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Fundamentos Analisis Cromatografico
Fundamentos Analisis Cromatografico
Dr. JOS ANTONIO FERNNDEZ LPEZ Depto. Ingeniera Qumica Grupo de Investigacin QUIMYTEC UPCT
Cmo interaccionan?
En general, una cromatografa se realiza permitiendo que la mezcla de molculas que se desea separar (muestra) interaccione con un medio o matriz de soporte que se denomina fase estacionaria. Un segundo medio (la fase mvil) que es inmiscible con la fase estacionaria se hace fluir a travs de sta para "lavar" (eluir) a las molculas en la muestra.
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La alta presin permite usar relleno de tamao de partcula reducido para lograr la separacin de componentes a flujos razonables.
Otras acepciones equivalentes: high pressure liquid chromatography high patient liquid chromatography high priced liquid chromatography
bombas que permiten presiones de hasta 6000 psi (414 atm) hacen pasar la fase mvil por el interior de 4 columnas de acero (2-5 mm x 3-25 cm) que contienen la fase estacionaria con flujos de 0,1 10 ml/min.
ser
Una muestra en estado lquido es arrastrada por una corriente lquida llamada eluyente. Como fase estacionaria acta un slido finamente dividido (dimetro de partcula 3, 5, 10 m), o una pelcula lquida a l adherida. Dependiendo de la retencin de los componentes de la muestra por la fase estacionaria y de su solubilidad en el eluyente se provocar su migracin diferencial.
Parmetros:
Naturaleza de la fase estacionaria Tamao de partcula Eluyente (composicin y flujo) Detector
Fase Directa:
fase estacionaria polar fase mvil de baja polaridad
Fase Reversa:
fase estacionaria de polaridad baja fase mvil de polaridad alta
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Principales
de
interaccin
en
Adsorcin superficial
Exclusin molecular
La fase estacionaria es slida. La separacin se logra por las diferencias en solubilidad (en fase mvil) y de retencin por adsorcin (en fase estacionaria) de la mezcla de solutos.
ms comunes.
Tanto las molculas de solutos como de disolvente son
de elucin y la selectividad adecuadas. Normalmente un disolvente apolar (n-hexano) unido a otro ms activo 10 (acetona, cloruro de metilo, etc.).
La separacin se basa en el reparto o distribucin de los solutos entre una fase mvil lquida y otra estacionaria inmiscible, soportada sobre un slido inerte. La discriminacin se produce por diferencias de solubilidad.
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extraccin en contracorriente.
Las especies ms retenidas sern las que presenten
mayor afinidad (solubilidad) por la fase estacionaria que por la fase mvil (eluyente).
La separacin de los solutos se basa en las diferencias en
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polar y fase mvil polar. Inicialmente tuvo ms auge la fase normal pero en la
actualidad son ms comunes los mtodos cromatogrficos en fase reversa dada la naturaleza hidroflica de las muestras de mayor inters (clnico, contaminacin, alimentos). 13
Segn empleemos fase directa o fase reversa se nos va a alterar el orden de elucin de bandas y el tiempo de anlisis.
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Tanto fase estacionaria como fase mvil son de naturaleza inica. La iones de la fase estacionaria son de carga opuesta a los del eluyente.
R A+ + R+ A +
B+ B
' '
R B+ + R+ B +
A+ A
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(inorgnicos y orgnicos).
Las molculas intercambiadoras se ligan a soportes
especficos.
El material intercambiador de la fase estacionaria es de
dimetro de partcula pequeo (1-10 m) y estructura microporosa o pelicular con capacidad de cambio muy baja respecto al material intercambiador convencional (10-2 10-3 meq/g).
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inerte (gel) que permite la discriminacin entre los solutos segn su tamao.
Los analitos de mayor tamao no pueden penetrar en los
poros de la fase estacionaria y son excluidos, viajando con la fase mvil en el frente de la misma.
Se muestra especialmente til para determinar el rango
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Parmetros de un cromatograma.
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SMBOLO
seg.
seg.
-seg.
---
k= tR/tM
RS = 2 [(tR2- tR1) / (w2 + w1)]
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disolventes deben desgasificarse antes de uso empleo en HPLC. burbujas en la columna o en el detector.
Desplazamiento con un gas menos soluble (He) Aplicacin de vaco Sonicacin Calentamiento
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Presin estable hasta 5000 psi 1 atm = 14,696 psi (400 atm) Flujo libre de pulsaciones Amplio rango de flujos (0,1 a
10 mL/min)
Control,
Componentes
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loop correspondiente
Se debe evitar la entrada de burbujas en el sistema de
inyeccin
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de menor tamao
Fases qumicamente liga-
empaquetado
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Algunas
casas comerciales permiten la renovacin del relleno sin tener que comprar la columna completa cuerpo puede ser presurizado para aumentar su eficiencia
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Fase Reversa
C-2 o RP-2 C-8 o RP-8 C-18 o RP-18
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que miden propiedad de la fase mvil que miden propiedad de los solutos
una una
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INTRODUCCIN A LA HPLC
DETECTOR
INTRODUCCIN A LA HPLC
DETECTOR
Comparacin de detectores usados en HPLC
Detector UV/VIS ndice de refraccin Dispersin de luz Fluoresecencia Conductividad Espectrometra de masas Lmite deteccin 0,1 1 ng 100 1000 ng 0,1 1 ng 0,001 0,01 ng 0,5 1 0,1 1 ng Permite Gradiente S No S S No S
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INTRODUCCIN A LA HPLC
DETECTOR UV/VIS
Para sustancias que absorben radiacin UV/VIS El ms usado Con lmparas de deuterio, xenon o wolframio Desde 190 a 900 nm
Camino ptico de la microcelda de un detector UV/VIS. Las celdas ordinarias tienen 0,5 cm de camino ptico y contienen 8 L de lquido
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INTRODUCCIN A LA HPLC
DETECTOR UV/VIS
Longitudes de onda de corte en el UV de disolventes usados en HPLC
Disolvente Acetona Acetonitrilo Agua Cloroformo ter Dietlico n-Hexano Metanol Tetrahidrofurano Tolueno Longitud de onda 330 nm 190 nm 190 nm 245 nm 215 nm 195 nm 205 nm 212 nm 284 nm
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INTRODUCCIN A LA HPLC
DETECTOR FOTODIODOS
Permite registrar la absorbancia simultnea en todo el rango UV/VIS. La muestra es atravesada por luz blanca (todas las ) y el policromador dispersa la luz en las diversas que la componen y las hace incidir a la fila de fotodiodos. En cada diodo incide una diferente, que manda la informacin al sistema de anlisis de datos.
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0,55 0,50
0,45
0,40
0,35
0,60
300,00 280,00
0,40
Cafena - 5,357
AU
0,20
nm
6,00
7,00
5,00
6,00
7,00
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sensibilidad.
Son muy sensibles a las variaciones de temperatura.
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fluorescentes.
Se seleccionar la exc y la em. Son de alta sensibilidad. No se ven interferidos por los disolventes al no tener
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no absoluta.
Empleados fundamentalmente en cromatografa de
intercambio inico.
Inconvenientes:
Baja sensibilidad Sensibles a impurezas de la fase mvil.
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corriente de N2 dejando una nube de finas partculas slidas que entran en la zona de deteccin.
Las partculas se detectan por la
mvil.
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