UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO.

DETERMINACIN FUNCIONAL DE LA EXPRESIN DEL RECEPTOR CD47 EN CELULAS DE SANGRE PERIFRICA DE PACIENTES CON CANCER DE PULMN COMO MECANISMO DE EVASIN DE LA FAGOCITOSIS. PROYECTO DE INVESTIGACIN Maestra en Ciencias Biolgicas. Biologa Experimental.

PRESENTA: Mauricio Snchez Marn. TUTORA PRINCIPAL: Dra. Lourdes Ma. Barrera Ramrez. COMIT TUTORIAL: Dr. Alejandro Zentella Dehesa. Dr. Oscar Arrieta Rodrguez.

1.1.INDICE

2. Introduccin.
3. Planteamiento del problema. 4. Objetivos 4.1. Objetivo General 4.2. Objetivos Especficos. 5. Metodologa General. 5.1. Metodologa: Poblacin de estudio y Muestra. 5.2. Metodologa: Obtencin de clulas Mononucleares de sangre perifrica. 5.3. Metodologa: Determinacin expresin CD47 por citometra de flujo. 5.4. Metodologa: Modelo in vitro de evaluacin de fagocitosis. 6. Bibliografa.

7. Cronograma.

2. INTRODUCCIN. EL ESCENARIO MUNDIAL Y NACIONAL

El cncer de pulmn es la causa ms frecuente de muerte por cncer en hombres y la cuarta en mujeres en todo el mundo1. En Mxico, el cncer de pulmn es la segunda causa de muertes por tumores malignos en hombres y la octava en mujeres. Es la enfermedad ms importante atribuible al tabaquismo.

1 Ferlay J, Shin HR, Bray F, Forman D, Mathers C and Parkin DM. GLOBOCAN 2008 v1.2, Cancer Incidence and Mortality Worldwide: IARC CancerBase No. 10 [Internet]. Lyon, France: International Agency for Research on Cancer; 2010. Available from: http://globocan.iarc.fr, accessed on day/month/year.

2. INTRODUCCIN. LA FUNCIN DE CD47

CD47 es una protena tipo inmunoglobulina que es conocida por interactuar funcionalmente con integrinas y trombospondina 1. (Li et al., 2002)

Tiene un papel en funciones tan diversas como: la migracin de neutrfilos, extensin de axones y coestimulacin de clulas T. (Jaiswal et al., 2009)

Modelo general de la estructura de la protena CD47. De: SpringerImages; www.springerimages.com

2. INTRODUCCIN. CD47 Y LA FAGOCITOSIS

Hay 3 mecanismos de sealizacin que facilitan la fagocitosis de clulas apoptticas mediada por macrfagos. Un mecanismo de sealizacin involucra la interaccin entre CD47 y la protena reguladora de seal alfa (SIRP). (Lawrence et al., 2009). La unin entre SIRP y CD47 inhibe la fagocitosis.
De Motegi et al., 2003

La fosforilacin de SIRP genera sitios de unin para las fosfatasas SHP-1 y SHP-2.

2. INTRODUCCIN. CD47 Y LEUCEMIAS.

En leucemias de humanos se ha observado una sobreexpresin de CD47. Hay una correlacin entre los niveles de expresin de CD47 y la evasin de fagocitosis; entre menor es el nivel de expresin de CD47 en clulas, estas son fagocitadas. Las leucemias tambin sobrerregulan CD47 para protegerse de ser fagocitadas a su vez. (Jaiswal et al., 2009); De hecho, altos niveles de expresin de CD47 en clulas de leucemia aguda linfoide estn correlacionadas con un bajo pronstico para el paciente. Un bloqueo de CD47 por medio de anticuerpos monoclonales ha permitido la fagocitosis de clulas leucmicas (Chao et al., 2011)

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Conocer

la expresin del receptor CD47 en distintas subpoblaciones celulares y evaluar su papel en el mecanismo de evasin de la fagocitosis en pacientes con cncer de pulmn.

4.1. OBJETIVO GENERAL

Determinar

la expresin del receptor CD47 en las poblaciones celulares presentes en muestras de sangre perifrica de pacientes con cncer pulmonar (adenocarcinoma) en estadios clnicos IIIA, IIIB y IV y sujetos sanos, evaluando el efecto de dicha expresin en la evasin de la fagocitosis.

4.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

1. Determinar la expresin del receptor CD47 en las siguientes poblaciones de sangre perifrica: clulas T, NK, B, neutrfilos, clulas progenitoras y clulas de origen mieloide inmaduras. 2. Estudiar el efecto de la expresin del CD47 en la fagocitosis mediada por macrfagos homlogos diferenciados en un modelo in vitro. 3. Estudiar las posibles correlaciones de la expresin diferencial del receptor CD47 y los parmetros clnicos estudiados.

5.1. METODOLOGA: POBLACIN DE ESTUDIO Y MUESTRA

Se seleccionarn sujetos con diagnstico confirmado de cncer de pulmn de la estirpe histolgica adenocarcinoma en colaboracin con el Instituto Nacional de Cancerologa.
Se formarn 4 grupos de sujetos: un grupo control y tres grupos de pacientes en etapas clnicas IIIA, IIIB y IV. Los pacientes en el estudio sern reclutados y clasificados de acuerdo con el sistema TNM para la clasificacin del cncer de pulmn recomendado por el Comit Americano para el Cncer. El diagnstico histolgico de cncer pulmonar de clulas no pequeas primario, se establecer de acuerdo a la clasificacin de tumores pulmonares de la Organizacin Mundial de la Salud y de la Asociacin Internacional para el estudio del Cncer de Pulmn. La evaluacin preclnica incluir el examen fsico, perdida de peso y estado fsico general con un ndice de 2 de acuerdo con las normas del ECOG. Se realizar un estudio piloto donde se incluirn 20 pacientes con cncer pulmonar en las distintas etapas estudiadas as como 20 donadores sanos.

5.2. METODOLOGA: OBTENCIN DE CELULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFRICA

Previo consentimiento informado y antes de recibir algn tratamiento, se obtendrn muestras de sangre perifrica de 15 ml de cada sujeto incluido en el estudio (pacientes y controles).
Las clulas mononucleares de sangre perifrica (CMN) de los diferentes grupos de pacientes sern separadas por centrifugacin y posteriormente, se resuspendern en dimetilsulfxido (DMSO) al 10% y suero fetal bovino (SFB) al 90% y se conservarn en nitrgeno lquido hasta su uso. El estudio de la expresin de CD47 en poblaciones de origen granuloctico se realizar a partir de 50l de sangre completa por cada combinacin de anticuerpos.

5.3. METODOLOGA: DETERMINACIN EXPRESIN DEL RECEPTOR CD47 POR CITOMETRA DE FLUJO

Uso de Anticuerpos. Se utilizarn los siguientes anticuerpos monoclonales: anti-CD47, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD8, anti-CD16, anti-CD56, anti-CD19, anti-CD20, anti-CD15, anti-CD66b, anti-HLA-DR, anti-CD33, antiCD34, anti-CD38, anti-CD24, anti-CD44, anti-CD90 y antiCD133.

Determinacin de fenotipos de subpoblaciones celulares por citometra de flujo. Se usarn CMN de pacientes y controles para tinciones de antgenos de superficie. Posteriormente se incubarn con 20l de anticuerpo durante 30 min, y sern analizadas en el citmetro de flujo FACSAria con software FACSDiva 6.5.

5.4. METODOLOGA: MODELO IN VITRO DE EVALUACIN DE LA FAGOCITOSIS

Diferenciacin de macrfagos provenientes de monocitos circulantes. Se purificarn monocitos a partir de CMNs mediante perlas inmunomagnticas acopladasa a un anticuerpo anti-CD14. Despus se sembrarn en placas de cultivo de 24 pozos.

Para inducir la diferenciacin de monocitos en macrfagos, los monocitos sern cultivados durante 7 das en medio con antibiticos. Los marcadores CD14 y CD68 sern evaluados cada 24 hrs por citometra de flujo. El medio de cultivo ser reemplazado a los 3 das de cultivo.

5.4. METODOLOGA: MODELO IN VITRO DE EVALUACIN DE LA FAGOCITOSIS

Separacin de poblaciones celulares. Se separarn por citometra de flujo las distintas subpoblaciones celulares (clulas T, B NK, neutrfilos o clulas progenitoras CD34+)

Evaluacin de la fagocitosis mediada por los macrfagos diferenciados sobre neutrfilos y clulas progenitoras circulantes (CPC). Las dos subpoblaciones sern separadas por seleccin positiva mediante perlas inmunomagnticas acopladas a anticuerpos adecuados. La pureza de la separacin se determinar por citometra de flujo. Cada poblacin ser marcada con 10M de CMFDA previo al cocultivo para evaluacin de la fagocitosis.

5.4. METODOLOGA: MODELO IN VITRO DE EVALUACIN DE LA FAGOCITOSIS

Ensayo de evaluacin de fagocitosis por citometra de flujo. Los macrfagos diferenciados y cada una de las subpoblaciones celulares previamente purificadas y marcadas con CMFDA se co-cultivarn (neutrfilo: macrfago 5:1; CPC: macrfago 5:1) durante 1 hora a 37C Para bloquear la unin del receptor CD47 a su ligando SIRP alpha en macrfagos, se agregar anti-CD47 durante 20 min a 4C a las dos subpoblaciones estudiadas. Para determinar el indice de fagocitosis, se dividir el nmero de clulas positivas para CMFDA entre el nmero total de clulas adquiridas. El anlisis de citometra de flujo se realizar con programa FlowJo versin 7.6.1.

6. BIBLIOGRAFA

1. Lawrence Donald W, King Sarah B, Frazier William A y Koenig Joyce M. 2009. Decreased CD47 expression during spontaneous apoptosis targets Neutrophils for Phagocytosis by Monocyte-derived Macrophages. Early Hum Dev. 85(10):659-663. 2. Li Zhuqinq, Calzada Mara J, Sipes John M, Cashel Jo Anne, Krutzsch Henry C, Annis Douglas S, Mosher Deane F y David Roberts. 2002. Interactions of thrombospondins with 41 integrin and CD47 differentially modulate T cell behavior. The Journal of Cell Biology, Vol 157, No 3: 509519. 3. Jaiswal Siddhartha, Jamieson Catriona H.M., Pang Wendy W, Park Christopher Y, Chao Mark P, Majeti Ravindra, Traver David, Van Rooijen Nico y Irving Weissman. 2009. CD47 is upregulated on circulating hematopoietic stem cells and leukemia cells to avoid phagocytosis. Cell 138, 271-285. 4. Ferlay J et al., 2008 Cul es la cita completa? 5. Grimsley C y K.S. Ravichandran. 2003. Cues for apototic cell engulfment: eat-me, dont eat me and come and get me sinals. Trends in Cell Biology. 13(12): 648-656.

6. BIBLIOGRAFA.
6. Chao Mark P, Alizadeh Ash A, Tang Chad, Jan Max, Weissman-Tsukamoto Rachel, Zhao Feifei, Park Christopher Y, Weissman Irving L y Ravindra Majeti. 2011. Therapeutic antibody targeting of CD47 eliminates human acute lymphoblastic leukemia. Cancer Res 71(4): 1374-1384. 7. Motegi Sei-chiro, Okazawa Hideki, Ohnishi Hiroshi, Sato Ryuji, Kaneko Yoriaki, Kobayashi Hisae, Tomizawa Kyoko, Ito Tomakazu, Honma Nakayuki, Jorg Buhring Hans, Ishikawa Osamu y Takeshi Matozaki. 2003. Role of the CD47SHPS-1 system in regulation of cell migration. The EMBO Journal 22: 2634-2644. 8. www.springerimages.com

ACTVIDAD
Recoleccin y clasificacin de muestras. Creacin de base de datos clnicos. Ensayos de estandarizacin de tincin celular. Determinacin fenotpica de la expresin del receptor CD47 en Las subpoblaciones estudiadas.

Estandarizacin del modelo in vitro de evaluacin de la fagocito-sis en co-cultivos celulares.

Evaluacin de la fagocitosis en el modelo in vitro en los distintos Grupos de sujetos estudiados. Evaluacin de la inhibicin de la Unin del receptor CD47 a su ligando en macrfagos homlogos Determinacin de las posibles correlaciones clnico-patolgicas Con la expresin del receptor CD47.
Anlisis de resultados final. Redaccin de tesis. Envo articulo de investigacin. Preparacin de examen de grado.