El arroz transgnico que expresa amiloide -pptido para la inmunizacin oral

Taiji Yoshida , 1, Eiichi Kimura , un Setsuo Koike , una Nojima junio , 2 Futai Eugene , 2 Sasagawa Noboru , dosYuichiro Watanabe , 2 y Shoichi Ishiura 2
Autor Las notas del artculo Derecho de Autor y Licencia de la informacin

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Resumen
Varias terapias de vacunas para la enfermedad de Alzheimer (EA) han sido investigados. Aqu mostramos el arroz transgnico que expresa -amiloide pptido (Ap). El gen Ap42 fusionado con un gen de la protena fluorescente verde se introdujo en el arroz mediante el Agrobacterium mtodo. Cuando el arroz transgnico Ap expresin se administra por va oral a ratones, suero anti-Ap ttulos de anticuerpos fueron elevados. Los mismos resultados se observaron cuando los ratones fueron alimentados con arroz hervido, caf transgnico. Los resultados indican que una vacuna comestible contra el arroz AD utilizando puede ser factible. Una vacuna derivada del arroz sera mucho ms barata que las vacunas existentes mdicos. Palabras clave: enfermedad de Alzheimer, el amiloide -pptidos, vacunas comestibles, Oryza sativa, arroz integral
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Introduccin
La enfermedad de Alzheimer (EA) provoca deterioro cognitivo y al mismo tiempo las terapias sintomticas, tales como el clorhidrato de donepezilo se dispone de ninguna medicacin teraputica actual ofrece una recuperacin completa de EA. El desarrollo de terapias nuevas AD disminuir la carga social y econmica de la enfermedad. El comienzo de la EA se piensa que es debido a amiloide -pptido (Ap) deposicin en la corteza cerebral1 , 2 . Como Ap es una protena, las vacunas para la EA son medios potenciales de la terapia o prevencin3 - 5 . En los ensayos con modelos de ratn de Alzheimer, la inyeccin de Ap como un antgeno reducido el nivel de acumulacin de Ap en el cerebro en particular, la reduccin de los defectos de memoria y la mejora de los trastornos del comportamiento 6 , 7 . La fase I de ensayos clnicos de la terapia de la vacuna por inyeccin intramuscular de A se ha completado sin problemas, pero el ensayo clnico de fase II se termin debido a que algunos pacientes desarrollaron meningoencefalitis 8 . En un nio de 6 aos de seguimiento de los pacientes en el ensayo de la inmunizacin el ao 9 , las cargas corticales Ap fueron menores en los pacientes vacunados en comparacin con el grupo control. Los pacientes con respuesta de anticuerpos ms altos tenan la eliminacin Ap ms extensa. Sin embargo, este

estudio no encontr la supervivencia o el tiempo para la demencia severa mejor en los pacientes vacunados frente al grupo control. Una terapia vacuna sin efectos secundarios que se necesita. Vacunas mucosas orales o de otra ndole parecen tener menos efectos secundarios que las vacunas administradas por inyeccin 10 , 11 . Un mtodo potencial de la vacunacin oral es la de expresar una protena diana en una planta comestible.El aumento de suero anti-Ap ttulo de anticuerpos y la deposicin suprimida Ap en el cerebro se observaron cuando el pimiento verde o Ap patata que contiene se aliment a un modelo de ratn de la EA 11 , 12 , 13 , 14 . Vacuna comestible tambin puede ser producido en plantas de alimentos genticamente modificados, como el arroz o la soja que se acumulan en las semillas de Ap. Semillas de cereales son ms adecuados para las vacunas comestibles que frutas o verduras ya que muchos tienen alto contenido de protenas y pueden ser almacenados por largos perodos a temperatura ambiente. En el presente estudio, hemos introducido el gen Ap conjugado con la protena verde fluorescente (GFP) en el arroz y el arroz, administrado por va oral a ratones modificados con el fin de investigar los efectos de Ap en el ttulo del suero de anticuerpos anti-Ap.
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Materiales y Mtodos
Los materiales vegetales

Oryza sativa L. cultivar Hayayuki (arroz Japonica en Japn) fue utilizado en este estudio. Las semillas maduras (arroz) se esterilizaron en etanol al 70% durante 10 s y 1% de hipoclorito sdico durante 15 minutos, y se enjuaga en agua destilada estril. Las semillas se colocaron en medio N6D 15 , 16 para la formacin de callo. Los cultivos se incubaron a 25 C bajo un fotoperodo de 16 h utilizando blanca fra luz fluorescente a 40 mmol / m 2 / s. Calli se aislaron a partir de semillas scutellarioidesen 10-30 das ms tarde, y se utiliza para la induccin del gen Ap.
La construccin del plsmido

La secuencia de codificacin de nuclesido Ap42 se amplific por PCR utilizando cebadores Ap-5'-XhoI (5'-GAAGTCTCGAGTGATGCAGAAT-3 ') y Ap-3'-HindIII (5'GAACGAAGCTTTTACGCTATGACA-3').El gen para la protena APP695 fue utilizada como una plantilla. El producto fue digerido con XhoI y HindIII, y se inserta en pEGFP-C2 (Clontech) en los sitios de restriccin resultantes en pEGFP-Ap-C2. La secuencia de codificacin de nuclesido sgfp (S65T) 17 se amplific por PCR utilizando cebadores sgfp-5'-AgeI (5'ATACCGGTCGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3 ') y sgfp-3'-BglII (5'-

TCAGATCTGAGTCCGGCCGGACTTGTACAGCTCGTCCAA-3'). El producto fue digerido con AgeI y BglII, y se lig al pEGFP-Ap-C2 en los sitios de restriccin para producir psGFP-Ap-C2. El gen fusionado GFP-Ap fue producido mediante la amplificacin de psGFP-Ap-C2 por PCR utilizando cebadores sgfp-5'-XbaI (5'TTTCTAGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3 ') y Ap-3'-SacII (5'TTGAGCTCGACTGCAGAATTCGAAGCTT-3') , seguido por digestin con XbaI y SacII. El vector binario pIG121-HM 18 fue digerido con XbaI y SacII para eliminar el gen intrn-GUS. El gen fusionado GFP-Ap despus se uni a la pIG121-HM para producir pIG121-HM (sgfp + Ap). El vector binario pIG121-HM (sgfp + Ap) se electroporated en Agrobacterium tumefaciens cepa EHA101 utilizando un Escherichia coli generador de pulsos (BioRad). Los transformantes EHA101 (pIG121-HM (sgfp + Ap)) fueron seleccionados en medio LB que contena 50 mg / L de kanamicina, 50 mg / l de higromicina B y 1,2% de Bacto-agar.
Transformacin

EHA101 (pIG121-HM (sgfp + Ap)) se cultivaron durante la noche en medio LB con 50 mg / l de kanamicina, 50 mg / l de higromicina, y 1,2% de Bacto-agar a 25 C. Las bacterias se suspendieron en medio AAM 19 . El arroz callos fueron sumergidos en un medio de AAM que contiene las bacterias durante 15 min. Los callos se transfirieron a medio N6D, modificado a pH 5,2, que contena 100 mM acetosiringona, y se incubaron en la oscuridad a 22 C durante 3 das. Despus de cocultivo, los callos se lavaron con el medio (N6 sales, N6 vitaminas, 2 mg / l 2,4-D, 30 g / l de sacarosa, 400 mg / L, carbenicilina pH 5,8). Lavada callos se cultivaron en medios selectivos (medio N6D con 50 B mg / l de higromicina y 400 mg / L de carbenicilina) a 25 C bajo un fotoperodo 16-h. Blanco o amarillo callos fueron transferidos cada 10 das para el mismo medio. Los callos se transfirieron a un medio de regeneracin de plantas 20 modificado con 100 mg / L de carbenicilina. Los cultivos se incubaron a 25 C bajo un fotoperodo 16h. Calli con manchas verdes o plntulas se transfirieron cada 5-10 das, hasta que las plntulas crecieron a ms de 1 cm de altura. Las plntulas se transfirieron a medio libre de hormonas MS, y las plntulas completamente crecidos se plantaron en el suelo.
Southern blot

ADN extrado de la hoja se digiri con XbaI. La electroforesis se realiz en agarosa 1,0% geles, y ADNs fueron borrados en un Hybond-N + membrana (GE Healthcare) y se sometieron a hibridacin Southern. GFP secuencia que contiene toda la regin de codificacin se utiliz como una sonda. Probe el etiquetado y los procedimientos del

sur de hibridacin se realizaron con el etiquetado AlkPhos directa y sistema de deteccin con el CDP-Star (GE Healthcare).
La cuantificacin de los niveles de expresin en semillas

Semillas congeladas fueron aplastados. La protena total en una semilla (aproximadamente 20 mg) se extrajeron durante 1 h con 400 l tampn de extraccin de protenas (20 mM Tris-HCl (pH 6,5), 8 M de urea, 5% de 2-mercaptoetanol, 20% de glicerol, 4% de SDS) , y se centrifug durante 10 minutos a 20.000 x g . Tres microlitros de cada sobrenadante se aplic a Tris-tricina SDS-PAGE (12% T, 3% de C) junto con Ap (humano, 1-42) (Peptide Institute) como estndares, y la protena separados se transfirieron a un Hybond- P membrana PVDF (GE Healthcare). La membrana se incub primero en tampn de bloqueo (5% de leche descremada, TPBS), y se trat con 6E10 anticuerpos anti-Ap (Sello).La protena de fusin GFP-Ap unido a la membrana se detect mediante el anticuerpo secundario conjugado con HRP (GE Healthcare) y ECL en el signo ms occidental del sistema de deteccin de secante (GE Healthcare).
Ratn de inmunizacin

La cantidad de arroz marrn administr a cada ratn se ajust para proporcionar 10 g de Ap. Triturado arroz se mezcl con la toxina del clera B (CTB, Laboratorios Lista biolgicos) (5 g por ratn) en PBS.C57BL/6J ratones (Charles River) se dividieron en tres grupos (ocho ratones por grupo) y se alimenta por va oral con una aguja de alimentacin (no transgnico arroz, Ap que contiene el arroz (arroz Ap), o arroz hervido Ap). Los ratones recibieron dosis de arroz una vez a la semana de 8 a 11 semanas de edad.Como refuerzo, 0,5 g de Ap mezclado con adyuvante incompleto de Freund se inyect por va subcutnea en todos los ratones a las 14 semanas de edad. La sangre se recogi suero a las 8, 12, 14 y 16 semanas de edad. Los animales fueron alojados a 25 C con una luz de 12 h / ciclo de oscuridad. Todos los animales procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el empleo del Centro Nacional de Investigacin Agrcola de la regin de Tohoku.
Cuantificacin del ttulo de anticuerpos anti-Ap con ELISA

Micro placa pocillos se revistieron con Ap42 disolvi en 0,15 M de amonio. Despus de lavar con PBS-T, los pocillos se bloquearon con tampn de bloqueo (3% de leche descremada, PBS), y se lavaron. Las muestras de sangre de suero se diluy 10-50 veces. Anti-Ap 6E10 anticuerpos (1 mg / ml) se diluy 10,000-160,000 veces como un control positivo. Cada muestra se aplic a un pocillo y se incuba a 37 C durante 1 h. Despus del lavado, cada pocillo fue bloqueado a temperatura ambiente durante 30 minutos con 3% de leche desnatada y se lav de nuevo. Los pocillos se incubaron con HRP-anticuerpo secundario conjugado a 37 C durante 1 hy se lavaron. Los pocillos se

incubaron con un kit de TMB (Pierce) a temperatura ambiente en la oscuridad. La reaccin se detuvo con 2 M de cido sulfrico. Absorbancia a 450 nm se midi con un espectrofotmetro (Infinito F300, Tecan), y los ttulos de anticuerpos se calcularon (0,1 mg / mL 6E10 = 100 unidades / ml ttulo de anticuerpos).
La deteccin de la produccin de anticuerpos anti-Ap por Western blot

Ap (240 ng) se aplica a los geles de poliacrilamida l2% que contena 0, l% de SDS; protenas separadas se transfirieron a una membrana Hybond-P PVDF. La membrana se incub primero en tampn de bloqueo (agente ECL adelantado bloqueo, GE Healthcare), y se trat con muestras de suero (10 veces dilucin). Anti-Ap produccin fue detectado por el HRP-anticuerpo secundario conjugado y el avance ECL Western Blot kit de deteccin (GE Healthcare).
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Resultados y Discusin
Inicialmente, la luminiscencia de arroz transgnico que expresa el gen de fusin EGFPAp era dbil. El sgfp (S65T) gen est diseado para uso de la planta y da una luz ms brillante en la planta que el original GFP 17 . Por lo tanto, expres sgfp lugar de EGFP en el arroz y las semillas transgnicas resultantes de arroz mostraron mayor luminosidad con muchas manchas fluorescentes (Fig. (Fig. 1A,1 A, B). La fluorescencia se localiza principalmente en la capa de aleurona del arroz ( fig. (Fig. 1c).1 C). arroz pulido tena un poco de fluorescencia (Fig. (Fig. 11 D).

Fig. 1

La deteccin de la fluorescencia de GFP en las semillas (arroz integral). (A) de arroz transgnico (semillas superior) y no transgnica de arroz integral (parte inferior de la semilla). (B) Las secciones transversales de arroz transgnico (semillas superior) y no transgnica de arroz integral (parte inferior de la semilla). (C) aleurona (ms ...) Estos resultados muestran que Ap acumula en la capa aleurona, y si el arroz marrn se pule, una proporcin de Ap se retira del arroz. La mayora del arroz se consume en Japn es pulido, y marrn (no pulido) de arroz debe ser consumido para la vacunacin de AD para tener xito. La presencia del gen Ap-GFP en las hojas de las plantas de arroz transgnicas primarias (R 0 plantas de arroz) fue investigado por anlisis de PCR utilizando cebadores sgfp-5'-XbaI y Ap-3'-SacII (datos no presentados). En las muestras de PCR, el anlisis indic la presencia del gen Ap-GFP, anlisis Southern blot se usa para

confirmar la transformacin en plantas individuales (fig. (Fig. 2).2 ). El gen de la ApGFP se introdujo en R 0 plantas excepto la lnea N 32. El resultado positivo de la PCR en el N de lnea 32 planta puede haberse debido a residual de Agrobacterium en el tejido vegetal.

Fig. 2

Southern blot anlisis de XbaI digerido el ADN total investigado por las buenas prcticas agrarias de genes especficos. WT, no el arroz transgnico de plantas: I 0, la planta principal de arroz transgnico. Western Blot se utiliz para investigar la acumulacin de la protena de fusin Ap-GFP en Ap arroz transgnico (fig. (Fig. 3).3 ). La intensidad de la seal de la banda se compara con la intensidad de la seal de Ap42 como un control, y se observaron diferencias entre las lneas. La concentracin ms alta, 8 g de Ap en un solo grano de arroz (400 g / g de arroz integral) se encontr en muestras de la lnea 29, en comparacin con 18-50 mg Ap 13 y 77 mg Ap 14 por gramo de protena soluble que se encuentra de la papa en los estudios anteriores.

Fig. 3

Determinacin de A42 niveles de expresin. Brown muestras de arroz fueron sometidas a SDS-PAGE con Ap42 en concentracin creciente (5, 10, 20, 40 y ng 60). Aproximadamente 0,15 mg de semillas trituradas se aplic a cada carril. R 0 semillas (R unageneracin) (ms ...) La inmunogenicidad de arroz Ap fue evaluada por la alimentacin de arroz marrn Ap a ratones C57BL/6J, de 8 a 11 semanas de edad, y la evaluacin de suero anti-Ap ttulo de anticuerpos mediante ELISA (Fig. (Fig. 4).4 ). A las 12 semanas de edad, se observ un aumento significativo en los ttulos de anticuerpos sricos contra el Ap en los ratones alimentados con arroz hervido Ap, el aumento no fue significativo en los ratones alimentados con arroz crudo Ap. Anti-Ap anticuerpos tambin se detect por Western blot en ratones alimentados con Ap arroz (Fig. (Fig.4B).4 B). No hay un aumento del ttulo de anticuerpos anti-Ap fue detectado en los ratones a las 14 semanas de edad, tres semanas despus de la ltima administracin oral (Fig. (figura 4c);4 C), pero el ttulo de anticuerpos anti-Ap aument significativamente de nuevo en 16 semanas de edad, despus de una inyeccin subcutnea de refuerzo (Fig. (Fig. 44 D).

Fig. 4

Los ttulos de anticuerpos contra el Ap en el suero de 8 semanas de edad, los ratones antes de la inmunizacin (A), ratones de 12 semanas de edad y 14 semanas de edaddespus de la inmunizacin (B, C, cada uno), y 16 semanas de edad despus de los ratones de refuerzo de la inyeccin (D). Anti-Ap ttulos de anticuerpos para cada uno (ms ...) El aumento de ttulo de anticuerpos anti-Ap despus de la inyeccin de refuerzo muestra la presencia de la respuesta de anticuerpos anti-Ap en ratones alimentados con arroz crudo Ap o arroz hervido Ap. Sin embargo, el aumento del ttulo de anticuerpos anti-Ap a las 12 semanas de edad muestra la inyeccin de refuerzo no era necesario para la inmunizacin oral Ap. En un estudio previo con el pimiento verde contiene Ap 11 , se analiz el efecto sobre los ttulos de anticuerpos anti-Ap de los ratones inmunizados por va oral y los ratones inmunizados por va subcutnea durante un largo plazo (12,5 meses) el juicio. Los aumentos en la concentracin de anticuerpo anti-Ap de los ratones inmunizados por va oral fueron similares a los aumentos en los ratones inyectados. En el presente estudio, el aumento de los niveles de anticuerpos anti-Ap de los ratones alimentados con arroz Ap no eran tan grandes como los observados en los ratones que recibieron una inyeccin de refuerzo. La diferencia entre los estudios pueden surgir de las diferencias en el perodo de administracin del antgeno. Adems, incluso si una respuesta de anticuerpos es dbil, Ap en los cerebros de ratones pueden ser eliminados por la inmunizacin a largo plazo de los modelos de ratn AD21 . Tomados en conjunto, llegamos a la conclusin de que a largo plazo de la administracin oral de arroz Ap Ap sin inyeccin puede prevenir y tratar el TDA en los ratones. En general, el efecto inmunolgico tras la administracin oral, la inmunizacin mucosa intestinal tiende a ser dbil, y este mtodo puede inducir tolerancia inmunolgica. Tolerancia inmunolgica oral puede ser suprimida por el uso de coadyuvantes especficos. Toxina bacteriana, tal como CTB, se utiliza a menudo como un adyuvante en la inmunizacin oral de ratones. Aunque CTB no puede ser altamente txico, puede haber algunos efectos secundarios clnicos. Un adyuvante ms seguro podra ser desarrollado a partir de plantas que producen compuestos tales como saponina 22 y puede ser factible para desarrollar adyuvante libre de vacuna oral de las plantas. Estudio de los animales ms es necesario para determinar la eficacia del arroz Ap adyuvante libre de la EA. En un estudio anterior, hemos desarrollado una tcnica en la que se infect una planta (pimiento verde) con un virus de plantas, causando Ap a acumularse dentro de la planta 12 . Los ratones que fueron administrados por va oral Ap que contiene tejido de la planta mostraron niveles ms bajos de suero IgG2a, una enfermedad inflamatoria Th1 globulina inmunolgica, que los ratones en los que se administr la vacuna por inyeccin 11 . Estos resultados indican que la vacuna de origen vegetal es seguro y

eficaz. Adems, las vacunas hizo uso de plantas son mucho ms seguras que las vacunas de clulas animales o microbios ya que hay menos peligro de que la vacuna es adulterada con las protenas prinicas, virus patgenos o toxinas bacterianas. As, derivados de plantas vacunas requieren menos purificacin, y puede ser producido econmicamente. 'Hayayuki' La variedad de arroz utilizada en este estudio es una variedad temprana de maduracin que puede ser cosechada aproximadamente 3 meses despus de la siembra. Por otra parte, su forma compacta permite que todo el ao la produccin en una fbrica de efecto invernadero o la planta de modo que el arroz transgnico podra ser fcilmente contenidos. El costo adicional de la produccin de contenidos es probable que se justifica por un alto valor aadido del producto, tales como un remedio para la EA. En el presente estudio, hemos demostrado que la administracin oral de arroz a los ratones Ap elevado suero anti-Ap ttulo de anticuerpos. Hemos determinado anteriormente la administracin oral de pimiento verde Ap Tg2576 de modelos de ratn elevado suero anti-Ap ttulo de anticuerpos y la reduccin de las placas seniles, y que exista una correlacin inversa entre los niveles de anticuerpos anti-Ap Ap y soluble en intracerebral 11 . Es probable que la acumulacin de A en el cerebro puede ser suprimida mediante la administracin de arroz Ap. Tenemos la intencin de un experimento an ms con los modelos de ratn de AD para investigar si la inmunizacin oral por administracin a largo plazo del arroz Ap disminuye las placas seniles. El arroz se come comnmente en forma de granos sin haber sido pulverizado. Esto hara ms fcil controlar el consumo, como ocurre con los medicamentos en forma de pldora. Adems, cuando el arroz se come como un elemento bsico, es posible asegurar una ingesta regular. En el presente estudio, hemos demostrado que el arroz hervido Ap no reduce la eficacia de la vacuna, lo que permite su uso como una vacuna comestible. La facilidad de uso de una vacuna arroz Ap para AD hace que este la vacuna ms atractivo para prevenir y tratar la enfermedad.
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Agradecimientos
Nos gustara agradecer a la Dra. S. Hidaka y el Dr. N. Yamagishi por sus valiosos consejos. Este trabajo fue apoyado en parte por la financiacin de la Investigacin para la Promocin de Semillas Tecnolgicos de la Agencia Japonesa de Ciencia y Tecnologa.
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