Cerdo 4 Cerdo 5 C5 (2 semanas) Cerdo 1 1 Cerdo 2 Cerdo 3 C5 (4 semanas) Cerdo 1 Cerdo 2 Cerdo 3 0.7
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Bazo

Sangre

7 2 -

182, 57 43, 87.5 63 51 49 18 52 37 21 8 20

Cerdo 4 Cerdo 5

1 -

20 14.5

- = Contaminacin bacteriana, no clulas, no mitosis SI > 2 = Estimulacin Observaciones del LTT in vivo: 1) El SI es muy bueno en la sangre pero no est influenciado por la concentracin del producto. 2) Hacia la prueba in vivo la estimulacin de los linfocitos podra estar influenciada por la infeccin por la Salmonella tambin. 3) Corroborando los resultados de la LTT in vitro e in vivo los productos del CAROMIC son confirmados como poseedores de un efecto inmuno-amplificadory de otro anti-infeccioso. X X X N.B. Los challenge tests in vivo continuarn.

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