Materiales y métodos

Descripción del sitio y programa de muestreo

Trata un volumen
Clima de 25.000 m3 / día
mediterráneo
Recibe agua
Capacidad total Aguas
Sistema de lagunas de la salida
teórica de residuales
secundaria
24.087 m3 crudas
de una EDAR
Aprox. 200.000
habitantes.
Muestreo
Desde la salida secundaria
Septiembre Agosto Al salir de los estanques
2L por de la EDAR al entrar en el
2012 meses 2013 de estabilización
sistema de laguna

500 FIB, Aeromonas spp.

mL y Arcobacter spp
500 HBC, Legionella spp. y
mL amebas de vida
Análisis viral
Concentración viral y extracción de ácidos nucleicos

Los virus presentes en muestras de 1 L se concentraron usando floculación orgánica de leche desnatada.

control (-)
Eficiencia de recuperación de agua del grifo como
aproximadamente el 50% matriz y cloro
neutralizado

Para extraer ácidos nucleicos virales, se procesaron 140 μL de concentrados virales utilizando

control (-)
agua molecular
QIAamp® Viral RNA Mini Kit sin DNAse / el sistema QIACube automatizado
RNAse
 Ensayos de PCR cuantitativos y anidados para evaluar los virus

Se analizaron Determinar la presencia Marcadores de virales fecales y Ensayos especıficos de

muestras y[] otros virus patógenos qPCR

HAdV JCPyV

Controles (+)
suspensiones de ADN
Cuantificar los niveles de Detector de secuencia
plasmídico como y
genomas virales qPCR MX3000Pro
estándares
cuantitativos

ADN polimerasa
La transcripción inversa del kit de RT-PCR de un solo PCR semi-
AmpliTaq ™
ARN extraído paso anidada
Gold
Ensayos de infectividad en HAdV utilizando el método ICC-qPCR

Células de riñón > número de copias

embrionario humano HEK Se infectaron genómicas virales de
293A las células HAdV
Medio de
Eagle mod.
Muestras

Secuenciación directa con:

un ciclo ABI PRISM ™
Purificación Terminator Dye
kit QIAamp Viral Analizaron usando una Purificación Sequencing Ready Reaction
RNA mini PCR anidada PCR QIAquick kit versión 3.1 con
AmpliTaq® DNA polimerasa
Se compararon las secuencias con el GenBank y la FS
Biblioteca Europea de Biología Molecular (EMBL)
mediante BLAST
Análisis de bacterias y protozoarios

-Cuantificación de bacterias heterotróficas

De acuerdo con la Organización Internacional de Normalización, siguiendo los estándares para la calidad del agua.

-FIB
Utilizando MPN de microplaca de 96 pocillos según los métodos de la Organización Internacional de Normalización

-Detección y cuantificación de Arcobacter

De acuerdo con el método MPN utilizando cinco tubos de replicación
Los valores de MPN se calcularon utilizando el software MPN Build 23

-Detección y cuantificación de Aeromonas

Ocho colonias amarillas
De acuerdo con el presumibles se subcultivaron en
método MPN utilizando TSA y se incubaron en PCR
cinco tubos replicados condiciones idénticas.
Legionella spp. Cultura y tipificación

Tal como se describe en Organización International para la Estandarización

Legionella spp. Extracción de ADN y análisis qPCR

Kit de purificación de
ADN genómico Wizard

Cuantificación de amebas de vida libre

Centrifugación - cultivo en placas de agar no nutritivo (NNA) de

acuerdo con el método MPN