LA PRUEBA DEL ADN EN LA INVESTIGACION DEL DELITO Y LA FILIACION

Oscar Dario Palacio Salas Laboratorio de Gentica Forense Universidad de Antioquia

Introduccion.
La

investigacin criminal se ha visto apoyada en los ltimos aos por herramientas probatorias revolucionarias que han llevado a esclarecer un gran numero de casos y a castigar a los responsables.

Importancia

Muestras Biolgicas:
Se obtienen

principalmente tras la comisin de delitos tales como:

Asesinatos. Robos. Violaciones. Accidentes de trnsito etc.

Ayudan en la investigacin criminal para:

1. 2.

3.

4. 5. 6.

Identificar una persona. Excluir individuos falsamente acusados. Ligar un sospechoso y/o victima a una escena. Ligar un arma a la victima. Reconstruir la escena. Orientar la investigacin (la evidencia fsica es mas confiable que los testigos).

EVOLUCIN HISTRICA

No

existan pruebas biolgicas de paternidad. Valorar el parecido familiar. Legislacin babilnica: cdigo del Hummurabi (hace 4000 aos). Prohibida y castigada la investigacin de la paternidad. Roma antigua: Indagacin. Condicin del nio concebido extramatrimonialmente: filius nulius (existencia nula).

EVOLUCIN HISTRICA

Libro Shi-Yuang-Lu (1247). Mtodo empleado por los chinos para investigar la paternidad biolgica del padre.
Padre vivo: mezcla de sangre del presunto padre y el hijo. Formacin de un precipitado: Positivo de paternidad. Ausencia de precipitado: Negativo de paternidad. Padre fallecido: se verta la sangre del nio sobre los huesos del presunto padre.

Edad Media: bastardos en las parroquias. El que hace al nio tiene que alimentarlo.

Sangre adherida a los huesos: Positivo de paternidad.

EVOLUCIN HISTRICA
Inicio de la Heredobiologa: estructuras y caracteres

de nuestro organismo influenciados por la herencia y objetivables por medio de determinadas pruebas. KUHNE: Variaciones en la disposicin anatmica de la columna vertebral. Estudio de los dermatoglifos. Capacidad de percibir el sabor amargo. Descripcin del sistema ABO por Karl Landsteiner en el ao 1900.

EVOLUCIN HISTRICA

Hasta el ao 1900 el parecido fsico era el nico

parmetro concreto mediante el cual se poda tratar de dilucidar una paternidad. A partir del ao 1900 se describieron una serie de marcadores genticos: Antgenos de los eritrocitos. Enzimas eritrocitarias. Antgenos de los leucocitos. Enzimas leucocitarias. Protenas enzimticas. Marcadores genticos del ADN.

ANTGENOS ERITROCITARIOS

Fundamentos biolgicos de la prueba

La molcula del ADN.

Mucho

demoro comunidad cientfica en demostrar la sustancia responsable de la herenciay explicar sus propiedades para transmitir la informacin hereditaria.

tiempo la

1865

La molcula del ADN

DNA en la Clula
cromosoma Ncleo de la clula Molcula de DNA de Cadena Doble

Regin Blanco para PCR

Nucleotidos individuales

Gentica mendeliana.
TT tt

Tt

Tt

Tt

Tt

TT

Tt

Tt

tt

Gentica de paternidades
8-8 10-10

8-10

8-10

8-10

8-10

8-8

8-10

8-10

10-10

Gentica Mendeliana.
Cada unidad del par de genes recibe el

nombre de alelo. Luego se descubrieron los cromosomas que son los vehculos donde viajan los genes. Los genes se encuentran por duplicado y cada miembro del par esta localizado en los cromosomas en un sitio particular denominado locus.

Repeticiones cortas en tndem (STRs)

AATG

7repeticiones 8 repeticiones
las regiones de repeticin son variables entre muestras mientras las regiones que flanquea los primers son constantes en la PCR

Homozygoto = ambos son alelos de la misma longitud Heterozygoto = alelos diferentes en longitud uno del otro

James Watson y Francis Crick (1953)

El lenguaje del ADN.

La variabilidad del ADN permite identificar personas:

Muchos

de nuestros genes presentan alelos variantes; algo as como cuando utilizamos varias frases distintas para transmitir la misma idea. De modo que es posible encontrar muchas diferencias entre individuos segn la combinacin de alelos que porten para un gen en particular, a este tipo de secuencias de ADN se les llama polimorfismos genticos.

Distribucin homognea.
Si

bien un Gen puede ser altamente polimorfico por presentar muchos alelos, es importante que sus variantes alelicas en la poblacin estn distribuidas de manera homognea. As que el marcador ideal seria aquel que presente un alto numero de alelos y al mismo tiempo una distribucin homognea de sus frecuencias en la poblacin.

Los genes en las poblaciones humanas:

Combinacin de los alelos de un

gen en el nuevo individuo. La mayora de las poblaciones son muy diversas por causa de la migracin. Se debe caracterizar la poblacin que ser objeto de estudio para hallar la probabilidad de un hallazgo molecular en la investigacin de parentesco.

Caractersticas de una poblacin:

Apareamientos

son

aleatorios. Si no existen migraciones desestabilizantes. Si la poblacin tiene un tamao importante. Si el gen no sufre mutaciones.

MARCADORES GENTICOS DEL ADN

Polimorfismo de ADN
Podemos

agrupar los tipos de polimorfismos del ADN en dos categoras: polimorfismo de secuencia y polimorfismo de tamao

Polimorfismo de secuencia.
Dos

alelos de un gen pueden diferenciarse en algunos nucletidos de su secuencia aunque conserven el mismo tamao. Ej. HLA. Este sistema contiene varios genes agrupados en dos clases: Clase I: HLA-A, HLA-B Y HLA-C. Clase II: HLA-DP, HLA-DQ Y HLA-DR

Polimorfismos de tamao:
Esta vez nos referimos a que los alelos de

un gen varan dependiendo de su tamao. Se trata de secuencias de ADN distribuidas en miles de loci por todo el genoma que se repite en un numero variable de veces. VNTRs (variable number of tamdem repeats). Aquellos que poseen repeticiones en numero variable, arregladas en serie y sin interrupcin a lo largo del cromosoma.

Polimorfismos de tamao:
Teniendo en cuenta la alta variabilidad de

estos sistemas Jeffreys sostuvo que la probabilidad de encontrar dos individuos con el mismo perfil multilocus de ADN, en el planeta era casi nula por lo que se denomino al sistema el DNA fingerprinting o huellas de ADN y lo propuso como una marca individual que podra ser utilizado con fines de identificacin de personas.

MINISATLITES
Descubiertos en la dcada del 80. Altamente polimrficos. Constituidos por secuencias de ADN de 10 a 100

pb. que se repiten desde 2 hasta cientos de veces, organizadas una a continuacin de la otra, por lo cual se les conoce como VNTR. Su polimorfismo est dado por el nmero de repeticiones.

Obtencion de la evidencia y solicitud de la prueba.

Obtencion de la muestra.
Sangre. Manchas de sangre. Pelos. Piel o Sangre bajo las

uas. Muestras de semen. Muestra post-coital. Preservativos Muestras de referencia.

Recoleccin:
todo lo que

sea transportable debe ser remitido al laboratorio.

Recoleccin (Bioseguridad):
1. 2.

3.

Buscar sangre de la victima en el sospechoso o en sus prendas. Buscar sangre del sospechoso en la victima o en sus prendas. Buscar sangre o manchas en el sitio o escena del delito.

Al tomar la posible mancha de sangre se debe tener en cuenta lo siguiente:

1. 2.

3.

4.

No contaminar la mancha. No diluir la muestra (utilizando excesiva cantidad de agua para removerla). No mezclar la mancha con otras recogidas en el mismo lugar. No utilizar sustancias qumicas u objetos con aditivos qumicos que puedan alterar la muestra.

Al tomar la posible mancha de sangre se debe tener en cuenta lo siguiente:

1. 2. 3.

4.

Instrumentos nuevos. Nunca guardar una mancha hmeda. No recoger mas de una mancha con el mismo instrumento (tela, escobillon, pinza, bistur). Marcar o describir el sitio de donde se tomo la muestra.

Mtodo de Recoleccin (Raspado):

Ventaja:

evita utilizar agua que puede ocasionar dilucin de la muestra. Desventaja: el perito no observa o analiza el objeto completo y es posible la presencia de otras manchas que pueden pasar desapercibidas

Mtodo de Recoleccin (Tela):

Ventajas: la mancha se concentra sobre

una pequea rea y el laboratorio no necesita pasarla a otro material para anlisis. Desventaja: si no se hace de la manera correcta la mancha puede diluirse demasiado. Nota: siempre debe remitirse un fragmento del material usado para la recoleccin como control negativo.

Mtodo de Recoleccin
Limpieza con

escobillon. Manchas en estado liquido o semilquido. Manchas muy pequeas sobre objetos no transportables. Recoleccin de manchas en tierra o arena.

Identificacin:

Todo material recolectado debe ser perfectamente marcado e identificado con la siguiente informacin:
1. 2.

3. 4. 5.

Lugar, fecha y hora. Descripcin completa de la evidencia y donde se encontr. En caso de prendas identificar a quien pertenecen (victima, sospechoso, etc.). Nombre de quien la recolecto y cdigo. Numero de inspeccin del cadver, sumario, proceso, etc. Firma del responsable de la diligencia.

Embalaje:
Prendas y/o manchas hmedas. Deben secarse completamente antes de ser embaladas, de lo contrario pueden descomponerse por la presencia de bacterias y hongos. Una vez secas deben envolverse en bolsas de papel, protegiendo la superficie manchada con papel entre la mancha y el resto de la prenda

Muestras de referencia:
Siempre deben

remitirse las muestras de referencia: victima sospechoso y/o lesionado en tubo tapa lila (con anticoagulante EDTA) o enviar a las personas al laboratorio para que all sea realizada la toma.

Obtencin de perfiles de ADN en el Laboratorio

Extraccin de ADN

Reaccin en cadena de la polimerasa.

PCR: Copias DNA Exponencialmente a travs de Mltiples Ciclos Trmicos

Secuencia original en PCR

Ciclo Trmico

En 32 ciclos con 100% eficiencia, 1.07 billn de En 32 ciclos con 100% eficiencia, 1.07 billn de copias de la regin DNA de intres es amplificada copias de la regin DNA de intres es amplificada

Electroforesis.

Analisis de ADN

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

SECUENCIACION.

Como realizar genealogias????

Paternidades simples o simplificadas

Esta presente el tro (Presunto Padre, madre e hijo). 1. Se observa el aporte de la madre. 2. La informacin gentica restante se coteja con la del presunto padre.

CSF1PO:12-13

CSF1PO:14-16

CSF1PO:12-14

PADRE

MADRE

13-13

12-14

12-13

HIJO

ANLISIS DE ADN MINISATLITES

Coincidencia de las bandas del hijo con el padre que no

hubieran sido detectadas en la madre.

Madre __ Hijo __ P.padre 1

P.padre 2

__ __

__ __

__
Desventaja: los clculos de probabilidad de paternidad se

realizan sobre supuestos genticos no comprobados en cada uno de los diferentes loci detectados.

TIPOS DE RESULTADOS
NO EXCLUSION 70%. EXCLUSION 30%.

Informe de paternidad

ANLISIS DE PATERNIDAD POR MICROSATLITES

SISTEMAS STRs D16S539 D7S820 D13S317 FESPS TPOX TH01 FGA 9-11 10-11 8-12 10-10 9-11 7-7 13-13 5-10 10-10 11-12 10-11 8-11 6-7 7-8 9-10 10-10 11-12 10-10 11-11 6-7 7-13 P. PADRE MADRE HIJO

INCLUSIN de la paternidad con un 99.999999% de confiabilidad.

Paternidades con ausencia de algn progenitor

Paternidades complejas.

Principal problema
Deduccin perfil gentico incompleto (varios perfiles, un solo alelo) A medida que disminuye la informacin gentica, tambin lo hace el ndice y probabilidad de paternidad. Recurrir al MAXIMO DE M. G. y Familiares Informativos.

PATERNIDADES COMPLEJAS CON ABUELOS PATERNOS

El caso ms sencillo de una paternidad compleja es aquel en los que podemos recurrir a los presuntos abuelos paternos. En los abuelos paternos tendremos toda la informacin gentica del presunto padre fallecido (mitad del padre que corresponde al abuelo paterno y mitad de la madre o abuela paterna del demandante)

Genealoga de padre muerto

CSF1PO: 12 -14

CSF1PO: 13 -15

X
CSF1PO: 14 -16 CSF1PO: 12 -14

Los posibles Genotipos del Presunto Padre son: 12-13 12-15 13-14 14-15 El hijo es: 12-14 La madre es: 14-16 Los perfiles del PP coincidentes con el hijo son los que presentan el alelo 12

Principal desventaja
El resultado final es aplicable a

cualquier hijo de los abuelos, por lo que si se sospechara que pudieran dos hermanos ser los presuntos padres, el anlisis gentico no nos servira para nada. Es muy importante la interpretacin correcta de los resultados

Paternidades complejas con un abuelo paterno y con hermanos del presunto padre fallecido.

X
CSF1PO 13-14

CSF1PO 13-15

CSF1PO 12-13 CSF1PO 12-15

X
CSF1PO 14-16 CSF1PO 12-14

Cuando slo se tiene uno de los presuntos abuelos y hermanos completos del fallecido se reconstruyen los posibles genotipos del abuelo que no esta presente y a partir de all todos los posibles genotipos del presunto padre, los clculos estadsticos son ms complejos.

PATERNIDADES COMPLEJAS CON HIJOS DEL PADRE FALLECIDO

Si no disponemos de los abuelos podemos recurrir a por lo menos dos hijos reconocidos del padre fallecido, con sus respectivas madres y el demandante con la madre.

Paternidad reconstruccin del perfil del presunto padre muerto

X
CSF1PO 8-10 CSF1PO 14-16

CSF1PO 12-14 CSF1PO 8-12 CSF1PO 8-13 CSF1PO 10-12

Analisis estadistico de las pruebas de paternidad con marcadores autosomicos.

Indice de paternidad. Probabilidad de

exclusin. Probabilidad de inclusin.

Anlisis de paternidad
Cromosoma Y y ADNmt

Estructura del cromosoma Y

Por: Anibal Alberto Gaviria G.

GENOMA MITOCONDRIAL
Secuenciado por Anderson

y cols. en 1981 Representa el 1-2% del DNA celular. Localizado en la matriz mitocondrial. Presente en mltiples copias por organela. Constituido por un solo cromosoma. Molcula circular de doble cadena. No se encuentra asociado a histonas.

GENOMA MITOCONDRIAL
No es genticamente autosuficiente. Mide 5 um de longitud. Tamao: 16569 pb. Codifica 37 genes. Posee cdigo gentico

propio. 10% de genoma no codificante. Vara en longitud en las diferentes especies.

INDIVIDUO 1

INDIVIDUO 2

Regin control-ADNmt HVI (~400 bp) HVII (~400 bp) tRNAPro tRNAPhe

CDIGO GENTICO
CODN CODIGO UNIVERSAL
MAMIFEROS DROSOPHILA LAVADURAS PLANTAS

CDIGOS MITOCONDRIALES

UGA AUA CUA AGA AGG

PARADA Ile Leu Arg Arg

Trp Met Leu PARADA PARADA

Trp Met Leu Ser Ser

Trp Met Thr Arg Arg

PARADA Ile Leu Arg Arg

Caractersticas Tamao Nro molculas distintas Nro copias x cel. Organizacin Nucleosoma Nro de genes Densidad % DNA codif. Presencia de intrones Secuencias rep. Herencia

Nuclear 6x109 pb 23 mujer 24 hombre 2 lineal si 50000 a 100000 1gen cada 30 a 60Kb. 2% si

Mitocondrial 16569 pb 1 crs circular 1000 0 mas Circular No 37 1 gen cada 0.45 Kb 95% No

Mayor de 1 por crs No sufre meiosis mendeliana Va materna

DNA mitocondrial.
Los

espermatozoides aportan (50-75 mitocondrias, con una sola copia de DNAmt). Ovocito maduro posee 100000-200000 copias de DNAmt. Tambin se cree que puede haber un reconocimiento activo y degradacin selectiva de las mitocondrias paternas dentro del ovocito fecundado. Movilidad produce radicales libres de oxigeno, lo que produce un dao oxidativo en el DNAmt

Autosomas
ABUELOS PATERNOS

Y mt

ABUELOS MATERNOS

PADRE

MADRE

VA PATERNA

VA MATERNA

Transmisin matrilineal.

Transmisin matrilineal.

HERENCIA DEL ADN MITOCONDRIAL

Genoma mitocondrial.
Debido

a su alta tasa de mutacin, herencia materna, falta de recombinacin y a estar completamente secuenciado, el DNAmt es til para la investigacin de los eventos evolutivos. Los segmentos hipervariables de la regin control presentan haplotipos caractersticos de cada grupo poblacional y a su vez cada haplotipo posee diferentes haplotipos.

Aplicaciones forenses.
El poder discriminatorio por las

caractersticas de las regiones hipervariables. Con fines de origen de identificacin, tambin estudios evolutivos o antropolgicos. Ventaja: miles de copias por clula. Es estable en muestras degradadas o antiguas.
Dictamen por medio de comparacin. Desventaja: secuenciamiento.

Aplicaciones forenses:
Se utiliza cuando no se pueda excluir una

persona con el DNA nuclear. www.mitotyping.com mediante la comparacin de secuencias se puede ser excluido o incluido un individuo? Sirve en procesos de eliminacin o descarte. Posee una tasa de error de replicacin mas alta que el nuclear. Se sabe que puede haber heteroplasmia.

Cuando se debe utilizar el ADNmt

Poca muestra para analizar Grado de degradacin de esta. ADNmt brinda informacin adicional. Pelos sin bulbo. El abordaje estadstico del DNAmt es muy

complejo. Amplificacin del DNAmt es mas fcil. Restos seos antiguos

LECTURA

Heteroplasmia
Se define como el estado en el que un

individuo presenta mas de un genotipo de ADNmt. Cuando una mutacin surge en una de las molculas de ADNmt dentro de la mitocondria, esto crea una mezcla intracelular de molculas mutantes y normales. Baja en sangre y alta en cerebro Existen unos sectores de policitocinas susceptibles a la heteroplasmia.

Contaminacin
Muestras

limite susceptible a contaminacin. Necesita cmara de flujo laminar. Controles negativos de extraccin como de amplificacin. Estudio de la regin HPV de los peritos. ADN antiguo por PCR vs ADN moderno

Anlisis de ADNmt en muestras antiguas.

Principal

avance en la antropologa. Vital importancia para estudios de evolucin. Exhumacin avanzada degradacin. Osteocitos y osteoblastos. Anlisis PCR secuenciamiento.

Conclusion DNAmt
anlisis antropolgico como gentico

forense. Se presenta en grandes cantidades. menor riesgo de degradacin mayor tasa de mutacin. Herencia matrilineal Permite estudios de evolucin y patrones de migracin a lo largo de la historia. La heteroplasmia se debe tener en cuenta a la hora de emitir un dictamen.

Anlisis de ADN en los delitos sexuales

ANLISIS DE ADN
Determinar si los espermatozoides

encontrados en Ana, corresponden a Federico y/o a Pedro

Sistem de a anlisis Federico sangre Pedro sangre
Esperm atozoi des en frotis vaginal de A na

H M y W 31 U A H M O U TH 1 H M U F13A I H M U FES H M U TPO X

15, 16 8, 9.3 3.2, 7 12, 13 8, 12

16, 17 6, 7 6, 6 11, 11 11, 11

16, 17 6, 7 6, 6 11, 11 11, 11

ANLISIS DE ADN
Sistema de anlisis Federico sangre Pedro sangre
CAROLINA SANGRE Espermatozoi des en frotis vaginal de Carolina

HUM y WA31 15, 16 HUMTHO1 HUMF13AI HUMFES HUMTPOX 8, 9.3 3.2, 7 12, 13 8, 12

16, 17 6, 7 6, 6 11, 11 11, 11

18 , 18 6, 9 7,7 11, 11 9 , 10

15, 16, 17 , 18 6, 7 , 8 , 9 , 9.3 3.2, 6, 7 11, 12 , 13 8, 9,10, 11, 12

ANLISIS DE ADN
Determinar si los espermatozoides

encontrados en Ana, corresponden a Federico y/o a Pedro

Sistem de a anlisis Federico sangre Pedro sangre
Esperm atozoi des en frotis vaginal de Ana

DYS19 DYS390 DYS391 DYS392 DYS393

13 22 9 13 13

16 22 8 11 16

13 22 9 13 13

SISTEMAS STRs D16S539 D7S820 D13S317 FESPS TPOX TH01 FGA 9-11 10-11 8-12

SIMON

MARTHA

MANCHA DE SEMEN

CARLOS

5-10 10-10 11-12 10-11 8-11 6-7 7-8

5, 9, 10 10 11, 12 10, 11 8, 11 6, 7 7, 8, 13

9-10 10-10 11-12 10-10 11-11 6-7 7-13

10-10 9-11 7-7 13-13

Interpretacin de la prueba.
Es correcto que la exclusin tiene una

certeza total en paternidades. Siempre y cuando se mantenga una adecuada cadena de custodia. Se deben tener en cuenta las mutaciones (cambio en las secuencias o el tamao de los fragmentos). Misma combinacin de alelos depende de que tan frecuente sea el perfil gentico en cuestin.

La aplicacin que mas le interesa tanto al juez como al perito.

Evaluar el nivel de incertidumbre

que se tiene ante un hallazgo gentico coincidente: que tan probable es que la muestra venga del sospechoso una vez sea demostrado que coinciden todos los marcadores genticos analizados y finalmente deber valorar en trminos probabilsticos su grado de creencia final sobre la culpa una vez cuente con el resultado de la prueba gentica.

GRACIAS