Quinta parte

Las herramientas moleculares

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Captulo 16

Extraccin de cidos nucleicos

Luisa I. Falcn y Aldo Valera

Los cidos desoxiribonucleico (ADN) y ribonucleico (ARN) son polmeros de nucletidos formados por un azcar de cinco carbones (desoxiribosa en el ADN y ribosa en el ARN), una base nitrogenada (que puede ser adenina, timina, citosina, guanina o uracilo) y una molcula de fosfato. El ADN es la macromolcula que contiene la informacin gentica de las clulas procariontes, eucariontes y de los adenovirus. El ARN est involucrado en la sntesis de protenas y constituye el material gentico de los retrovirus (Madigan et al., 2000). La expresin de los genes es la base del metabolismo celular, y por sta se entiende que el ADN se transcribe en ARN, que a su vez se traduce en protenas. Esta secuencia ADN-ARN-protenas constituye el dogma central de la biologa molecular. Hay tres tipos de ARN: El ARN mensajero (mARN), que se sintetiza durante la transcripcin gracias a la ARN polimerasa, est conformado por codones, que son secuencias de tres pares de bases que codifican un aminocido en especfico. El ARN de transferencia (tARN) permite el vnculo entre el tARN y los aminocidos, ya que en un extremo cuenta con un aminocido y en el otro, con una secuencia de tres pares de bases llamada anticodn, a la que se une el codn del mARN. El ARN ribosomal (rARN), que constituye la mayor parte del ARN en las clulas, forma junto con protenas a los ribosomas, que facilitan el aco499

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plamiento especfico entre el mARN y los tARN para la traduccin; los ribosomas estn compuestos por tres subunidades de rARN de diferentes tamaos en los eucariontes (23S, 18S y 5S) y procariontes (23S, 16S y 5S). Los estudios contemporneos de ecologa molecular se han esforzado en entender las funciones metablicas de los diferentes componentes biolgicos presentes en el ambiente y en conocer la diversidad biolgica mediante el uso y aplicacin de tcnicas moleculares basadas en la amplificacin de diversas regiones del ADN y ARN. La deteccin de la expresin de los genes o la presencia de mARN especficos nos permitir acercarnos a temas como el impacto de los diferentes componentes fsicos y biolgicos del ambiente en la expresin del ADN (ya que la simple presencia de ADN no nos indica la actividad de los genes), as como a la regulacin metablica de las enzimas que son esenciales en el papel ecolgico que juegan los organismos dentro de su ecosistema (ciclos biogeoqumicos, bioremediacin, reciclaje de nutrientes), entre otros.

El ADN en el laboratorio
Precauciones El trabajo de biologa molecular requiere de una serie de precauciones para no contaminar las muestras con cidos nucleicos extraos. Es necesario limpiar las reas de trabajo con solventes como el cido clorhdrico (10%), sosa (NaOH, 0.5 N) y/o etanol (70%). Tambin hay que utilizar guantes para proteccin personal y para evitar contaminar las muestras, as como trabajar con materiales y soluciones estriles. Se recomienda trabajar en una campana de flujo laminar y si es posible, someter el material a radiacin ultravioleta de 5 a 10 minutos para degradar cualquier cido nucleico presente.

ADN
Colecta de materiales en campo El ADN es muy estable y slo se requiere mantener las muestras congeladas antes de su extraccin. Muchos investigadores las guardan y congelan en el buffer de extraccin (siguiente seccin).

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Mtodos de extraccin En la extraccin de los cidos nucleicos, stos se separan de cualquier otro compuesto proveniente de las clulas o del ambiente del cual se tomaron las muestras (p. ej. en muestras de suelos debemos considerar la alta concentracin de cidos hmicos, que son materia orgnica parcialmente degradada que no es soluble en agua a pH bajo y tiene un poder quelante muy alto, por lo que interfieren con la amplificacin del ADN). Inicialmente es necesario llevar a cabo una lisis para liberar al ADN del interior celular, para lo cual se utilizan los buffers de extraccin que contienen 1) detergentes, como sodio dodecilo sulfato (SDS) a una concentracin final del 1% o Triton X al 0.5%; 2) una molcula quelante (p. ej. EDTA, cido etileno amino tetra actico, 50mM), que tiene cuatro grupos carboxilo y dos grupos amino, cuya forma completamente de-protonizada puede unirse a cualquier complejo metlico en solucin, quitando a los cationes de la solucin para desestabilizar la membrana celular e inhibir a las ADNasas; 3) sales (p.ej. cloruro de sodio, NaCl 20mM), que forman una capa inica suave que recubre al ADN protegindolo y ayudando a evitar su degradacin; 4) Tris-HCl 20mM con pH entre 7.5 y 8.2 para mantener el pH de la solucin estable; 5) proteinasa K (concentracin final 0.5 ml ml-1) para degradar protenas o enzimas. Durante este paso con buffer de extraccin es comn someter la muestra a tres o cuatro ciclos de incubacin a temperaturas entre los 50C y 70C alternados con agitacin de la muestra (manual, con vrtex o en homogenizadores celulares utilizando micro esferas) e incubacin a 4 C. La temperatura de incubacin no puede ser mayor a los 80C, ya que a esta temperatura se comienza a degradar el ADN. Estas incubaciones facilitan la ruptura de lpidos en la membrana celular, permitiendo la liberacin del ADN de la estructura celular. Posteriormente, resulta necesario tratar las muestras con dos extracciones de fenol para eliminar las protenas (como nucleasas); para ello se agrega de fenol el mismo volumen de la muestra, se mezcla bien (vrtex), centrifuga a 10,000 xg (tres minutos), recuperando el sobrenadante con cuidado de no acarrear las protenas que quedan en la interfase. Hay que considerar que no todos los paquetes comerciales de extraccin llevan a cabo este paso, por lo que se podra observar una degradacin de las muestras por nucleasas con el tiempo, aun cuando se guarden en el congelador. Despus de la extraccin con fenol, es comn llevar a cabo otra extraccin con cloroformo para acabar de limpiar la muestra de cualquier residuo lipdico. Una vez ms, hay que agregar igual volumen de cloroformo que el de la muestra, mezclar bien (vrtex)

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y centrifugar para recuperar el sobrenadante. Una vez concluido este paso, se lleva a cabo la precipitacin del ADN con etanol absoluto y con una sal a alta concentracin (p.ej. acetato de sodio a una concentracin final de 0.3 M; cloruro de sodio a una concentracin final de 0.2 M; acetato de amonio a una concentracin final de 2.5 M o cloruro de litio, concentracin final 0.8 M). Por otra parte, con la adicin de la sal, el ADN que est cargado negativamente va a obtener una capa inica positiva que permite su precipitacin. La eleccin de qu sal usar depende de lo que se quiera hacer con el ADN despus de su extraccin; por ejemplo, no se debe utilizar precipitacin con acetato de sodio si el ADN va a ser fosforilado con una quinasa polinucleotdica; el cloruro de sodio puede ser usado si hay SDS en la solucin ya que esta sal permite que el SDS permanezca en solucin en presencia de etanol. Por otra parte, el alcohol en la solucin de precipitacin se utiliza para remover la concentracin residual de sales y promover la precipitacin del cido nucleico. Cuando se trata de muestras con baja concentracin de cidos nucleicos, comnmente se utiliza un volumen de muestra de isopropanol, en lugar de dos volmenes de muestra cuando se trabaja con etanol. La precipitacin del ADN es casi inmediata en presencia de la sal y el alcohol, sin embargo se recomienda incubar la muestra durante 20 minutos a -80C o durante 45 minutos a -20C. Posteriormente, se centrifuga la muestra (15 minutos a 10,000 xg), se remueve la fase acuosa y se lava la pastilla de ADN con etanol al 70% para eliminar todas las sales que permanezcan en la solucin. Las muestras se vuelven a centrifugar (un minuto a 10,000 x g), se elimina el etanol y se deja secar el ADN (15 minutos a 37 C o media hora a temperatura ambiente) hasta que no haya mas trazas de alcohol.

Protocolos de extraccin de ADN implementados en el laboratorio de Evolucin Molecular y Experimental del Instituto de Ecologa
En el laboratorio se han utilizado tres tipos de mtodos para extraccin de ADN, que se han modificado de protocolos previos propuestos por algunos autores como Doyle y Doyle (1987): Extraccin de ADN en bacterias gram negativas Extraccin de ADN en plantas Extraccin de ADN en animales

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Estos mtodos se caracterizan por no requerir en ningn momento del uso de paquetes comerciales, las soluciones requeridas son elaboradas en el laboratorio y pueden ser modificadas segn requerimientos particulares. La extraccin de ADN por estos mtodos combina procesos qumicos, fsicos y mecnicos e incluye bsicamente tres pasos: 1. Lisis celular 2. Eliminacin de protenas 3. Precipitacin y limpieza del ADN Nuestros mtodos de extraccin de ADN presentan algunas ventajas y desventajas respecto a otros mtodos: son econmicos, no se manejan compuestos qumicos txicos o contaminantes al ambiente y se obtienen grandes cantidades de ADN; pero por otro lado, la pureza del ADN no es absoluta y en algunas especies se obtiene un ADN parcialmente degradado (en pedazos). Paralelamente, tambin se han usado paquetes comerciales cuando se requiere ADN de alta calidad o bien se trata de organismos de cierto grado de complejidad como algunas bacterias gram positivas o plantas que naturalmente producen gran cantidad de compuestos secundarios. Algunos paquetes comerciales de alto rendimiento son:
PURIGEN QUIAGEN MILIPORE GENTRA

MoBio

En algunos casos hemos modificado los protocolos de uso de dichos paquetes, esto con el fin de ajustarlos a los requerimientos de los organismos en estudio o para mejorar los resultados obtenidos.

Extraccin de ADN de bacterias gram negativas

1. Obtener un cultivo nuevo de bacterias. En un microtubo de 1.5 ml agregar 0.5 ml de sulfato de magnesio 10 mM y resuspender en l una asada de bacterias.

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2. Centrifugar a 4500 xg por 3 minutos y eliminar el sobrenadante perfectamente escurriendo las muestras en papel secante. 3. Resuspender en 300 l de buffer Tris HCl2 0.1M pH 8. 4. Adicionar 40 l de lisozima (20 mg/ml) y 5l de ARNasa (7000 U/ml). 5. Incubar a 37 C por 5 min., posteriormente a -20C durante 10 min. y finalmente a 85 C durante 10 min. Entre cada incubacin, mezclar vigorosamente. 6. Agregar 20 l de proteinasa K (20 mg/ml). 7. Incubar a 70C durante 10 min., durante la incubacin invertir manualmente 5-10 veces. 8. Centrifugar a 8 000 xg durante 1 min. 9. Recuperar el sobrenadante (aprox. 250 l ), sin tocar el botn y transferir a un tubo nuevo. Adicionar 150 l de isopropanol absoluto fro (a -20 C). 10. Incubar a -20 C durante 30 min. 11. Centrifugar a 10 000 xg durante 3 min. Eliminar perfectamente el sobrenadante. 12. Limpiar el botn con 300 l de etanol al 70% agitando brevemente en vrtex. 13. Centrifugar a 10 000 xg por 3 min. Eliminar perfectamente el sobrenadante. 14. Secar perfectamente el botn a 65 C por 5 min. y resuspender en 50 a 00l de agua pura, desionizada y estril. Un mtodo alternativo y muy eficiente es utilizar las soluciones del paquete de la marca PUREGENE, al que aplicamos las siguientes modificaciones: Tratamiento previo 1. Cultivar las bacterias en medio slido, pobre en nutrientes, durante el tiempo necesario para obtener un crecimiento abundante pero de clulas jvenes. 2. En un tubo de 1.5 ml estril agregar 0.5 ml de sulfato de magnesio 10 mM. 3. Agregar una asada pequea de bacterias (calculando una cantidad de 2 colonias medianas) y homogeneizar perfectamente pipeteando suavemente. 4. Incubar en hielo durante 10 min. 5. Centrifugar a 7000 xg durante 5 min. a 4 C. 6. Eliminar totalmente el sobrenadante colocando los tubos boca-abajo en un papel secante.

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Lisis celular 1. Agregar 300 l de solucin de lisis y resuspender las clulas pipeteando suavemente varias veces. 2. Incubar a 80C por 5 min. Es conveniente mezclar invirtiendo los tubos 5-10 veces. 3. Incubar a 20C por 5 min. 4. Mezclar vigorosamente durante 10 seg. Tratamiento con ARNasa 1. Agregar 4 l de solucin de ARNasa. 2. Mezclar invirtiendo los tubos 25-30 veces. 3. Incubar a 37C durante 15-30 min. Conservar en hielo. Precipitacin de protenas 1. 2. 3. 4. Agregar 100 l de Solucin de Precipitacin. Mezclar vigorosamente durante 20 seg. Centrifugar a 10 000 xg por 3 min. Tomar 300 l del sobrenadante, cuidando de no tocar el botn y transferirlos a un tubo nuevo. Conservar en hielo. Precipitacin de ADN 1. Agregar 300 l de isopropanol absoluto y fro (a -20C). 2. Mezclar invirtiendo los tubos 50 veces. Dejar reposar durante 1 hora a -20C. 3. Centrifugar a 8 000 xg durante 1-2 min. 4. Eliminar el sobrenadante y escurrir perfectamente los tubos en papel secante. 5. Agregar 300 l de etanol fro al 70%. Mezclar vigorosamente durante 5 seg. 6. Centrifugar a 10 000 xg y eliminar perfectamente el sobrenadante escurriendo en papel secante. 7. Incubar el botn a 65C durante 1 min. ventilar en la campana de flujo laminar por 5 min.

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Hidratacin del ADN 1. Agregar de 20 a 50 l de Solucin de Hidratacin. 2. Incubar a 65C durante 5min.

Extraccin de ADN en plantas

Para la extraccin de ADN en plantas hemos usado con xito los siguientes protocolos, que son modificados del protocolo original conocido como miniprep (Doyle y Doyle, 1987). Con estos protocolos hemos extrado ADN de varios grupos de plantas como agavceas, conferas, crasulceas, cactceas, leguminosas, entre otras. El protocolo bsico es el siguiente: Mini-prep 1. En un mortero moler alrededor de 1 g de tejido con nitrgeno lquido hasta obtener un polvo fino. 2. Agregar 1 ml de buffer CTAB 2X y seguir moliendo. Recuperar en un microtubo de 1.5 ml. 3. Centrifugar a 8 000 xg durante 8 min. a 4C. 4. Eliminar el sobrenadante y resuspender con 600 l de CTAB 2X. 5. Incubar a 60C durante 10 min. 6. Agregar 600 l de cloroformo:octanol 24:1, agitar hasta homogeneizar. 7. Centrifugar a 5 000 xg durante 12 min. a 4C (o hasta que le sobrenadante quede transparente). 8. Trasladar el sobrenadante a un tubo nuevo, cuidando de no tomar la interfase. 9. Agregar 2/3 del volumen final de isopropanol fro para precipitar el ADN. 10. Dejar reposar durante la noche a -20C. 11. Centrifugar a 8000 xg durante 5 min a 4C. Eliminar perfectamente el sobrenadante. 12. Limpiar el ADN agregando 1 ml de etanol 70% fro y centrifugar a 7 000 xg durante 5 min. 13. Eliminar el sobrenadante y resuspender con 100 l de buffer TE. Este protocolo es eficiente para la extraccin de ADN de plantas que no producen compuestos secundarios o gran cantidad de polisacridos; en casos

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contrarios el protocolo se ha modificado en funcin de los requerimientos de cada especie, bsicamente en los tiempos y cantidades de las soluciones utilizadas. As, tenemos que para la mayora de las especies del gnero Agave el protocolo ha sido modificado como sigue: 1. En un mortero cortar en cuadros pequeos alrededor de 1 g de tejido y moler con nitrgeno lquido hasta obtener un polvo fino, eliminar el mximo de fibras. De ser posible, tratar de moler en un solo evento y no remoler la muestra excesivamente (esto provoca que el ADN se fraccione). 2. Agregar 250 l de buffer de extraccin CTAB y 750 l de buffer STE, seguir moliendo y recuperar en un microtubo de 1.5 ml (es importante conservar las proporciones de buffer, sin embargo las cantidades pueden variar segn la textura y consistencia de la muestra tratando de obtener un jarabe). 3. Centrifugar a 9000 xg durante 8 min. y eliminar el sobrenadante. Si el sobrenadante resulta de un color intenso, se recomienda repetir los pasos 2 y 3. 4. Resuspender con 400 l de CTAB 2X y 600 l de STE. 5. Centrifugar a 9 000 xg durante 8 min. 6. Eliminar el sobrenadante y resuspender con 600 l de CTAB 2X. 7. Agregar 4 l de ARNasa (7000 U/ml). Incubar 20 min a 37 C. Conservar en hielo 5 minutos. 8. Agregar 40 l de proteinasa K e incubar a 65C por 20 minutos. Durante la incubacin es conveniente invertir los tubos 2 a 3 veces. Poner en hielo 5 minutos. 9. Agregar a cada tubo 600 l de cloroformo:octanol 24:1, agitar en vortex hasta homogeneizar (no exceder la agitacin). 10. Centrifugar a 8 000 xg durante 12 min. (o hasta que el sobrenadante quede transparente, o bien repetir el paso de cloroformo:octanol con el sobrenadante resultante del primer centrifugado). 11. Trasladar el sobrenadante a un tubo nuevo. Este paso es fundamental para obtener un ADN limpio, se debe evitar recuperar material de la difase que se forma; recupere con una pipeta de 200 l slo el 70% del sobrenadante: tendr menos ADN pero ms limpio. 12. Precipitar el ADN agregando isopropanol fro a -20C en un volumen de 2/3 de lo obtenido de sobrenadante en el paso anterior (esto es, 600 l aprox.).

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13. Dejar reposar 2 horas a -20C. No es recomendable dejar precipitando muchas horas pues el producto resulta ms sucio. 14. Centrifugar a 7 500 xg durante 5 min. Eliminar el sobrenadante. Se observar un pequeo botn al fondo del tubo, que debe ser color blanco traslcido. Si es muy blanco y muy grande es posible que est sucio; es conveniente eliminar muestras de este tipo. 15. Limpiar el ADN agregando 1 ml de etanol 70% fro a -20C, mezclar en vortex hasta observar que el botn se desprende. Dejar reposar 5 minutos a temperatura ambiente y centrifugar a 9 000 xg durante 5 min. 16. Eliminar el sobrenadante sin perder de vista el botn. Si lo considera necesario se puede repetir el lavado con alcohol al 80%. 17. Rehidratar el ADN con agua ultra pura (en nuestro laboratorio usamos agua Mobio con no. de cat.: 17012-5200), el volumen de agua depende del tamao del botn y puede ir de 15 l a 150 l. Reactivos:
Buffer de extraccin CTAB 2X

Tris-HCl 100 mM pH8 NaCl 1.4 M EDTA 20 mM pH8 CTAB 2% b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento de usar el buffer)
Buffer de extraccin CTAB

Tris-HCl 100 mM pH8 NaCl 1.5 M EDTA 20 mM pH8 CTAB 4% PVP40 4% Ac. ascrbico 0.1% DIECA 0.1% b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento de usar el buffer)

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Buffer de extraccin STE

Tris-HCl 100 mM pH8 EDTA 50 mM pH8 NaCl 100mM b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento de usar el buffer)

Nota importante: Un factor determinante para obtener ADN de calidad es controlar la concentracin de sales residuales, que deben ser eliminadas. Para ello existen protocolos de limpieza con fenol-cloroformo que se presentan ms adelante, pero nosotros hemos llegado a controlar el exceso de sales directamente desde la elaboracin de los buffers de extraccin, evitando con ello el manejo del fenol que es altamente contaminante y peligroso. Lo que hacemos realizar una extraccin preliminar y medir su calidad en un biofotmetro; si las lecturas indican exceso de sales reducimos el NaCl al mnimo posible. Esto se debe a que algunas plantas acumulan sales en sus tejidos y la reaccin se satura de sales. En otros grupos de plantas como cactceas y crasulceas, la extraccin de ADN resulta ms difcil por la presencia de una gran cantidad de mucopolisacridos y compuestos secundarios, en cuyo caso hemos logrado la extraccin aplicando el siguiente protocolo bsico, que modificamos en algunos pasos segn los requerimientos de las plantas. Extraccin de ADN total de plantas suculentas por el mtodo CTAB-STE 1. Moler 0.5 g de tejido fresco con nitrgeno lquido hasta obtener un polvo fino. De ser posible, tratar de moler en un solo evento y no remoler la muestra excesivamente (esto provoca que el ADN se fraccione). 2. Agregar 260 l de CTAB y 975 l de STE, agitando hasta obtener un jarabe. 3. Agregar 65 l de SDS al 20% agitando vigorosamente por 5 minutos e incubar a 65C por 10 minutos. 4. Agregar 325 l de acetato de potasio 5M fro e incubar a -20C por 40 minutos. 5. Centrifugar los tubos a 12 000 xg por 30 minutos. 6. Filtrar la fase acuosa con un trozo de algodn estril insertado en la boca del tubo (no muy apretado ni muy suelto) y sobre ste recuperar el sobrenadante en un tubo nuevo.

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7. Agregar 2/3 del volumen de sobrenadante obtenido con isopropanol fro (-20C), agitar suavemente e incubar a -20C por 1 hr. 8. Mezclar suevemente, y centrifugar los tubos a 12 000 xg a 6C por 10 minutos. Eliminar el sobrenadante, dejar secar el botn de ADN y resuspender en 0.5 ml de agua ultra pura. Incubar a 65C por 10 min. 9. Centrifugar a 12 000 xg por 10 minutos y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. 10. Agregar 30 l de acetato de sodio 3M y 300 l de isopropanol fro (-20C) y mezclar suavemente. Incubar a -20C por 30 minutos. 11. Mezclar suavemente y centrifugar a 6C por 10 minutos, se formar un botn pequeo traslcido. 12. Limpiar el botn con etanol fro (-20C) al 80 %, mezclando en vortex hasta soltar el botn. Si lo considera necesario se puede repetir el lavado con alcohol al 80%. 13. Centrifugar a 1000 x g y eliminar el sobrenadante. 14. Rehidratar el ADN con agua ultra pura (en nuestro laboratorio usamos agua Mobio con no. de cat.: 17012-5200), el volumen de agua depende del tamao del botn y puede ir de 15 l a 150 l.

Reactivos :
Buffer de extraccin CTAB

Tris-HCl 100 mM pH8 NaCl 1.5 M EDTA 20 mM pH8 CTAB 4% PVP40 4% Ac. Ascorbico 0.1% DIECA 0.1% b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento de usar el buffer)
Buffer de extraccin STE

Tris-HCl 100 mM pH8 EDTA 50 mM pH8 NaCl 100mM

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b-mercaptoetanol 0.3% (no agregar este reactivo hasta el momento de usar el buffer) SDS 20% Acetato de potasio 5 M Acetato de sodio 3 M

En algunas ocasiones nos hemos enfrentado a muestras verdaderamente complicadas como Opuntia rastrera, en cuyos casos iniciamos el proceso con una maceracin en alcohol etlico al 96%, lo que rompe los mucopolisacridos y nos permite seguir con los procedimientos normales. En ocasiones tambin combinamos partes de un protocolo con otro para resolver problemas especficos. Cuando es necesario limpiar el ADN porque se encuentra muy saturado de sales o protenas que impiden la amplificacin de productos de PCR utilizamos el siguiente mtodo: Limpieza de las muestras con fenol-cloroformo 1. Agregar 50 l de fenol y 50 l de cloroformo y agitar en el vrtex para mezclar perfectamente. 2. Centrifugar a 10 000 xg por 30 segundos. 3. Rescatar la fase superior, con cuidado, sin tocar la interfase blanca que contiene las protenas y ponerla en otro tubo limpio. 4. Agregar 50 l de fenol y 100 l de cloroformo, agitar en vrtex y centrifugar en microcentrfuga como se hizo en los pasos anteriores. 5. Repetir estos pasos hasta que no se vea turbia la fase superior, y cuando esto suceda ponerle 100 l de coloroformo, mezclar bien en el vrtex y centrifugar. Rescatar la fase superior a un tubo nuevo. 6. Precipitar el ADN agregando 10 l de NaCl 2M y 250 l de isopropanol y reposar la muestra a -20C 4 hr. mximo. 7. Centrifugar los tubos por 1 hora a 12 000 x g a 6C, eliminar el sobrenadante y lavar el precipitado con 1 ml de etanol al 80% fro. 8. Secar el precipitado y resuspender en 20-40 l agua ultra pura.

Extraccin de ADN en animales

Para la extraccin de este material hemos utilizado el protocolo mini-prep modificado bsicamente con un aumento de proteinasa K y de ARNasa. Hemos

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mantenido semejante el resto del protocolo aun cuando en el caso de insectos hemos requerido cantidades mnimas de tejido, como 0.1 g. Tambin hemos combinado partes del protocolo mini-prep con el uso de paquetes comerciales para clulas animales, como las clulas hepticas de borrego cimarrn, Ovis canadensis, de las que se obtuvo ADN de buena calidad. Cuando no obtenemos la calidad requerida para los experimentos a realizar, recurrimos al uso de los paquetes comerciales mencionados, ya que a pesar de ser muy caros y no permitir realizar estudios extensivos, permiten obtener ADN de buena calidad. Respecto a los costos de dichos paquetes, basta decir que siempre es ms barato no tener que repetir todo el experimento y que es posible obtener buenas promociones si se consiguen los componentes a granel y en grandes volmenes, y no en paquete, pues siempre es necesario ajustar los protocolos.

ARN
Precauciones Una vez colectado el material es necesario agregarle una solucin que estabilice al ARN lo antes posible, ya que los cambios en el patrn de expresin de los genes debido a la degradacin del ARN o a inducciones en la transcripcin ocurren inmediatamente. Debido a su estructura qumica el ARN es una molcula muy frgil que puede romperse por accin de los grupos 2-OH (altamente reactivos) adyacentes al esqueleto de ribosa-fosfato. Existen paquetes comerciales para estabilizacin de muestras de ARN de compaas como QIAGEN, Ambion y RNA-works, que en general funcionan con una mezcla de anticuerpos especficos para ribonucleasas, inhibidores de ribonucleasas y/o contienen compuestos que neutralizan a los grupos 2-OH (como es el caso de RNA-works). Dado que las ARNasas no van a ser inactivadas en su totalidad en el autoclave, resulta esencial trabajar con material estril y de preferencia de un solo uso. El material de vidrio debe lavarse con una solucin 0.5 N de NaOH, enjuagarse tres veces con agua de-ionizada y meterse al autoclave durante 2 horas. El material de plstico deber limpiarse con etanol absoluto y meterse al autoclave durante 45 minutos. Las micro esferas de vidrio, generalmente utilizadas en la extraccin para incrementar la lisis celular por accin fsica, deben someterse a combustin durante 12 hrs. a 450 C y deben pasar en el autoclave 45 minutos. Es importante que los reactivos que se utilicen en la extraccin de ARN se mantengan en alcuotas con los volmenes mnimos necesarios para cada etapa del proceso y en caso de ser posible se pasen dos veces por el autoclave.

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Cuando se extraen los cidos nucleicos para su amplificacin, es indispensable separar los sitios en los que se lleva a cabo la extraccin y la amplificacin, o en su caso, limpiar a profundidad la zona donde se llev a cabo la extraccin con NaOH 0.5N y con etanol absoluto antes de amplificar. En cada una de estas dos etapas es ideal utilizar juegos de pipetas diferentes, o en su defecto usar puntas de pipeta con filtro en la preparacin de las mezclas de reactivos a utilizar en la amplificacin. Tambin resulta propicio trabajar siempre bajo la campana de flujo laminar con dos mecheros encendidos.

Mtodos de extraccin del arn

GIPS El mtodo utilizado con ms frecuencia es el de GIPS (por sus siglas en ingls; acido tiosanato de guanidina, fenol, sarcosyl) desarrollado por Chomczynski y Sacchi (1987). Cada uno de estos componente juega un papel especfico: el cido tiosanato de guanidina es sumamente fuerte y tiene un alto poder denaturalizante; el fenol, al estar acidificado, provoca que el ADN se acumule en la interfase entre la fase acuosa y la del fenol, dejando al ARN en la fase acuosa; el sarcosyl, por su parte, es un detergente muy potente que ayuda a la lisis celular, pero no reemplaza la ruptura fsica de las clulas que generalmente se logra con micro esferas de vidrio agitadas con la ayuda de un vrtex o de un homogenizador celular (como Bead-Beater). Sin embargo, es importante tratar las muestras con ADNasas libres de ARNasas.
BOOM

El mtodo BOOM, desarrollado por Boom et al. (1990) lleva a cabo la extraccin con el cido tiosanato de guanidina, separando los cidos nucleicos con base en su alta afinidad para enlazarse en matrices de slica, en vez de utilizar fenol. Dado que este mtodo aisla tanto ADN como ARN, resulta esencial utilizar las nucleasas especficas para ADN que lo eliminen de la muestra. Algunas compaas han creado paquetes de extraccin basados en este principio, que utilizan matrices de slica diseadas para favorecer el enlace de ARN (como RNeasy de QIAGEN). Las molculas grandes de ARN, incluyendo ARNr y ARNm, son insolubles en soluciones con altas concentraciones de sal, por lo que durante su precipitacin es comn utilizar cloruro de litio 8 M (libre de ARNasas) e incubar

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las muestras a 0C durante dos horas antes de centrifugar. Sin embargo, este mtodo no debe ser utilizado para ARN que ser sometido a transcripcin reversa (vase ms adelante). Transcripcin reversa Esta tcnica permite pasar, en sentido inverso al dogma central de la biologa molecular, de ARN a ADN. El primer paso es convertir el mARN en ADN complementario (cADN) a partir de la actividad de la reverso transcriptasa. Esta enzima existe en la naturaleza como parte del mecanismo de replicacin en virus, y utiliza un tARN como oligonucletido o primer. Mtodo utilizado para transcripcin reversa para expresin de genes involucrados en la fijacin de nitrgeno en muestras acuticas (modificado por Zani et al ., 2000 del kit de Promega de RT-PCR) Agua ultra pura sin nucleasas (28 l) Buffer de virus de mieloblastosis de ave 5x (10 l) dNTP, a concentracin de 10 mM por ncleotido) (1 l) Primer a 12.5 M (2 l) Reverso transcriptasa de virus de mieloblastosis de ave (1 l) Muestra de ARN libre de ADN (1 l) Ciclo 30 min a 42 C

El cADN formado durante la transcripcin reversa es posteriormente utilizado en la reaccin de PCR para amplificarlo e identificar el gen que estaba originalmente expresndose en nuestra muestra (ver captulo 17). Mtodo para aislamiento de ARN total de muestras de agua ambientales (modificado a partir del kit de QIAGEN, Rneasy; Falcn et al., 2004) 1 Colectar muestras de agua en filtros DURAPORE (Millipore, Corp. San Jos, CA. EUA). 2 Colocar filtros con las clulas hacia fuera dentro de tubos Eppendorf de 1.5 ml con micro esferas de vidrio y con la solucin RLT que contiene

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cido tiosanato de guanidina y -mercaptoetanol (que desactiva molculas complejas y ayuda en la lisis celular). 3 Aplicar vibracin con vrtex o con homogenizador celular (vibracin 1 min, colocar en hielo 1 min, vibracin 1 min). 4 Centrifugar (2 min x 10000 xg) y transferir el supernadante (con ARN) a tubo colector nuevo. Agregar 350 l de etanol absoluto para limpiar y ayudar a la precipitacin del ARN. Mezclar bien por pipeteo o vrtex. 5 Transferir mezcla a tubo de centrfuga de 1.5 ml con filtro de slica (columna); colocar columna en tubo colector. Centrifugar (15 seg x 10000 x g) para atrapar el ARN en la matriz de slica. 6 *En caso de utilizar ADNasa, agregar 350 l de la solucin RW1, 80 l de la solucin de ADNasa (10 l de la solucin stock -1500 unidades de ADNasa slida disuelta en 550 l de agua ultra pura libre de nucleasas- en solucin RDD). Centrifugar (15 seg x 10000 xg). Repetir la limpieza con solucin RW1 (350 l) y centrifugar (15 seg x 10000 xg). Si no se utiliza ADNasa pasar directamente al siguiente paso. 7 Limpiar la muestra con la solucin RW1 (que contiene cido tiosanato de guanidina). Agregar 700 l y centrifugar 15 seg x 10000 xg. 8 Colocar la columna en tubo colector nuevo y limpiar con 500 l de solucin RPE (que contiene etanol absoluto); centrifugar 15 seg 10000 xg. Repetir. 9 Centrifugar 1 min x 10000 xg para limpiar la muestra de todo etanol residual. 10 Colocar columna en tubo colector nuevo y agregar entre 30 y 50 l de agua ultra pura libre de nucleasas. Esperar un minuto para separar las hebras de ARN de la membrana de slica y centrifugar (1 min x 10000 xg). 11 Guardar el ARN aislado (total) en nitrgeno lquido o a -80 C.

Bibliografa
Boom, R., C J Sol, M M Salimans, C L Jansen, P M Wertheim-van Dillen y J van der Noordaa, 1990. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. Journal of Clinical Microbiology 28(3): 495-503. Chomczynski, P. y N Sacchi, 1987. RNA isolation from cultured cells. Analytical Biochemistry 162: 156-159. Doyle, JJ y JL Doyle, 1987.A rapid DNA isolation procedure for small quantities of fresh leaf tissue. Phytochemistry Bulletin 19: 11-15.

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Falcn, L. I., E. J. Carpenter, F. Cipriano, B. Bergman y D. G. Capone. 2004. N2-fixation by unicellular bacterioplankton in the Atlantic and Pacific Oceans: phylogeny and in situ rates. Applied Environmental Microbiology 70: 765-770. Madigan, MT., JM Martinko y J Parker, 2000. Brock biology of microorganisms. Prentice Hall, Upper Saddle River, NJ. 991 pp. Zani, S., M.T. Mellon, J.L. Collier y J.P. Zehr, 2000. Expression of nifH genes in natural microbial assemblages of Lake George, NY detected with RT-PCR. Applied Environmental Microbiology 66: 3119-3124.