Aplicacin del Diseo Compuesto Central Rotable en el Establecimiento In Vitro de pices de Pltano Musa sp.

variedad Harton (AAB)

BUSTAMANTE Rafael; Mara VIELMA & Argenis MORA
Agroalimentacin & Desarrollo Sustentable N 10 Art. 1 pp. 01-07, 2006 ISSN 1690-4753 D.L. pp200302ME1481 Recibido: 18-05-2006 Aceptado: 15-06-2006 Publicado: 30-08-2006 2006 CIRES Facultad de Ciencias, Dpto. Biologa, Lab. Cultivos in vitro Facultad de Ciencias Forestales y Ambientales, INDEFOR Universidad de Los Andes. Mrida, 5101, Venezuela bustaraf@ula.ve, mvielma1@ula.ve

Resumen
Meristemas apicales de pltano (Musa sp variedad Harton (AAB) fueron cultivados en medio de Murashige y Skoog (MS) con diferentes combinaciones de N6- benciladenina (BA) y carbn activado (CA), calculados aplicando el diseo estadstico Compuesto Central Rotable (CCR) con el fin de obtener una superficie de respuesta y determinar la combinacin ptima para establecer los pices en medio de cultivo. El diseo gener nueve combinaciones dentro de los rangos de 0-10 mg /L de BA y 0,1-0,4% de CA, respectivamente. Al medio MS se le modific la concentracin de tiamina a 0,4 mg/L y 0,7% de agar. Los explantes una vez cultivados fueron incubados a 4,0 - 4,5 moles*m2*s-1 y 27-29 C, durante 30 das, para evaluar la neoformacin de primordios de vstagos y la oxidacin. La superficie de respuesta resultante de la aplicacin del diseo CCR, mostr que los valores ptimos estn en 9,5 mg/L de BA y 0,4% de CA para la induccin de primordios y 4,3 mg/L de BA y 0,3% de CA para controlar la oxidacin. Palabras Clave: Pltano. Musa. in vitro. Diseo Compuesto Central Rotable (CCR). Superficie de Respuesta. Neoformacin. Oxidacin. Meristemo. Primordia. Genotpo. Banano.

The Use of the Rotable Central Composite Desing Method (CCR) for Obtaining In Vitro Cultured Apical Meristems of Plantain (Musa var. Harton) (AAB)
Abstract
Apical meristems of plantain (Musa var. Harton). (AAB) were cultured on Murashige and Skoog (MS) medium with different combinations of N6benzyladenine (BA) and activated charcoal (BA), calculated from the Rotable Central Composite Desing Method (CCR) in order to obtain a response surface, and determine the optimal combination to stablish the apical meristems in a MS medium. The applied design method produced nine (9) combinations within a range of 0-10 mg/L BA, and 0.1-0.4% active carbon, respectively. The explants were cultured on a modified MS medium containing, tiamine at 0.4 mg/L and 0.7 % agar, and incubated at 4,0 - 4,5 mol m2 s-1 at 27-29 C for 30 days to evaluate shoot primordia neoformation and oxidation. The resultant response surface of CCR design showed optimal values in 9,5 mg/L BA and 0.4% AC for primordia induction and 4.3 mg/L BA and 0,3 % activated charcoal in controlling oxidation. Key Words: Plantain. (Musa var. Harton). In Vitro Culture. Rotable Central Composite Design Method (RCC). Response Surface. Neoformation. Oxidation.

Introduccin
El pltano y el cambur pertenecen al gnero Musa de la familia Musaceae la cual, segn Stover & Simmonds (1987, citados por Novak, 1992), est compuesta por el gnero Ensete y por el ya nombrado gnero Musa que a su vez est conformado por cinco secciones: Australimusa, Callimusa, Rhodochlamys, Ingentimusa y Eumusa. Esta ltima seccin es la de mayor distribucin geogrfica e incluye las especies de Musa, entre ellas M. acuminata y M. balbisiana de las cuales derivaron en la regin Indomalaya, las variedades comestibles de pltanos y cambures actuales (Guzmn, 1990; Novak, 1992). La importancia de estas frutas radica en el valor nutritivo dado por carbohidratos (35%) en gran parte transformados en glucosa, sacarosa y fructosa durante la maduracin; tambin contienen fibra (6-7%), protenas (1-2%), potasio, magnesio, fsforo, calcio, hierro y vitaminas A y C (Novak, 1992). Estas plantas generalmente tienen un ciclo biolgico de uno a tres aos y son monocrpicas, producen los frutos y luego degeneran, por lo tanto, la produccin de propgulos o semillas vegetativas es limitada. El pltano y el cambur son estriles por ser triploides y los frutos son partenocrpicos. Estas caractersticas han forzado a que las variedades importantes se multipliquen por va asexual a travs de propgulos (yemas adventicias) constitudos por brotes jvenes o hijuelos (puyones) que salen de la base del pseudotallo y de porciones de cormo portadoras de meristemas (Angarita & Perea, 1991). La calidad y el rendimiento de muchas de estas plantas se encuentran amenazados por gran cantidad de enfermedades ocasionadas por virus (virus del mosaico del pepino, insectos (Cosmopolites sordidus, Colapsis hypochlora, Pentalomia nigronervosa), hongos (Fusarium oxysporum var. Cubense, Cercospora spp., Micosphaerella musicola que produce la sigatoka amarilla y Gloesporium musarum) y bacterias (Guzmn 1990). Muchas de estas enfermedades estn presentes en la zona sur del Lago de Maracaibo, Estado Mrida. La aplicacin de productos fitosanitarios para el control de patgenos aumenta los costos y la contaminacin de suelos y aguas superficiales y subterrneas. Tambin contaminan productos agrcolas consumidos por el hombre y los animales. La propagacin vegetativa a travs de brotes o puyones permite la diseminacin de todos estos patgenos (Drew et al., 1989). Estas limitaciones han aumentado el inters por el mejoramiento del cultivo para propagar y obtener genotipos con caractersticas agronmicas deseadas como con alto rendimiento y tolerancia a patgenos.

Una alternativa de propagacin vegetativa del gnero Musa es la microprogacin a travs de la proliferacin de vstagos a partir de meristemas apicales de yemas adventicias. Siendo la respuesta morfognica controlada, en gran medida, por el medio de cultivo y por el genotipo (Novak et al, 1989). En tal sentido numerosos trabajos de propagacin in vitro han mostrado el potencial para la aplicacin de tcnicas de propagacin de este gnero (Banerjee & De Langhe, 1985; Banerjee et al 1987; Escalant & Teisson, 1988, Novak et al 1989).

Problemas en el cultivo in vitro del gnero Musa

El gnero Musa es productor de compuestos fenlicos que producen oxidacin, lo que representa un factor limitante en el cultivo de tejidos. Cultivares como Gran Enano (AAA) y Saba (ABB) no presentan mucha dificultad, pero cultivares como Maqueo (AAB) y Resplandor (AAB) presentan alta produccin de polifenoles (Angarita & Perea, 1991). En nuestros trabajos preliminares, los pices cultivados de la variedad Harton, presentaron gran oxidacin. Por lo tanto, es necesario estandarizar condiciones de cultivo que permitan eliminar el oscurecimiento de los cultivos, ya que esto impide el efecto de otros factores de crecimiento. Entre los factores a probar para el establecimiento del cultivo est la aplicacin de una citoquinina para promover formacin de primordios de vstago (Vuylsteke, 1998; Angarita & Perea,1991; Liu et al., 2002) y de antioxidantes como el carbn activado (CA) el cual absorbe compuestos oxidados cuando es incorporado en el medio a concentraciones de 0,2 a 3% (p/v) (Beyl; citado en Trigiano & Gray, 2000),.

Diseo Compuesto Central Rotable

El diseo CCR fue propuesto por Box & Wilson (1951; citado en Mora 2000) como una alternativa al factorial 3k; bsicamente consiste de un ncleo factorial 2k, cuyos niveles de los factores se codifican con +1 y 1, as como niveles que pueden variar de acuerdo al nmero de factores a evaluar y garantiza adems, una propiedad estadstica de rotabilidad. Como ejemplo, considrese que se quiere evaluar dos fitohormonas (factores X1 y X2), la primera dentro de un mbito de exploracin desde 0 hasta 3 mg/L y la segunda desde 0 hasta 2 mg/L. Para la obtencin de los niveles de concentracin de cada una se utilizan la siguiente frmula:

Xr =

( X c Vic ) * I r + Vir (1) Ic

Donde Xr es el valor real de concentracin deseado, Xc es el valor codificado, Vic es el valor mnimo codificado, Vir es el valor de la concentracin mnima, Ir es el intervalo o rango para niveles de concentraciones (concentracin mxima menos la mnima) y Ic es el intervalo o rango para los niveles codificados ([1,414- (1,414)] = 2,828). Para el mbito sealado en la fitohormona 1 queremos conocer cul ser el valor real Xr s su valor codificado (Xc) es -1; en ese caso se tiene la siguiente informacin: Vic = -1,414, Ir = 3 mg/L, Ic = 2,828 y Vir = 0 mg/l; sustituimos en la frmula dada y se tiene

Materiales y Mtodos
Material Vegetal
Se utilizaron brotes o hijuelos (puyones) de pltano variedad Harton, (Musa sp. Genotipo AAB) de plantaciones del Sur del Lago de Maracaibo, variedad de gran inters agronmico. Los puyones fueron refrigerados a 4-6 C, por 4-5 das.

Condiciones de desinfeccin y control de oxidacin

El material original fue reducido a cubos de 4-5 cm3, manteniendo el meristema apical. Los cubos fueron lavados con agua corriente + 500 mg/L de cido ascrbico para controlar la oxidacin. La esterilizacin fue realizada con hipoclorito de sodio al 3%, durante 10 min seguida de 4-5 lavados con agua destilada estril. Este material fue cortado hasta obtener un cono de 1 cm de longitud que contiene el meristema; se eliminaron algunos primordios foliares y parte del tejido de la base del cono.

Xr =

(1 (1,414)) * 3 + 0 = 0,439 0,44 mg L 2,828

El nmero total de tratamientos/combinaciones y los niveles de concentracin de cada fitohormona son presentados en la Tabla 1. Tabla 1. Valores codificados y valores reales de BA y CA. Valores codificados Tratamiento [BA] % CA mg/L Control 1 -1 -1 2 1 -1 3 -1 1 4 1 1 5 0 0 6 -1.41421 0 7 1,41421 0 8 0 -1,41421 9 0 1,41421 Valores reales [BA] mg/L 0 1.5 8,5 1,5 8,5 5 0 10 5 5 % CA 0 0,5 0,1 0,3 0,3 0,2 0,2 0,2 0 0,4

Medios de cultivo
Los conos de 1 cm de longitud fueron sembrados en tubos de cultivo Sigma con 15 ml de medio de Murashige & Skoog (1962; MS), modificando la concentracin de tiamina a 0,4 mg/L y el agar al 0,7 %. Las relaciones de BA y (CA) fueron determinadas usando el diseo CCR y son mostradas en la Tabla 1. Los explantes fueron incubados en cmara de crecimiento a la temperatura de 27-29 C y a intensidad lumnica de 4,0 4,5 moles*m2*s-1 durante 30 das. Los vstagos ya desarrollados fueron escindidos y subcultivados en el mismo medio a 40 45 moles*m2*s-1. Para el establecimiento y la micropropagacin de las yemas de la variedad de pltano en estudio, se consideraron dos factores: la citokinina N6benciladenina y el carbn activado (CA) presentes en el medio de cultivo, ya que en experimentos preliminares se determin el efecto de ambos en la propagacin de vstagos de pltano. La mayor propagacin se obtuvo a una concentracin de 5 mg/L de BA y el mejor control de la oxidacin se observ con 4% de CA. Se evaluaron simultneamente 5 niveles de concentraciones por cada fitohormona, pero se combinan en tan slo 9 tratamientos, a diferencia de los posibles 25 combinaciones de un diseo factorial convencional. Con esto se tiene el mismo alcance en la exploracin y bsqueda de la respuesta ptima en este

Ascanio et al. (1996) compararon la aplicacin de los diseos compuesto central ortogonal (CCO) y CCR en experimentos de cultivos in vitro. Tacoronte (1997) aplic este diseo en la determinacin de relaciones de la auxina cido -naftalnactico y la citokinina BA para la propagacin de caoba. El presente trabajo tiene como objetivo aplicar el diseo estadstico CCR para obtener superficies de respuestas que permitan obtener una respuesta ptima en la propagacin de vstagos, cuando se aplica simultneamente un antioxidante como CA y una citokinina, la N6- benciladenina (BA) como inductor de expresin morfognica, en este caso la induccin de primordios de vstagos a partir del pices del brote.

ensayo. Es necesario incluir una combinacin 0% de CA y 0 mg/L de BA, es decir, el tratamiento control. La aplicacin del modelo gener nueve combinaciones dentro de un rango de 0 - 10 mg/L de BA y 0,1 - 0,5% de CA respectivamente como se muestra en la Tabla 1. Se cultivaron 10 explantes por tratamiento con 3 repeticiones. La neoformacin de ndulos meristemticos de vstagos como respuesta morfognica se denomin RM y el control de la oxidacin (oscurecimiento del explante y del medio de cultivo por CA es llamada Ox. RM y Ox fueron evaluadas en la fase de establecimiento del cultivo. Para RM se estableci una escala de tres grados: 1) poco crecimiento; 2) crecimiento moderado y 3) crecimiento y presencia de ndulos meristemticos (se desarrollan en vstagos). El crecimiento fue medido por aumento de volmen del cono en cm3. Para Ox tambin se consideraron tres grados de respuesta: 1) poca oxidacin; 2) mediana oxidacin y 3) intensa oxidacin. Fueron evaluados en funcin del efecto de los factores BA y CA. Los resultados de los cultivos en funcin de sus tres grados (1, 2, y 3), se introdujeron en el programa SAS. Para generar la superficie, el valor de Y para cada tipo de respuesta fue determinado aplicando el modelo polinmico de segundo grado expresado en la ecuacin: (1) Y= o + 1X1 + 2Y2 +3X12 + 4X22 + 5 X1X2 + E donde se sustituyeron los valores respectivos generados por el anlisis de regresin para cada factor y los valores reales de cada factor por tratamiento. E es el error estndar. Se calcul el coeficiente de determinacin (R2), para determinar la proximidad del ajuste de la ecuacin de regresin a los valores observados de Y.

Resultados y Discusin
El establecimiento de meristemas de brotes de pltano variedad Harton, en medio de cultivo que promueve la propagacin de vstagos adventicios, es posible agregando al medio de cultivo MS la citoquinina BA en un rango de 0-10 mg/L y CA en un rango de 0 a 0,4%. La presencia de estas dos sustancias determinan una respuesta morfognica, promotora de la formacin de primordios de vstagos y controla la oxidacin de los explantes en las primeras etapas (establecimiento) de propagacin las yemas apicales de pltano (Musa var. Harton) (AAB). Los valores ptimos de estas sustancias, calculados por la aplicacin el diseo CCR, son mostrados a continuacin. El anlisis de regresin para RM y Ox gener los valores mostrados en las Tablas 2 y 3. En la ecuacin (1) fueron sustitudos estos valores resultando: Para RM o =1.010, 1 = 0,407, 2 = -1,996, 3 = -0,022, 4 = 2,438 y 5 = 0,009 y para Ox o = 1,39, 1 = 0,271, 2 = 2,877, 3 = -0,013, 4 = 7,124 y 5 = 0,465. Tabla 2. Anlisis de regresin para RM
Parmetro
Intercepto (Bo) BA (B1) CA (B2) BA* BA (B3) CA*CA(B4) CA*BA(B5)

Parmetro estimado
1.0103 0,4073 -1,9967 -0,0216 2,4382 0,0093

Error estndar
0,1031 0,0451 1.0424 0,0054 3,1849 0,1428

T para Ho Prob.>T
9,794 9,016 -1,916 -3,941 0,766 0,0651 0,0000 0,0000 0,0570 0,0001 0,4450 0,9481

g.l. :1 Tabla 3. Anlisis de Regresin para Ox

Parmetro
Intercepto (Bo) BA (B1) CA (B2) BA*BA(B3) CA*CA(B4) BA*CA (B5)

Parmetro estimado
1.1390 0,2710 -2,8774 -0,0131 7,1246 -0,4656

Error estndar
0,0854 0,0376 0,8687 0,0045 2,6544 0,1190

T para Ho Prob.>T
13,249 7,199 -3,312 -2,867 2,684 -3,910 0,0000 0,0000 0,0011 0,0047 0,0080 0,0001

Formacin de races
Para promover el enraizamiento, los vstagos obtenidos in vitro, fueron cultivados en medio MS con 0,5 mg/L de cido - naftalnactico (ANA) e incubados en las condiciones anteriores, hasta la aparicin de races. La mayora de los vstagos desarrollados en todos los tratamientos, formaban races espontneamente, pero para fomentar el enraizamiento, muchos fueron cultivados en medio MS con 0,5 mg/L de ANA. Las plantas obtenidas fueron cultivadas en invernadero y llevadas al campo.

g.l.: 1 El anlisis de superficie para la respuesta RM (Fig.1), muestra que los valores ptimos son para BA = 9,48 9,5 mg/L y para CA = 0,391 0,4%; es decir, la mejor respuesta morfognica que implica aumento de tamao, mayor cantidad de vstagos a ser formados con los dos factores. El valor de Y en el punto estacionario igual a 2,551, indica que en estas condiciones se produce la mejor respuesta. El coeficiente de determinacin (R2) 64%, indica que las relaciones BA/CA, tienen bastante influencia en la induccin de primordios de vstagos a partir de los meristemas apicales del brote.

Tabla 4. Valores Y obtenidos al aplicar el Modelo Polinmico para el factor Ox Tratamiento Control 1 2 3 4 5 6 7 8 9 X1 0 1,5 8,5 1,5 8,5 5 0 10 5 5 X2 0 0,1 0,1 0,3 0,3 0,2 0,2 0,2 0 0,4 Y 1.139 1,23 1,8915 1,0850 1,095 1,413 0,848 1,1320 2,169 1,228

La citoquinina BA ha sido usada por varios investigadores (Angarita & Perea, 1991; Vuylsteke, 1998) para la propagacin de variedades del gnero Musa a partir de yemas, pero no existen referencias de su uso para propagar en combinacin con CA para la variedad Hartn. Ascanio et al. (1996) demuestran que tanto el diseo CCO como el CCR son tiles en la experimentacin de los cultivos de tejidos vegetales cuando fueron aplicados para comparar el dimetro del callo y relacin peso seco/peso fresco en segmento de hoja de Canavalia ensiformis. Valecillos (1999) us el CCR para observar el efecto de relaciones de BA y AIA en la regeneracin de vstagos de meln a partir de cotiledn, concluyendo que la respuesta se maximiza con 1,33 mg/L de BA en el medio y que AIA no produce efecto significativo. En este estudio, la aplicacin del CCR como diseo de superficie de respuesta ha cumplido con condicines de esta metodologa como son: 1) conocimiento previo de las variables (funcin f: BA y CA) a aplicar y 2) informacin previa de su efecto biolgico en la respuesta (Y: control de oxidacin e induccin de vstagos). Adems, ha permtido obtener puntos ptimos en la regin de exploracin, al aplicar estos factores y relaciones funcionales entre ellos, para maximizar la cantidad y/o calidad de la respuesta y minimizar la concentracin de sustancias aplicadas (Chacin, 1998).

Los valores ptimos determinados para un punto estacionario en Y de 1,226, para la respuesta Ox mostrados en la Fig. 2, demuestran que la mayor proteccin para la oxidacin est en los valores ptimos BA= 4.264 4.3 mg/L y CA = 0,341 0,3%. El coeficiente de determinacin R2 = 0,4314 = 43,14% para la respuesta de control de oxidacin, muestra que las relaciones BA/CA controlan en menor medida la respuesta Ox que la de respuesta RM. Es un valor menor de 50%, pero, puede considerarse que la variacin total en Y, es explicada por la regresin. Por lo tanto para RM como para Ox, es aceptable la regresin. La tendencia RM hacia el grado 3 (Y en Fig. 1) indica que las condiciones del medio de cultivo promueven la neoformacin de primordios de yemas con un bajo nivel de oxidacin. Cuando se aplican concentraciones de BA mayores a 4,4 mg/L y concentraciones bajas de CA (00,2%) se observa que se puede controlar la oxidacin, pero, los primordios formados presentan anormalidades.

1.053 1.173 1.292 1.412 1.532 1.651 1.771 1.891 2.010 2.130 2.249 2.369 2.489 2.608 2.728 2.848

0.706 0.812 0.918 1.024 1.129 1.235 1.341 1.447 1.553 1.659 1.765 1.871 1.976 2.082 2.188 2.294

Fig. 1. Superficie de respuesta morfognica del carbn activado y la benciladenina. RM: respuesta morfognica; BA= mg/L; CA= % p/v: escala: contornos de superficie de respuesta que representan alturas especficas (valores de Y = RM en funcin de las variables f = BA y CA).

Fig. 2. Superficie de respuesta para el control de oxidacin del carbn activado y la benciladenina. RM: respuesta morfognica; BA= mg/L; CA= % p/v: escala: contornos de superficie de respuesta que representan alturas especficas (valores de Y = Ox en funcin de las variables f = BA y CA).

Formacin de races
Muchos vstagos obtenidos en todos los tratamientos, formaban races espontneamente, pero, al ser cultivados en medio MS con 0,5 mg/L de ANA aumentaban el nmero de races y se disminua el tiempo de formacin de las mismas (datos no mostrados). Las plantas obtenidas fueron cultivadas en invernadero y llevadas al campo.

compuestos oxidados, pero, usadas como variables para aplicar el diseo CCR y determinar las combinaciones ptimas que favorecen el establecimiento de los explantes de pltano variedad Hartn in vitro, inducen la formacin de ndulos meristemticos de vstagos y. controlar la oxidacin. La superficie de respuesta resultante de la aplicacin del diseo CCR, mostr que los valores ptimos estn en 9,5 mg/L de BA y 0,4% de CA para la induccin de primordios y 4,3 mg/L de Ba y 0,3% de CA para controlar oxidacin. La aplicacin del CCR en cultivo in vitro, cuando se estudian dos variables simultneamente es recomendada, ya que se disminuye el nmero de tratamientos y se pueden determinar las condiciones ptimas de cada variable. En los vstagos cultivados en MS con 0,5 mg/l de ANA se aumenta la formacin de races adventicias y se acelera el enraizamiento. Esto indica que independientemente de las concentraciones de BA y CA, se favorece el enraizamiento de los vstagos. Esto representa una ventaja ya que uno de los procesos ms recalcitrantes en plantas obtenidas in vitro es el enraizamiento.

Fig. 3. Plantas de pltano Musa sp. variedad Harton (AAB) obtenidas en los diferentes tratamientos y aclimatadas en el invernadero.

Agradecimientos
Al CDCHT- ULA por el financiamiento otorgado para la realizacin de este trabajo, a travs de los Proyectos CVI- PIC. AGM- 05-00 y C.1055.00.Em.

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Fig. 4. Micropropagacin de pltano Musa sp. variedad Harton (AAB) en recipientes de inmersin temporal automatizada (RITA).

Conclusiones
La aplicacin del diseo estadstico Compuesto Central Rotable para estudiar condiciones de establecimiento (control de oxidacin) y respuesta morfognica de proliferacin de vstagos de pltano variedad Harton, ha mostrado superficies de respuesta donde se observan las combinaciones ptimas de dos factores que puedan controlar las primeras etapas de la propagacin. Las dos superficies de respuestas tienen formas y valores ptimos distintos, indicando que los variables estudiadas y sus combinaciones afectan de diferente manera las dos respuestas estudiados. La citoquinina BA induce primordios y el CA es til en la absorcin de

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Ramn

FICHA BUSTAMANTE Rafael; Mara VIELMA & Argenis MORA, 2006.Aplicacin del Diseo Compuesto Central Rotable en el Establecimiento In Vitro de pices de Pltano Musa sp. variedad Harton (AAB) Agroalimentacin & Desarrollo Sustentable N 10 Art. 1 pp. 01-07 ISSN 1690-4753 D.L. pp200302ME1481

DIRECCIN BUSTAMANTE Rafael; Mara VIELMA & Argenis MORA* Facultad de Ciencias, Dpto. Biologa, Lab. Cultivos in vitro *Facultad de Ciencias Forestales y Ambientales, INDEFOR Universidad de Los Andes. Mrida, 5101, Repblica Bolivariana de Venezuela bustaraf@ula.ve, mvielma1@ula.ve