Epítopes: Regiones del Antígeno que

Interactúan con los Anticuerpos

 Bloqueo uniones
inespecíficas 1 Anticuerpo

lavados
E E
E E E
E

E E
E
revelado lavados 2 Anticuerpo
E E E E
E E

E
(sustrato)
ELISA (Ensayo por inmunoabsorción
ligado a enzimas )
Se refiere a una variedad de ensayos que se basan
en la unión antígeno-anticuerpo y la detección de
esta interacción usando un componente conjugado
con una enzima.

La enzima actúa sobre su sustrato para producir un

cambio de color el que puede ser medido.

Variantes de ELISA
Indirecto
Sandwich
Competencia
 PLACAS DE ELISA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B

FORMATO DE 96 POCILLOS
POCILLO PLACA DE ELISA
VOLUMEN 250 ul
1. Agregar Antígeno a la placa.

2. Parte del antígeno se une a la placa.

3. Se elimina el antígeno no unido.

4. Agregar solución de bloqueo.

5. La placa Elisa se bloquea completamente

6. Agregar muestra con ANTICUERPOS.

1. Agregar Antígeno a la placa.

2. Parte del antígeno se une a la placa.

3. Se elimina el antígeno no unido.

4. Agregar solución de bloqueo.

5. La placa Elisa se bloquea completamente

6. Agregar muestra con ANTICUERPOS.

1. Agregar Antígeno a la placa.

2. Parte del antígeno se une a la placa.

3. Se elimina el antígeno no unido.

4. Agregar solución de bloqueo.

5. La placa Elisa se bloquea completamente

6. Agregar muestra con ANTICUERPOS.

1. Agregar Antígeno a la placa.

2. Parte del antígeno se une a la placa.

3. Se elimina el antígeno no unido.

4. Agregar solución de bloqueo.

5. La placa Elisa se bloquea completamente

6. Agregar muestra con ANTICUERPOS.

Bloqueantes
1. Agregar Antígeno a la placa.

2. Parte del antígeno se une a la placa.

3. Se elimina el antígeno no unido.

4. Agregar solución de bloqueo.

5. La placa Elisa se bloquea completamente

6. Agregar muestra con ANTICUERPOS.

1. Agregar Antígeno a la placa.

2. Parte del antígeno se une a la placa.

3. Se elimina el antígeno no unido.

4. Agregar solución de bloqueo.

5. La placa Elisa se bloquea completamente

6. Agregar muestra con ANTICUERPOS.

7. Los ANTICUERPOS especificos se unen
al Antígeno correspondiente.Eliminando
los anticuerpos no especificos mediante
lavados

8. Agregar segundo ANTICUERPO

conjugado a una ENZIMA (anti-Ig).

9. Lavar la placa para eliminar los

anticuerpos conjugados no unidos a la
placa.

10. Agregar solución de revelado o

SUSTRATO especifico para la enzima
utilizada.

11. Esperar el desarrollo de color, producto

de la trasnformción del sustrato por
acción de la enzima.

12. Leer la densidad óptica de cada pocillo.

7. Los ANTICUERPOS especificos se unen
al Antígeno correspondiente.Eliminando
los anticuerpos no especificos mediante
lavados

8. Agregar segundo ANTICUERPO

conjugado a una ENZIMA (anti-Ig).

9. Lavar la placa para eliminar los

anticuerpos conjugados no unidos a la
placa.

10. Agregar solución de revelado o

SUSTRATO especifico para la enzima
utilizada.

11. Esperar el desarrollo de color, producto

de la trasnformción del sustrato por
acción de la enzima.

12. Leer la densidad óptica de cada pocillo.

7. Los ANTICUERPOS especificos se unen
al Antígeno correspondiente.Eliminando
los anticuerpos no especificos mediante
lavados

8. Agregar segundo ANTICUERPO

conjugado a una ENZIMA (anti-Ig).

9. Lavar la placa para eliminar los

anticuerpos conjugados no unidos a la
placa.

10. Agregar solución de revelado o

SUSTRATO especifico para la enzima
utilizada.

11. Esperar el desarrollo de color, producto

de la trasnformción del sustrato por
acción de la enzima.

12. Leer la densidad óptica de cada pocillo.

7. Los ANTICUERPOS especificos se unen
al Antígeno correspondiente.Eliminando
los anticuerpos no especificos mediante
lavados

8. Agregar segundo ANTICUERPO

conjugado a una ENZIMA (anti-Ig).

9. Lavar la placa para eliminar los

anticuerpos conjugados no unidos a la
placa.

10. Agregar solución de revelado o

SUSTRATO especifico para la enzima
utilizada.

11. Esperar el desarrollo de color, producto

de la trasnformción del sustrato por
acción de la enzima.

12. Leer la densidad óptica de cada pocillo.

7. Los ANTICUERPOS especificos se unen
al Antígeno correspondiente.Eliminando
los anticuerpos no especificos mediante
lavados

8. Agregar segundo ANTICUERPO

conjugado a una ENZIMA (anti-Ig).

9. Lavar la placa para eliminar los

anticuerpos conjugados no unidos a la
placa.

10. Agregar solución de revelado o

SUSTRATO especifico para la enzima
utilizada.

11. Esperar el desarrollo de color, producto

de la trasnformación del sustrato por
acción de la enzima.

12. Leer la densidad óptica de cada pocillo.

7. Los ANTICUERPOS especificos se unen
al Antígeno correspondiente.Eliminando
los anticuerpos no especificos mediante
lavados

8. Agregar segundo ANTICUERPO

conjugado a una ENZIMA (anti-Ig).

9. Lavar la placa para eliminar los

anticuerpos conjugados no unidos a la
placa.

10. Agregar solución de revelado o

SUSTRATO especifico para la enzima
utilizada.

11. Esperar el desarrollo de color, producto

de la trasnformción del sustrato por
acción de la enzima.

12. Leer la densidad óptica de cada pocillo.

 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ELISA Sandwich
Prueba antígenos
- El ELISA sandwich mide la cantidad de antígeno entre 2
capas de anticuerpo ( anticuerpo de captura y detección).

- El antígeno a ser medido debe contener al menos 2 sitios

antigénicos capaces de unir el anticuerpo, dado que al
menos 2 anticuerpos interactúan en el sandwich.

Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ELISA Sandwich
Prueba antígenos

Agregar la muestra

Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ELISA Sandwich
Prueba antígenos

Add Specimen

Adapted from Kuby Immunology, 4th Edition

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
ELISA Sandwich
Prueba antígenos
 Competitive ELISA
A measured amount of known enzyme-labeled component
(being measured) is added to the reaction at the same time
patient sample is added.

The labeled component therefore competes against the

unlabeled component in the patient sample for binding sites.

Results Usa antígenos conjugados con

Negative Reaction has color change enzima, generalmente se pega el
Positive Reaction no color change anticuerpo a la placa

Suero paciente

Disminución intensidad color

 Componentes de los Kits de ELISA
Soporte de Fase Sólida
Antígenos son unidos a microplacas de poliestireno (absorción pasiva)
Se requiere bloqueo para reducir la unión no específica
Formato de 96 pocillos

Antígenos

Anticuerpos
Monoclonales de mayor título, afinidad y avidez

Conjugados
Ab conjugado con enzima (sin afectar el sitio de unión)

• Sustrato (cromogénico)
Cromógeno no coloreado reacciona con la enzima para producir color

Solución de Detención
Típicamente es un ácido, estabiliza el color por un tiempo determinado
 Ventajas del ELISA
Se suministra como kit

Fácil de Realizar

Usado para examinar un gran numero de

muestra

Sensible

Especifico
 Enzimas y sustratos
Requerimientos de la enzima

• Alta AE, tanto libre como conjugada.

• Buena disponibilidad.

• Estable.

• Presencia de grupos activos libres que permitan ser conjugadas.

• Uso de sustratos no tóxicos con formación de productos estables.

Requerimientos del sustrato

• Solubles en agua, no mutagénicos, no tóxicos.

• Deben producir productos coloreados (ensayos colorimétricos),

con un máximo de absorbancia entre 400 y 600 nm.

• Linealidad del producto con la concentración de enzima.

cut-off: nivel de discriminación positivos/negativos

media (controles normales) + 2 ó 3 desvíos estándar.

Cut-off

controles 900
800
700
600
500
400
300 Falsos positivos
200
100
0
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
DO
600
pacientes
incertidumbre

500

400

300

200 negativos Positivos

verdaderos
100

0
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7
DO
 Precisión de la curva dosis-respuesta.
• Análisis estadístico de la curva dosis-respuesta,
obtención de los parámetros:
 pendiente
 dosis mínima detectable
 rango lineal de dosis
 sensibilidad
 límite de detección etc.

DO ó
cpm Rango lineal

m=pendiente

Cut-off
Log [ ]
DMD
 SD
Coeficiente de variación (CV %): X 100
media
1. CV intraensayo
2. CV interensayo

Detectabilidad: Menor concentración de antígeno que genera una

respuesta significativamente distinta de la correspondiente a dosis cero.
Depende principalmente de la calidad del Ac

Sensibilidad: Mínima variación de concentración de analito capaz de

generar un cambio significativo en la respuesta (R). Depende
principalmente de la calidad del Ac.
Performance analítica
Sensibilidad
• Condicionada principalmente por la afinidad del Ac
Especificidad
• Dada por la reactividad cruzada con otros antígenos.

Precisión
• La fuente de variación intra e inter-ensayo puede deberse
a una adsorción no uniforme del Ag ó Ac a la fase sólida
durante los pasos de pegado (7-10% intra-ensayo).
 Criterios de validación
1. Estudios clínicos para demostrar que el ensayo es seguro y
efectivo para el uso diagnóstico

• Validación del cut-off.

• Sensibilidad clínica
Población claramente definida para el uso intencionado del kit.
Una clara descripción de cómo fue diagnosticada la enfermedad.
Deben ser incluidas formas consensuadas de diagnóstico.
Un protocolo que defina claramente los objetivos del estudio, criterios de
exclusión/inclusión y diseño del estudio.
El método debe ser testeado como mínimo en tres lugares geográficos
diferentes.

• Especificidad clínica
Población de pacientes con la patología en estudio o patologías similares.
Pacientes no enfermos.
 Criterios de validación
2. Estudios no clínicos
• Caracterización de los componentes/ Descripción del antígeno, anticuerpo.
Descripción de controles, estándares o calibradores.

• Límite de detección del ensayo

• Determinación de los valores de cutoff del ensayo.

• Reproducibilidad/precisión del ensayo: Reproducibilidad intra- e inter-ensayo y

entre lotes. Los estudios de reproducibilidad se realizan en centros
representativos.

• Reactividad cruzada: Deberían incluirse muestras de pacientes con patologías

similares (parásitos, virus o bacterias con características similares), o pacientes
con sintomatología similar.

• Interferencias con componentes endógenos (hemoglobina, lípidos, etc. o

componentes exógenos (anticoagulantes, temperatura, etc.).

• Estudios de estabilidad: en cuanto al almacenaje y envío.

 Actividades grupales

• De que manera diseñaría un ELISA indirecto para HIV.

• De que manera diseñaría un test de embarazo basado
en un ELISA que detecte hCG.
• De que manera diseñaría un ELISA competitivo para
detectar brucelosis (medir anticuerpos)
• Análisis de papers identificando tipo de ELISA, como se
determino el cut-off, que se usó como antígeno, que se
usó como muestra.
Paper 1
paper1
paper2
paper2