INMOVILIZACIN DE ENZIMAS

Prof. J.M.Snchez-Montero Grupo de Biotransformaciones Departamento de Qumica Orgnica y Farmacutica. Fac. Farmacia

INMOVILIZACIN DE ENZIMAS DEFINICIN: CONFINAMIENTO FSICO DE UNA ENZIMA O CLULA EN UNA DETERMINADA REGIN DEL ESPACIO, DE MANERA QUE SU ACTIVIDAD CATALITICA SE RETENGA, Y PUEDA SER REUTILIZADA. 1971, 1er Enzyme Engineering Conference, Henniker, New Hampshire, USA. POSTERIOR SIMPLIFICACIN DEL TRMINO: BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS ENZIMAS, CLULAS ENTERAS U ORGNULOS CELULARES (O BIEN COMBINACIONES DE ELLOS) QUE SE ENCUENTRAN EN UN ESTADO TAL QUE SE PERMITE SU REUTILIZACIN
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PARA UNIFICAR CRITERIOS A LA HORA DE CARACTERIZAR UN CATALIZADOR INMOVILIZADO, EL WORKING PARTY ON APPLIED BIOCATALYSIS, ENCUADRADO DENTRO DE LA FEDERACIN EUROPEA DE BIOTECNOLOGA DEFINI UNAS LNEAS MAESTRAS (GUIDELINES) CON OBJETO DE RESPONDER A PREGUNTAS TIPO: QU CANTIDAD DE ENZIMA LIBRE SE NECESITA PARA PREPARAR UN BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO ACTIVO? QU PARMETROS GOBIERNAN UNA REACCIN BIOCATA LIZA DA ? QUE RENDIMIENTO COMPARADO PRESENTA UNA REACCION BIOCATALIZADA POR ENZIMAS O CLULAS LIBRES FRENTE A SISTEMAS INMOVILIZADOS?
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REQUISITOS MNIMOS PARA PODER CARACTERIZAR UN BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO 90.- DESCRIPCIN GENERAL. 90.1.- ESQUEMA DE REACCIN 90.2.- ENZIMA Y MICROORGANISMO 90.3.- TIPO DE SOPORTE 90.4.- MTODO EMPLEADO PARA LA INMOVILIZACIN 91.- PREPARACIN DEL CATALIZADOR INMOVILIZADO. 91.1.- MTODO DE INMOVILIZACIN, CONDICIONES DE REACCIN. 91.2.- RENDIMIENTO POR PESO SECO, ACTIVIDAD DEL SOBRENADANTE.
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92.- CARACTERIZACION FISICO- QUIMICA. 9 9 9 9 9 9 2.1.-FORMA DEL BIOCATALIZADOR 2.2.-DIMETRO MEDIO DE PARTCULA HMEDA 2.3.-CAPACIDAD DE HINCHAMIENTO 2.4.-COMPORTAMIENTO EN COLUMNAS (COMPRESIBILIDAD) 2.5.-ABRASIN EN REACTORES AGITADOS 2.5.-ABRASIN EN REACTORES DE LECHO FLUIDIZADO.

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93.-CINETICA DEL BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO. 93. 1.-ESTUDIO DE LA VARIACIN DE LA VELOCIDAD INICIAL DE REACCIN FRENTE A LA VARIACIN DE LAS CONCENTRACIONES DE ENZIMA Y DE SUSTRATO. 93.2.- EFECTO DEL TIPO DE BUFFER Y DEL pH. 93.3.- LIMITACIONES DIFUSIONALES EN EL SISTEMA (EFECTO DEL TAMAO DE PARTCULA Y LA CARGA ENZIMTICA) 93.4.- GRADO DE CONVERSIN FRENTE A TIEMPO DE RESIDENCIA. 93.5.- ESTABILIDAD DEL BIOCATALIZADOR EN EL ALMACENAMIENTO (VELOCIDAD INICIAL RESIDUAL TRAS EL ALMACENAMIENTO A DIFERENTES TIEMPOS EN DIFERENTES CONDICIONES.) 93.6.- ESTABILIDAD OPERACIONAL (VELOCIDAD INICIAL RESIDUAL DESPUS DE DIFERENTES CICLOS CATALTICOS)..

OBJETIVO: MAYOR REPRODUCIBILIDAD

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VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIN 9PUNTO DE VISTA BIOQUMICO

9VENTAJAS: 91.- Disminucin de problemas de autolisis (proteasas) o de agregacin, al estar limitados los movimientos rotacionales y translacionales. 92.- Se ralentizan los cambios conformacionales, por lo que se pueden estudiar las relaciones estructura-funcin. 93.- Se pueden simular reacciones in vivo. 94.- Se pueden simular sistemas estructuralmente asimtricos (ej. estudios de membranas). 95.- En sistemas entrecruzados, se pueden fijar interacciones con fosfolpidos, polisacridos... para simular orgnulos celulares. 96.- La unin multipuntual a soportes deformables permite estudiar la deformacin de protenas globulares.
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VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIN

9PUNTO DE VISTA BIOQUMICO 9DESVENTAJAS: 91.- Generalmente, se disminuye la actividad enzimtica al inmovilizar. 92.- Si la preparacin enzimtica no es homognea, se dificulta la interpretacin de los datos. 93.- A veces, se pueden originar contactos protena-protena indeseados.

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VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIN

9PUNTO DE VISTA APLICADO 9VENTAJAS: 91.- Se produce un gran aumento de la estabilidad de la enzima o clula inmovilizada. 92.- Se aumenta de gran manera la productividad enzimtica por la capacidad de reutilizacin. 93.- Se aumenta la facilidad de recuperacin y purificacin de los productos. 94.- Se puede elegir entre una gran variedad de diseos ingenieriles 95.- Se aumenta la facilidad de operacin y control del proceso, al trabajar en condiciones ms suaves.

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VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIN

9PUNTO DE VISTA APLICADO 9DESVENTAJAS: 91.- Generalmente, se disminuye la actividad enzimtica. 92.- Se aumentan los problemas difusionales. 93.- Se aumenta el costo del proceso. 94.- El intervalo de pH de trabajo puede ser distinto al del biocatalizador nativo.

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MTODOS DE INMOVILIZACIN: Existen varias metodologas. 1.- RETENCIN QUMICA 1.1.- Enlaces covalentes 1.2.- Enlaces no covalentes. Adsorcin. 1.3.- Reticulado (cross-linking) 2.- RETENCIN FSICA = ATRAPAMIENTO 2.1.- Atrapamiento en matrices. 2.1.1.- En geles o polmeros. 2.1.2.- Micelas reversas. 2.2.- Atrapamiento en membranas. 2.2.1.- En fibras huecas. 2.2.2.- En reactores de membrana.
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1.- RETENCIN QUMICA 1.1.- Enlaces covalentes 1.2.- Enlaces no covalentes. Adsorcin. 1.3.- Reticulado (cross-linking)

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2.- RETENCIN FSICA = ATRAPAMIENTO 2.1.- Atrapamiento en matrices. 2.1.1.- En geles o polmeros. 2.1.2.- Micelas reversas. 2.2.- Atrapamiento en membranas. 2.2.1.- En fibras huecas. 2.2.2.- En reactores de membrana.

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Mtodos qumicos
E E

Mtodos fsicos

E E E E E E E E E E

Enlace covalente Entrecruzamiento Intramolecular

Atrapamiento en gel polimrico

Adsorcin (no covalente) Atrapamiento en fibras

E+ E+

E E E E E

- - Microencapsulacin Adsorcin inica

E E

Atrapamiento en liposomas

Entrecruzamiento Intramolecular

E E E E E
E E

Copolimerizacin de la enzima modificada con un monmero insaturado en un gel 3D

Atrapamiento en lminas de un polmero semipermeable

Atrapamiento en fibras huecas

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ELECCIN DEL MTODO DE INMOVILIZACIN:

C O M P AR A C I N D E LO S M TO D O S
M T O D O IN C L U S I N M E M B R AN AS AT R AP A M IEN T O R ET IC U L AD O AD SO R C I N U N I N C O VAL EN T E

PR EP AR A C I N

IN T ER M ED IA

D IF C IL

IN T ER M ED IA

SEN C IL L A

D IF C IL

F U ER Z A D E L A U N I N

D B IL

M ED IA

D EB IL -M ED IA

M ED IA

F U ER T E

AC T IV ID AD EN Z IM T IC A R EG EN ER AC I N D EL SO PO R T E

M ED IA-AL T A

B AJ A

B AJ A

M ED IA-AL T A

AL T A

PO SIB L E

IM PO S IB L E

IM PO S IB L E

PO SIB L E

D IF C IL

C O ST E

M ED IO -AL T O

M ED IO

M ED IO

B AJO

AL T O

EST AB IL ID AD

M ED IA

AL T A

AL T A

B AJ A

AL T A

VAL ID EZ

G EN ER AL

G EN ER AL

L IM IT AD A

G EN ER AL

L IM IT AD A

R ES IST EN C IA A C O N T AM IN A C I N

SI

SI

SI

NO

NO

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REQUISITOS LGICOS MNIMOS

9La enzima o clula debe ser estable en las condiciones experimentales empleadas. 9Si se emplean agentes entrecruzantes, stos no deben afectar al centro activo. Si pudieran interferir con ste, se debe utilizar un agente entrecruzante lo ms grande posible. 9Si es posible, se debera proteger el centro activo: 9si existen grupos -SH, stos deben hacerse reaccionar con cistena o glutation, para reactivarse posteriormente tras la inmovilizacin. 9se puede realizar la inmovilizacin en presencia de concentraciones saturantes de sustrato. 9El proceso de lavado no debe afectar negativamente a la enzima. 9Coherencia con la posterior biotransformacin. 9si soporte = polianin, la conversin de un sustrato aninico ser muy difcil (repulsin) 9enzima atrapada en un gel: si el sustrato presenta un alto peso molecular, el resultado ser malo. 9Gran importancia de las propiedades mecnicas (estabilidad del soporte, forma fsica del mismo) 9El soporte debe presentar una alta superficie especfica, para minimizar los problemas de transferencia de materia. 9 El soporte debe conferir al derivado inmovilizado una buena resistencia a la contaminacin microbiana. 9El soporte debe permitir que se inmovilice una alta cantidad de biocatalizador (alto "loading"). 9El soporte debe ser comercialmente accesible: 9bajo precio 9buena disponibilidad
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