PCR (Polymerase Chain Reaction)

Principios y aplicaciones

Principales aplicaciones del PCR

Las aplicaciones de la PCR y sus numerosas variantes son prcticamente ilimitadas:

Simplifica muchos experimentos de ingeniera gentica. Permite muchos estudios de expresin gentica. Secuenciacin directa de secuencias amplificadas. Deteccin de mutaciones. Seguimiento de la efectividad de tratamiento de enfermedades. Diagnsticos de enfermedades genticas e infecciosas. En ciencia forense: identificacin de restos biolgicos, determinacin de paternidad, pruebas periciales en criminalstica. En arqueologa y paleontologa.

La familia Romanov

Fotografa por la Levitsky Company de la ltima familia imperial rusa. De izquierda a derecha: Olga, Mara, Nicols II, Alejandra Romanova, Anastasia, Alexis y Tatiana. Livadia, 1913.

Anna Anderson

Gran Duquesa Anastasia de Rusia, Anastasia Nikolyevna Romnova

Cmo se amplificaban genes antes del PCR?

Hasta mediados de la dcada de 1980, la nica estrategia posible para aislar un gen y obtener grandes cantidades del mismo en estado puro era el "clonado molecular". Este mtodo se basa en la introduccin de fragmentos de ADN, uno de los cuales contendr el gen de inters, en vectores. stos son molculas de ADN (plsmidos o ADN de bacterifagos) capaces tanto de transportar fragmentos ajenos a su estructura original como de multiplicarlos dentro de bacterias. Si se conoce un pequeo tramo de la secuencia de aminocidos de una protena cuyo gen se desea "clonar" (multiplicar), se pueden disear mtodos para identificar qu bacterias llevan el vector que transporta dicho gen. Este reconocimiento tambin se puede realizar si se dispone de un anticuerpo contra la protena resultante del gen que se desea clonar. En este caso se reconoce la bacteria portadora porque fabrica la protena codificada por el fragmento de inters, la cual se une especficamente al anticuerpo.

Una vez aislado el gen no slo resulta posible determinar con exactitud su secuencia de bases o analizar en detalle la informacin de la que es portador, sino que tambin se puede estudiar su expresin (la manera en que dirige la sntesis de la protena correspondiente) en distintos organismos y tipos celulares, introducido en clulas en cultivo o en animales de experimentacin, etctera. Estas tcnicas, ya clsicas, han permitido el aislamiento y caracterizacin de decenas de miles de genes de microorganismos, animales y plantas, lo que provoc un cambio cualitativo en la comprensin del funcionamiento de la clula.

PCR (Polymerase Chain Reaction)

La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (Polymerase Chain Reaction), es una tcnica de biologa molecular descrita y desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuando el trabajaba en la compaa CETUS. El objetivo del PCR es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN y ADNc (ADN complementario) particular, partiendo de un mnimo de ADN; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original o molde.

Kary Mullis (1944)

Primera compaa biotecnolgica, fundada en 1971, en California.

Thermophilus aquaticus o Thermus aquaticus

Escherichia coli

Taq polimerasa
Thermus aquaticus, denominada tambin Thermophilus aquaticus, es una bacteria termfila que vive en la proximidad de las fuentes de agua caliente. La Thermus aquaticus fue descrita por Thomas Brock en 1969 en una fuente del Parque Nacional de Yellowstone. Es una bacteria gramnegativa, aerobia y hetertrofa. Esta bacteria vive a temperaturas comprendidas entre 50 y 80 C, debido a que su cctel enzimtico resiste tales condiciones. Normalmente, a esas temperaturas, las protenas constitutivas de la mayora de los seres vivos se desnaturalizan y no vuelven a ser funcionales. Es por ello por lo que la enzima que Thermus aquaticus emplea para la replicacin del ADN, la Taq ADN polimerasa, es ampliamente utilizada por sus propiedades de termorresistencia en las reacciones de PCR. En la PCR se separan las cadenas de la doble hlice del ADN mediante desnaturalizacin trmica a temperaturas en torno a los 95C, lo que redundara en la inutilizacin de ADN polimerasas ordinarias. En efecto, esta enzima tiene una temperatura ptima de funcionamiento de 72 C, y su termoestabilidad es tal que su vida media a 95C es de 40 minutos, lo que la hace idnea para este tipo de procesos.

La enzima Taq polimerasa fue aislada de la bacteria Thermus aquaticus en 1976.

Oligonucletidos o primers

Criterios para la seleccin de primers

Termociclador
El termociclador es el aparato que permite llevar a cabo de forma automtica y reproducible la sucesin de ciclos de temperatura necesarios para la PCR. Los primeros termocicladores eran robots que movan una gradilla de tubos entre varios baos termostticos a tiempos preestablecidos. Los actuales constan, bsicamente, de un bloque de metal que puede ser calentado o enfriado, con posibilidad de programar las temperaturas y los tiempos. Existen multitud de termocicladores en el mercado, aunque las caractersticas principales son las siguientes: Constan de un bloque trmico, cuyo calentamiento y enfriamiento se produce a gran velocidad, gracias al denominado sistema Peltier. Las rampas de subida y bajada de temperatura son importantes para trasladar los protocolos entre termocicladores, y uno de los factores de falta de reproducibilidad, lo que hace que deban ajustarse de nuevo las condiciones de tiempos y temperaturas.

Actualmente, estn diseados mayoritariamente para tubos de 0,2 ml aunque an existen tambin para 0,5 ml. Es importante el perfecto ajuste del tubo en el bloque. Por ello, se recomienda utilizar los de la misma marca que el fabricante. El rango de temperaturas suele abarcar de 4C a 110C, aunque el rango habitual debe ser de 15C a 95C. No debe sobrecargarse al aparato con temperaturas extremas para prolongar su supervivencia. Los 4C se utilizan para refrigerar muestras tras una PCR, pero 15C tambin es una temperatura apta para ello. Respecto a llegar a 100C o ms, tampoco es aconsejable, al menos, de forma habitual. Es preferible emplear termobloques para llevar a cabo esta labor. Existen bloques que permiten ajustar distintas temperaturas en funcin de las zonas del mismo. Se dice que tienen funcin gradiente. Son muy tiles cuando se realiza ajuste continuo de programas de PCR, especialmente de temperaturas de hibridacin, o cuando se necesitan realizar diversos protocolos de forma simultnea. Tapa trmica: los ms antiguos no la poseen, pero es un elemento indispensable para evitar la evaporacin de la muestra, al contactar totalmente con la tapa del tubo. Software para programacin de tiempos y temperaturas: se denomina programa a cada conjunto de datos trmicos y temporales de un protocolo de PCR. Cada termociclador tiene su propio software. Puede ajustarse tambin la velocidad de subida y bajada de temperaturas, es decir, las rampas.

Bromuro de etidio

Tipos de PCR
PCR anidada Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es muy especfica. PCR in situ La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR in situ se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequesimas de genoma. Esta tecnologa es de gran alcance en la capacidad de amplificar especficamente una poblacin de secuencias de menor representacin. PCR mltiplex PCR en la cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin. Emplea dos o ms pares de cebadores en un nico tubo con el fin de amplificar simultneamente mltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una nica reaccin todos pares de cebadores de los sistemas que queremos amplificar simultneamente, junto con el resto de los reactivos de la reaccin en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la informacin de varios loci en una sola reaccin, menor cantidad de molde para el anlisis, menor cantidad de reactivos, rpida construccin de base de datos.

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la sntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sera: 1er paso: retrotranscripcin a partir del ARN. 2 paso: aplificacin a partir de la primera hebra de ADNc. 3er paso: PCR estndar.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)

Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN especficas a partir de su temperatura de fusin (tambin denominado valor Tm, del ingls melting temperature). Se puede dividir en las tcnicas basadas en fluorocromos no especficos y en las tcnicas basadas en sondas especficas. En las tcnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar slo una secuencia por reaccin pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realizacin. Es mucho ms econmica que la que usa sondas especficas. Las tcnicas basadas en sondas especficas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); cuando la sonda est intacta, presenta una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda est daada y los dos fluorocromos estn distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrn de fluorescencia y deducir el nivel de amplificacin del gen. La mayora de estos inconvenientes se han solucionado con la introduccin de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresin de la amplificacin en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulacin del ADN al final de un nmero predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificacin usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar fcilmente usando un sistema que realice la amplificacin (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayora pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las condiciones de amplificacin y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos determinados.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)