Amplificación de los acidos nucleicos

Claudia Patricia Jaimes Bernal

2021
KARY B. MULLIS

• Nació en diciembre 28, 1944 en Lenoir, North

Carolina, United States
• Campos de trabajo: Biología molecular
• Conocido por: Reacción en cadena de la
polimerasa
• Ganó el premio nobel en Química (1993)
http://www.karymullis.com/
DEFINICIÓN

 Método IN VITRO
 Síntesis enzimática
de secuencias de
ADN (cualquier
origen)
 Amplificación
exponencial de una
secuencia de ADN
conocida.
BASES TEORICAS
 ADN a amplificar
delimitado pro dos
fragmentos cortos de ADN
o cebadores.

 Cebadores
complementarios

 Cada ciclo duplica el

número de copias de la
secuencia deseada,
respecto al ciclo anterior.
 APLICACIONES DE LA PCR

 Diagnóstico y seguimiento de enfermedades

genéticas y cáncer
 Detección rápida de bajas cantidades de
microorganismos y virus
 Tipificación de HLA en trasplantes
 Análisis de ADN en laboratorios forenses
por huellas genómicas
 Análisis de material genético antiguo o
archivado
 Generación de sondas de ácidos nucleicos
 Clonación de genes
 Mapeo de genes
 Secuenciación
Etapas

 Extracción y purificación de los

ácidos nucleicos
 Amplificación de un segmento
seleccionado del genoma mediante
PCR
 Detección de los fragmentos
amplificados en la PCR
(amplicones)
PCR: PROCESO

http://universe-review.ca/I11-50-PCR.jpg
 PASOS EN LA PCR

Prieto Solla, L. Estudio de polirmorfismos de ADN en restos humanos antiguos y muestras forenses criticas.
 PASOS EN LA PCR

http://www.mun.ca/biology/scarr/PCR_sketch_3.gif
 DENATURACION

90ºC a 95ºC >GC > Temperatura 30 – 60seg

http://www.enigmadiagnostics.com/template2.php?page=technology.php&m=2
 ALINEAMIENTO

40ºC a 60ºC Temperatura melting 30 – 60 seg

http://www.enigmadiagnostics.com/template2.php?page=technology.php&m=2
 EXTENSION

70ºC a 75ºC 5’ 3’ Tiempo depende tamaño

http://www.enigmadiagnostics.com/ufiles/PCRstep3.gif
 CICLOS

Prieto Solla, L. Estudio de polirmorfismos de ADN en restos humanos antiguos y muestras forenses criticas.
 CICLOS

20 a 35 ciclos

http://www.obgynacademy.com/basicsciences/fetology/genetics/images/pcr.png
GABINETE para PCR
EQUIPOS para PCR

Early model of a Polymerase

Chain Reaction machin
("Gene Machine"), featuring
three constant temperature
baths and a robotic action
that moves samples
between the baths.

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Primitive_PCR_machine_for_scrap.JPG
TERMOCICLADOR

http://www.biomol.com.br/Imagens/Fotos/%7B3v1wk824kq55s6p2b87yqnw82h8w9l%7D_Termociclador.JPG
TERMOCICLADOR
Ingredientes de la PCR
ADN MOLDE (TEMPLATE)
 PRIMERS (cebadores)

20 a 30 nucleótidos

[ ] 0.1 y 0.5 µM

Tm = 4(G+C) + 2(A+T)

http://campus.queens.edu/faculty/jannr/Genetics/images/dnatech/FG12_11aPCRprimer.JPG
dNTPs

[ ] 200 µM concentración
final de cada dNTP en la
reacción – Vol Rx: 25 µl
TAQ DNA POLYMERASE

1 a 2 Unidades Vf: 25µl

A thermostable (75-800C)
DNA polymerase  from hot
springs and hydrothermal
vents bacteria Thermus
aquaticus.
http://www.neb.com/nebecomm/products/productF-530.asp
ADN POLIMERASAS TERMOESTABLES

http://www.ufrgs.br/depbiot/blaber/section5/section5.htm
Magnesio

 Cofactor de la enzima Taq Polimerasa

 [ ] 0.5mM hasta 5mM
BUFFER

Buffer para PCR puede contener:

 10 mM Tris, pH 8.3
 50 mM KCl
 1.5 mM MgCl2
 0.01% gelatin
TUBOS PARA PCR

http://en.wikipedia.org/wiki/File:PCR_tubes.png
Master Mix (Mmix)
Variantes de la PCR

 PCR con transcriptasa reversa

 PCR multiple
 PCR anidada
 PCR en tiempo real
RT-PCR

http://www.ma.uni-heidelberg.de/inst/ikc/molekularbiologie/rt-pcr.jpg
PCR anidada

http://www.elsevier.es/imatges/305/305v12n03/grande/305v12n03-90227012fig3.jpg
PCR – TIEMPO REAL

http://genomictree.com/wp/wp-content/uploads/2015/12/Real-Time-PCR1en.jpg
DETECCION DE PRODUCTOS PCR
ELECTROFORESIS

Ethidium bromide
 CONTROL DE CALIDAD DE LA PCR

 Minimizar las fuentes de

contaminación cruzada y
definir estrategias que ayuden
a identificarlas

 Control positivo

 Control negativo
 Control interno
PCR products of HCV RNA runned on 2% agarose gel.
From right to left we have negative control, 4 positive
patients' samples and two negative patients' samples as well
as positive control and DNA ladder 100bp.
http://hepmon.com/view/?id=93
VIDEOS

 Clonación de ADN https://www.youtube.com/watch?v=xxL5JQQg_fI

 Microarrays
https://www.youtube.com/watch?v=itZq0DMk404

 Hibridación de acidos nucleicos

https://www.youtube.com/watch?v=h5fFMxHIaOc

 Secuenciación de tercera generación

https://www.youtube.com/watch?v=hdQY9REu6k0