TCNICAS DE TINCIN

TCNICAS DE TINCIN

AcuaNatura NDICE

1. Introduccin 2. Tipos de tinciones 2.1. Tincin de Gram 2.2. Tincin cido alcohol resistencia 2.3. Tincin de esporas 2.4. Tincin negativa 3. Precauciones

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TCNICAS DE TINCIN 1. Introduccin

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El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste entre la clula y el medio que la rodea es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse tambin para localizar estructuras especficas en la clula o para distinguir entre tipos diferentes de clulas. Las clulas generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. Para las bacterias la fijacin por el calos es lo ms corriente, aunque tambin puede fijarse con sustancias qumicas como formaldehdo, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin se realiza habitualmente en clulas que han sido secadas sobre un portaobjetos, tratando despus ste con el agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce generalmente el encogimiento de las clulas, la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudn. Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente. Un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de modo que ahora s podr atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopia son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie.

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TCNICAS DE TINCIN 2. Tipos de tinciones 2.1. Tincin de Gram

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Tambin puede utilizarse a menudo un mtodo que no tie igualmente todas las clulas, un proceso denominado tincin diferencial. La tincin de este tipo ms extensamente utilizada es la tincin de Gram, denominada as por el bacterilogo dans Hans Christian Gram, quien la desarrollo. Sobre la base de su reaccin a la tincin de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos grupos, grampositivas y gramnegativas. Debido a su importancia en taxonoma bacteriana y a que indica diferencias fundamentales de la pared celular de las distintas bacterias, describiremos aqu con cierto detalle la tincin de Gram. Las clulas fijadas al calor sobre un portaobjetos se tien primero con una solucin de cristal violeta (otros colorantes bsicos no son tan efectivos) y son lavadas despus para quitar el exceso de colorante. En este estado todas las clulas, tanto las gramnegativas como las grampositivas, estn teidas de azul. El portaobjetos se cubre entonces con una solucin de yodo (I2) yoduro potsico (KI). El ingrediente activo es aqu el yodo, el yoduro potsico simplemente hace soluble el yodo en agua. El yodo entra en las clulas y forma un complejo insoluble en agua con el cristal violeta. De nuevo tanto las clulas grampositivas como las gramnegativas se encuentran en la misma situacin. Se lleva a cabo despus de la decoloracin, usando bien alcohol o bien acetona, sustancias en las que es soluble el complejo yodo cristal violeta. Algunos organismos (grampositivos) no se decoloran mientras que otros (gramnegativos) lo hacen. La diferencia esencial entre esos dos tipos de clulas est, por lo tanto, en la resistencia a la decoloracin. Despus de la decoloracin las clulas grampositivas son todava azules, pero las gramnegativas son incoloras. Para poner de manifiesto las clulas gramnegativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste las clulas gramnegativas son rojas mientras que las grampositivas permanecen azules.

Figura 13: La tincin de Gram. Deben destacarse dos aspectos cruciales de la tincin de Gram: 1) El tratamiento con cristal violeta debe preceder al tratamiento de yodo. El yodo por s solo tiene poca afinidad con las clulas. 2) La decoloracin debe realizarse con poco agua para evitar que pierdan la tincin las clulas grampositivas. El proceso de decoloracin debe ser corto y es esencial un clculo preciso del tiempo para obtener resultados satisfactorios. Editado por: 4

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Finalmente, el carcter de grampositivo no es siempre un fenmeno del todo o nada. Algunos organismos son ms grampositivos que otros y algunos son gramvariables, es decir, unas veces grampositivos y otras gramnegativos. La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio bacteriolgico. 2.2. Tincin cido alcohol resistencia Esta tincin sirve principalmente para clasificar micobacterias y actinomicetos, que tienen un alto contenido en lpidos y en cidos miclicos y que no pueden ser calificadas por la tincin de Gram. Para empezar se hecha sobre el portaobjetos una mezcla de fucsina fenol, en la que la fucsina hace de colorante rosa y el fenol de mordiente. Las clulas se tien de rosa, tanto las cido alcohol sensibles como las resistentes. Despus se usa un decolorante orgnico que hace que las bacterias cido alcohol sensibles se decoloren mientras que las cido alcohol resistentes se quedan rosa. Como en la tincin de Gram se utiliza un colorante de contraste que en este caso es el azul de metileno que tie las clulas cido alcohol sensibles de color azul quedando las clulas cido alcohol resistentes de color rosa.

Figura 14: La tincin cido alcohol resistencia. 2.3. Tincin de esporas Se utiliza para teir las estructuras de resistencia llamadas endosporas bacterianas. Sobre el portaobjetos con la preparacin se echa verde malaquita que tie las clulas de verde. Luego se lava con agua destilada con lo que las clulas se quedan incoloras y las endosporas permanecen verde. Finalmente se usa la safranina para obtener bacterias de color rosa mientras que las endosporas continan con su color verde del verde malaquita.

Figura 15: La tincin de esporas. Editado por: 5

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TCNICAS DE TINCIN 2.4. Tincin negativa

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Es el reverso del procedimiento de tincin usual: las clulas se dejan sin teir pero se colorea un cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil de las clulas. La sustancia utilizada para la tincin negativa es un material opaco que no tiene afinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las clulas, tal como la tinta china (que es una suspensin de partculas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorante negro insoluble en agua). La tincin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contraste de las clulas en microscopia ptica, pero su mxima utilidad est en revelar la presencia de cpsulas alrededor de las clulas bacterianas.

Figura 16: La tincin negativa, bacterifago T4.

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TCNICAS DE TINCIN 3. Precauciones

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Se dispone de otras tcnicas de tincin que pueden utilizarse para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.

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