Espectrofotometría

y
Curva estándar
Radiación electromagnética
• Es una forma de energía
radiante con naturaleza dual,
que presenta propiedades
tanto de onda como de
partícula.
• Con componente eléctrica y
componente magnética, que
son perpendiculares, pero
sólo la componente eléctrica
interacciona comúnmente
con la materia.
Región visible
ESPECTROFOTOMETRÍA
ESPECTRO VISIBLE
ESPECTROFOTOMETRÍA
La interacción de la Energía con la
materia puede provocar que se Absorba,
debido a que los cambios y transiciones
electrónicas, vibracionales y rotacionales.
Se reemite al regresar la molécula a su
estado fundamental.

La absorcion de luz depende de cada

sustancia (absortividad molar = a)
ESPECTROFOTOMETRÍA
Es la medida de la cantidad de energía radiante absorbida
por las moléculas de una muestra en
función de las longitudes de onda específicas.

Los métodos espectroscópicos se basan en la capacidad de las

sustancias de ABSORBER o EMITIR radiación
electromagnética, y tales métodos se pueden emplear para
determinar la concentración de un reactivo o producto
durante una reacción.
 ESPECTROFOTOMETRÍA

Fuente de luz

Se puede hablar de la cantidad de energía absorbida (Absorbancia=A)

o de cantidad de energía transmitida (Transmitancia=T) por una
muestra problema .
Si la muestra absorbe mucha (A ↑ ↑ ↑) , transmite poca (T ↓)
Si la muestra absorbe poca (A ↓ ) transmite mucha (T ↑ ↑ ↑)
Es decir la energía absorbida y la transmitida guardan una relación
inversa (logarítmica)
 ESPECTROFOTOMETRÍA
La Transmitancia y Absorbancia se relacionan así:
-log T = A

Transmitancia: se expresa en porciento %T

La absorbancia es adimensional

Radiación
Incidente
Ley de Lambert
 La transmitancia decrece en
forma exponencial a medida
que aumenta la trayectoria
recorrida (hay más moléculas
de la solución que pueden
absorber la radiación)

-log T = ab

b= camino óptico, ancho de celda

T
La absorbancia (A)
aumenta si el ancho de
la celda aumenta A
Ley de Beer

• La transmitancia decrece en forma

exponencial a medida que aumenta la
concentración de la solución
La absorbancia (A)
aumenta si la
• -log T = ac concentración de
la muestra
• c = concentración aumenta

A
 Ley de Lambert y Beer
• A = abc

a = absortividad molar, característica constante de cada material a

una determinada longitud de onda. (coeficiente de extinción)

b= ancho de la celda

c= concentración del absorbente (muestra problema)

“
La absorción (A) es directamente proporcional a la
concentración del absorbente y la longitud del trayecto
recorrido por la energía radiante”

En nuestros experimentos:

La absortividad (a) y el ancho de la celda (b) son constantes por lo que la

absorción sólo va a depender de la concentración de la muestra problema
ESPECTROFOTÓMETRO
• Aparato que se emplea en el estudio de la absorción o
emisión de la radiación electromagnética en función
de la longitud de onda.
ESPECTROFOTÓMETRO
Componentes
 MONOCROMADOR
 Se utiliza para seleccionar la  , obteniéndose luz monocromática y puede ser un
prisma o una rejilla

Colimador
• DETECTOR
• Transforma la energía luminosa (fotones) fotocelda o
fotomultiplicador
ESPECTROFOTÓMETRO
• MEDIDOR
• Mide la corriente eléctrica generada en la fotocelda y la
traduce a una escala de % T y absorbancia
 Manejo espectrofotométro Genesys 20
a
a. Encender el equipo 10
minutos antes de iniciar b
lecturas.
b. Seleccionar longitud de onda.
c. Introducir el blanco y ajustar
a cero de absorbancia.
d. Retirar blanco y realizar
lecturas de curva estándar y
muestras problema.
d
c
 Curva estándar
• Con ayuda de un espectrofotómetro se hacen determinaciones de
absorbancia/transmitancia con una solución patrón para generar
una gráfica que nos permite medir la concentración de una
sustancia problema

Concentración glucosa en sangre

de un paciente
(Rango normal 70-120
mg/100mL)
Conc.
 Curva Estándar: condiciones
requeridas
Conocer la [ ] aproximada de la sustancia/compuesto problema
(albúmina)
Contar con una sustancia patrón
Determinar un intervalo de [patrón] para generar la curva
estándar
Elegir por lo menos 4 [ ] distintas del patrón
Si es necesario hacer diluciones del problema
Preparar un blanco de reactivos (contiene todos los reactivos pero
no la sustancia problema)
El volumen final de todos los tubos deberá ser el mismo
Realizar la curva por duplicado
Curva estándar
• Determinaciones de absorbancia con una solución patrón (una sustancia
de composición y concentración conocida) para generar una gráfica que
nos permite medir la concentración de una sustancia problema
Obteniendo la
Absorbancia de una
muestra problema, la
A
interpolo en la curva
Elegir por lo menos 4 [ ] estándar y
distintas del patrón obtengo su [ ] !!!!!

0 1 2 3 4 5 6
Conc.
 Método de Lowry
Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol.
Chem. 193: 265. 1951
• El color producido por el método de Lowry resulta
de la reacción de Biuret sobre los enlaces peptídicos,
además de la reducción del reactivo de
fosfomolibdato-fosfotungstato (Folin-Ciocalteu) por
las proteínas pretratadas con cobre en medio alcalino.
• El Cu+ y los grupos R de la tirosina, triptofano y
cisteína reaccionan con el reactivo de Folin,
produciendo un producto inestable que es reducido a
azul de molibdeno/tungsteno.
• El color azul, es determinado a 650 nm.
• Este es un método muy sensible, por lo que permite
trabajar con soluciones muy diluídas de proteínas
(0.02 - 0.5 mg proteína/ml).
 Para cuantificar la concentración de
albumina en la clara de huevo
necesitamos…..

Gramos vs Miligramos
Lípidos vs albúmina
 Método
Tubo Bco 1 2 3 4 6 7 8

Solución problema
proteínas (ml) _
Método _ _ _ _

Solución patrón
proteínas (ml) _ _ _ _
0.1 0.2 0.4 0.8

H2O destilada
2.0
Reactivo 3
1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

Agitar y dejar reposar 10 min

Reactivo 4
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1

Agitar y dejar reposar 20 min

Aplicación
Se determino la concentración de proteínas en 0.5
mL de muestra de suero al cual se le adicionaron 4.5
mL de solución salina, posteriormente se tomaron 0.5
mL y se aforaron a 50mL, se utilizo como estándar
albúmina a una concentración de 10 mg/100 mL, con
los siguientes datos realice la curva de calibración y
compare la concentración obtenida con el dato teórico
de 6.5 g/100 mL.
Estándar 0.1 0.2 0.3 0.6 0.8    
(mL)
Problema - - - - - 0.7 0.75
(mL)
Absorbancia 0.10 0.21 0.32 0.65 0.92 0.53 0.43
 1. Elaborar curva estándar
Concentración del estándar de albúmina 10 mg/100 mL
10mg 100mL Concentración (mg) abs

X 0.1mL 0 0

0.01 0.10

0.02 0.21

0.03 0.32

0.06

0.08
2. Curva estándar (2)
Abs =m C
3. Calcular C muestras problema
Abs= m C
0.53/11.175= 0.047 mg
Para expresar en concentración mg/mL
0.047mg 0.7mL
X 1mL
0.067 mg/mL X 1000 = 67 mg/1mL
Dilución FD= Vt/Vm
FD1=5 /0.5= 10 FD2=50 /0.5= 100 FDf= 1000
4. Comparar con el valor teórico
Valor de referencia 6.5 g/100 mL
Valor obtenido 67 mg/mL
Dividir entre 1000 = 0.067 g/mL y multiplicar por 100
6.7 g/100 mL
 Actividad
http://biomodel.uah.es/lab/abs/ensayo.htm