Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2009. Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed.

Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.

Determinacin de coliformes totales por cuenta en placa

OBJETIVOS Comprender y realizar adecuadamente la determinacin de coliformes totales en un alimento, mediante la cuenta en placas vertidas. Interpretar los resultados obtenidos, de acuerdo con las normas aplicables.

GENERALIDADES La definicin generalmente aceptada para el trmino coliformes describe a estos microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas, aunque algunos pueden ser fermentadores tardos o no fermentadores, como Citrobacter y Serratia, respectivamente. La mayora de los coliformes pueden encontrarse en la flora normal del tracto digestivo del hombre o animales, por lo cual son expulsados especialmente en las heces, por ejemplo Escherichia coli. Por esta razn, su presencia constante en la materia fecal, los coliformes son el grupo ms ampliamente utilizado en la microbiologa de alimentos como indicador de prcticas higinicas inadecuadas. Como los coliformes tambin pueden vivir en otros ambientes, se distingue entre coliformes totales y coliformes fecales. Esta prctica se refiere a coliformes totales. El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para: La deteccin de prcticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricacin de los alimentos. La evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto, aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario, cuando los coliformes son de origen no-fecal. Evaluacin de la eficiencia de prcticas sanitarias e higinicas en el equipo. La calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de agua utilizados en las diferentes reas del procesamiento de alimentos.

La demostracin y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivos lquidos o slidos con caractersticas selectivas o diferenciales. Para la cuenta en placa se usa el agar-lactosa-bilis-rojo violeta (ABRV).

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FUNDAMENTO Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se desarrollan en ABRV, el cido producido por la fermentacin de la lactosa, ocasiona el vire del indicador rojo neutro y la precipitacin de las sales biliares por lo que las colonias son color rojo oscuro y generalmente estn rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas, de color rojo claro o rosa. La posibilidad de contar las colonias se fundamenta en su dispersin y separacin, como se explic en la tcnica de preparacin de diluciones. NOTAS Cuando se utiliza el medio de agar bilis rojo violeta (ABRV) para la cuenta en placa de coliformes, debe considerarse lo siguiente: Si el alimento contiene mono o disacridos en altas concentraciones, stos pueden ser fermentados por otro grupo de microorganismos, generando colonias semejantes a las de coliformes. El medio no debe esterilizarse ni sobrecalentarse por lo que se debe utilizar antes de 3 h. a partir de su preparacin; en cuanto se disuelva el agar se debe colocar en bao de agua a 45 C para mantenerlo fundido, hasta el momento de utilizarlo. Debe ponerse una sobrecapa de medio una vez que las placas vertidas han solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, ms adecuadas para los coliformes. El sobrecalentamiento del medio y las variaciones en las condiciones de incubacin, especialmente la incubacin prolongada, pueden ocasionar la formacin de colonias rojas de cocos Gram positivos. El rango estadstico para tener confiabilidad en el aspecto cuantitativo (de sensibilidad del mtodo) es de 15 a 150 UFC por placa. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se vierten los medios de cultivo en las cajas con las muestras de diluciones, no debe exceder de 20 minutos. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 1 matraz erlenmeyer de 250 mL con 90.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.0 0.2 o agua peptonada. a 2 a 4 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapn de rosca, con 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.0 0.2 o agua peptonada. a 5 a 9 tubos de ensayo sin labio, de 22 x 175 con 20.0 mL de agar bilis rojo violeta c/u, o un matraz erlenmeyer con 125.0 a 210.0 mL. a

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MATERIAL Y EQUIPO Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de 1.0C, provista con termmetro calibrado. a Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadrculada y lente amplificador. b Registrador mecnico o electrnico b Microscopio ptico b Bao de agua con termmetro calibrado, que mantenga la temperatura a 45 1.0 C. a Utensilios estriles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas) para tomar muestra a Propipetaa Pipetas bacteriolgicas de 10 mL, estriles, con algodn en el extremo superior (las necesarias de acuerdo con el nmero de diluciones). a Pipetas bacteriolgicas de 1 mL, estriles, con algodn en el extremo superior. (las necesarias de acuerdo con el nmero de diluciones) a Pipetas Pasteur estriles a, b 4 a 8 cajas Petri estriles, de 15 x 100 mm. a Stomacher (homogeneizador peristltico). a Bolsas estriles para stomacher. a

NOTAS
a b

Material necesario al inicio de la prctica Material necesario a las 24 y 48 horas de iniciada la prctica

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DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES POR CUENTA EN PLACA

Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL de 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

10-1
Pesar 10 g de muestra en condiciones de Homogeneizar la muestra con 90.0 mL de diluyente

10-2

10-3

10-4

Depositar 1.0 mL de cada dilucin en cajas de Petri estriles por duplicado Adicionar de 15 a 20 mL de agar bilis rojo violeta fundido y enfriado a 45 C en cada placa

Homogeneizar la muestra con el agar haciendo movimientos rotatorios

Incubar las cajas en posicin invertida 24 h/ 37 C

Contar aquellas placas que tengan entre 15 a 150 colonias y reportar como UFC/g o mL de muestra
4

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PROCEDIMIENTO 1. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la tcnica de Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Recordar que el rango de sensibilidad del mtodo es de 15 a 150 colonias por placa. 2. Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin y la adicin de medio de cultivo se puedan realizar cmoda y libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de colocar el inculo. 3. Inocular por duplicado, 1.0 mL de la dilucin correspondiente en cada caja, mediante pipeta estril y verter de 18.0 a 20.0 mL del medio ABRV fundido y mantenido a 45 1.0 C en bao de agua. El tiempo transcurrido entre la preparacin de la dilucin primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos. 4. Mezclar cuidadosamente el inculo con el medio, mediante seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrs para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri sobre una superficie horizontal fra. No permitir que se mojen las tapas de las cajas. 5. En cuanto el medio solidifique, agregar a cada caja, una sobrecapa de 4 5 mL del mismo medio fundido y mantenido a 45 C, no permitir que se mojen las tapas de las cajas. La sobrecapa de agar se coloca para favorecer el crecimiento de los coliformes, que son facultativos. Dejar que solidifique. 6. Preparar una caja control con 18.0 a 20.0 mL de medio para verificar la esterilidad. 7. Solidificado el medio invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35 C, durante 24 2 h. 8. Despus de este periodo, contar las colonias con el contador de colonias. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias tpicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitacin debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfologa colonial es semejante a lentes biconvexos con un dimetro de 0.5 a 2.0 mm. 9. Si hay desarrollo extendido o un nmero de colonias superior al del rango de sensibilidad del mtodo, aplicar las reglas indicadas en el inciso de RESULTADOS de la prctica de Cuenta de Bacterias en Placa. Hacer uso del microscopio para resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de las pequeas partculas de alimento. CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS Para seleccionar cajas y reportar, seguir las indicaciones de la prctica Cuenta de Bacterias en Placa.
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Reportar como se indica a continuacin, con dos cifras significativas y potencias de 10. Coliformes totales en placas de agar bilis rojo violeta, incubadas por 24 + 2 h a 35 C: _____ UFC / g (o / mL) de muestra. BIBLIOGRAFA Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. Secretara de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Norma Oficial Mexicana. Mxico. Secretara de Salud. NOM-113-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodos para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa. Norma Oficial Mexicana. Mxico. Secretara de Salud. NOM-092-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. Norma Oficial Mexicana. Mxico. Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) Enterobacteriaceae, Coliforms, and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 69-82. International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005) Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

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