MODIFICACIÓN DE LA INGENIERÍA

METABÓLICA EN LAS VÍAS

RELACIONADAS
• Transporte de la glucosa;

Sistema de fosfotransferasa de la glucosa

(STP)

La eficiencia del transporte de la galactosa es menor que

la del STP debido a la baja expresión del gen galP.
Sistema de transporte de la galactosa
 El STP incluye 2 portadores centrales del grupo
fosfato, la enzima I (EI) y la proteína portadora de
fosforilo (HPr)

Consume grandes cantidades de

fosfoenolpiruvato (PEP), que es un precursor
importante en síntesis de L-triptófano; e
interrumpe la distribución del flujo metabólico
entre glicólisis y el TCA

Construir cepas con deficiencia de STP es una

estrategia muy utilizada para mejorar la
acumulación de PEP para mayor producción de L-
Triptófano.
Un efecto positivo de la sobreexpresión de un facilitador de glucosa y de la
glucoquinasa de Zymomonas mobilis podría restablecer la absorción de glucosa en
un mutante de E. coli con STP negativo.

Se construyó una cepa de producción de L-triptófano KW018 mediante la

sobreexpresión de glucoquinasa y galactosa permeasa para el transporte de
glucosa en una cepa con deficiencia de STP

Se aplicaron mutantes de HPr en el genoma para debilitar el STP.

Como resultado, el transporte de glucosa de todas las cepas mutantes se

redujeron relativamente.

Entre las cepas mutantes, E. coli FB04(pta1) pykF-ptsHN12S alcanzó una tasa de
conversión 38,0% mayor en comparación con la cepa madre
La vía común de los aminoácidos aromáticos y la vía
de la rama de L-triptófano
Estas rutas implicaban la
inhibición de una serie de
enzimas limitadoras de la
velocidad, principalmente
la sintasa DAHP y la sintasa
ANTA

Enzimas limitadoras de la velocidad que catalizan la PEP y la E4P para formar la DAHP, desempeña un papel
fundamental en la dirección del flujo de carbono de la vía metabólica central a la vía común.

La DAHP sintasa está compuesta por 3 isoenzimas, AroG, AroF y AroH. Cuyas actividades son inhibidas por
la L-fenilalanina, la L-tirosina y el L-triptófano.
Se ha dedicado una importante labor de investigación a la detección de las
isoenzimas reguladas por la retroalimentación de los AroG y los AroF para
eliminar la inhibición de la retroalimentación por los sustratos.

Dos mutantes de AroG, P150L y D146N, aliviaron completamente la

inhibición de la retroalimentación por la L-fenilalanina

El caso de AroF, los estudios han indicado que los mutantes N8K, P148L y
Q152I podrían eliminar la regulación de la retroalimentación por la L-
tirosina
La sintasa ANTA, otra importante
El problema de la inhibición de la Se obtuvo un mayor rendimiento
enzima limitadora de la velocidad,
retroalimentación, se abordó de L-triptófano en comparación
codificada por el gen trpED,
sustituyendo el residuo de 40 con el de la cepa madre mediante
cataliza la generación de
serinas por fenilalanina en la la sobreexpresión de la enzima
(Antranilato) ANTA, es inhibida
enzima TrpE. mutada
por el L-triptófano.

La sobreexpresión de enzimas
relacionadas con la vía común y la
vía de la rama L-triptófano
también desempeñan un papel
decisivo en la sobreproducción de
L-triptófano.

Sintasa ANTA
 El atenuador, una
En la vía de la rama L- Cuando el L-triptófano
secuencia de
triptófano los genes intracelular alcanza
nucleótidos de
estructurales, conocidos cierto nivel, la
segmento compuesta
como el operón conformación de la
por 162 nucleótidos
triptófano, es estructura secundaria
situados antes de los
responsable de la del atenuador cambia,
genes estructurales,
biosíntesis del L- impidiendo la
regula el operón
triptófano. transcripción.
triptófano

Li y otros
sobreexpresaron las
enzimas inhibidoras de
la retroalimentación de Al mismo tiempo se En una cepa se
AroG y TrpED para la añadió ANTA al medio introdujo un plásmido
biosíntesis de L- de fermentación, lo que de baja copia que
triptófano, lo que dio dio lugar a una contenía el triptófano
lugar a un rendimiento acumulación de L- operón (incluido el TrpE
de L-triptófano de triptófano de 6,2g/L inhibido por la
0,168g/L en la retroalimentación).
fermentación del
matraz de agitación.
 La L-serina es un sustrato
La 3-fosfoglicerato
terminal crucial en la vía de la
deshidrogenasa SerA codificada
biosíntesis del L-triptófano, el
por el gen serA desempeña un
aumento del nivel de L-serina
papel importante en la
es necesario para la producción
biosíntesis de L-serina.
de L-triptófano.

La sobreexpresión de AroG, el Se demostró que la

operador de triptófano completo y
el serA en un plásmido constitutivo
sobreexpresión del gen serA
y luego la introducción de este tenía un efecto evidente en la
plásmido en el huésped, sobreproducción de L-
finalmente obtuvo un rendimiento triptófano.
de L-triptófano de hasta 42g/L
El camino de la degradación
La triptofanasa TnaA
La biosíntesis del L- La tnaA cataliza la formación
codificada por el gen tnaA
triptófano siempre está de L-triptófano en presencia
juega un papel importante
regulada por la degradación de una alta concentración
en la degradación del L-
del L-triptófano. de amoníaco y piruvato.
triptófano.

La inactivación del TnaA se

Sólo tiene un efecto en la Se confirmó que la aplicó para construir una
degradación de L-triptófano inactivación del TnaA cepa de producción de L-
en el estado fisiológico facilitaba la biosíntesis del L- triptófano, lo que dio lugar a
normal de las células. triptófano. un aumento del rendimiento
de L-triptófano en 2,7 veces.
El camino de Pta-AckA En un sistema de fermentación con glucosa y bajo nivel de
oxígeno disuelto, es muy común la acumulación de acetato.

Desperdicia la fuente de carbono y reduce la tasa de

conversión, inhibiendo el crecimiento de las células y la
biosíntesis del L-triptófano.

Fosfato acetil transferasa

La reducción de la formación del acetato
tiene un efecto significativo en la
sobreproducción de L-triptófano. Para
reducirlo en la fermentación, el oxígeno
Acetatoquinasa
disuelto debe ser suficiente, pero
aumenta el costo de producción.

La ingeniería genética sería un

En E. coli, tanto la vía de la oxidasa PoxB como la vía de la Pta-AckA
método conveniente para reducir
intervienen en la formación de acetato, en la que esta última es la
la formación de acetato.
principal vía de formación de acetato.
 La cepa con deficiencia de AckA mostró
mejores propiedades fermentativas,
mostrando una reducción del 21,8% en el También se confirmó que la disminución de la vía
contenido de acetato y un aumento del Pta-AckA aumentaba el flujo metabólico de la vía
6,5% en la producción de L-triptófano en de biosíntesis del L-triptófano.
comparación con la cepa parental.

A diferencia de la interrupción de la vía de Pta-

La interrupción de la vía de Pta-AckA por la AckA, se empleó una vía de Pta-AckA debilitada,
inactivación de Pta es la manipulación dando lugar a un aumento del 15,5% del
genética más común empleada para reducir rendimiento de L-triptófano y una disminución del
la acumulación de acetato contenido de acetato.

Pta fue inactivado en la construcción de la Pero la vía de Pta-AckA está relacionada con el
cepa de producción de L-triptófano TRTH metabolismo fisiológico y el acetil fosfato es donante de
0709/pMEL03, disminuyendo en gran fósforo en la acetilación, la ausencia de Pta causó una
medida la formación de acetato. notable reducción del crecimiento celular.
 Regulación transcripcional por factores de regulación
Se basa en una influencia considerable en la expresión de los genes, que a su
vez puede afectar a la distribución de los flujos metabólicos en E. coli

Los resultados de la optimización del metabolismo del L-triptófano indicaron

que el flujo metabólico debilitado del ciclo del ATC y el aumento del
metabolismo de la vía pentosa fosfato, eran beneficiosos para aumentar la
biosíntesis del L-triptófano.

La proteína reguladora global Cra (FruR) afecta la vía metabólica central al

regular la transcripción de los genes que participan en el metabolismo del
carbono y la energía
 La inactivación de Cra puede aumentar la expresión de los genes implicados
en la vía de la pentosa fosfato y disminuir la expresión de los genes
implicados en el ciclo del ATC

El aumento del flujo metabólico de la vía de la pentosa fosfato puede

mejorar el suministro de NADPH, un cofactor crítico que participa en la
biosíntesis de L-triptófano

La inactivación de Cra mejoró el flujo metabólico de la biosíntesis de L-

triptófano, lo que condujo a un aumento del rendimiento de L-triptófano y
de la tasa de conversión del 62,5% y el 52,4%, respectivamente
El regulador CsrA, trabaja en el almacenamiento de carbono y participa en la
regulación del flujo metabólico. Se comprobó que la ausencia de CsrA podría
mejorar el flujo metabólico de la gluconeogénesis, contribuyendo a la
acumulación de PEP.

El silenciamiento de la CsrA por los ARNs artificiales tiene un importante efecto

promotor de la biosíntesis de la L-tirosina, mejorando así el rendimiento de la
L-tirosina en 1,2 veces en comparación con la cepa madre.
 El CsrB, un pequeño ARN no traducido, regulador de almacenamiento de carbono,
se sobreexpresó en E. coli KT1306 para mejorar la disponibilidad de PEP, lo que dio
lugar a un aumento evidente del rendimiento de L-triptófano del 7,5%

El regulador TyrR tiene un papel negativo en la biosíntesis de L-triptófano, porque

inhibe la transcripción de los genes implicados en la biosíntesis de los aminoácidos
aromáticos, que contienen el gen que codifica la sintasa DAHP, una enzima crítica
en la vía de la biosíntesis de L-triptófano

Las investigaciones han señalado que la inactivación de TyrR dio lugar a un notable
aumento de la actividad de la sintasa DAHP
 El TrpR, un represor codificado por un gen trpR situado aguas arriba del
operón triptófano, que regula la transcripción y la traducción del mismo.

Cuando el contenido de L-triptófano en las células alcanza un valor

determinado, la transcripción del operón se detiene debido a la inhibición
del represor TrpR.

Los estudios han demostrado que el desarrollo de las cepas de producción

de L-triptófano siempre va acompañado de la inactivación del TrpR

La atenuación es otro mecanismo regulador en la biosíntesis del triptófano, que se

logra mediante la región líder trpL situada aguas arriba de los genes trpE, D, C, B, A
En resumen, dos codones de triptófano están presentes previa a la región trpL,
haciendo sensible la traducción de L-triptófano. En un nivel alto de L-triptófano,
los ribosomas no se detienen, lo que lleva a la formación de la estructura de
terminación del ARNm. Sin embargo, cuando el nivel de L-triptófano es
inadecuado, polimerasa del ARN se detiene en la posición de los dos codones de
triptófano adyacentes, e impide la formación de la estructura de terminación de
la transcripción, y la transcripción del operón trpE, D, C, B y A continúa.
Adición de sustancias afines

Aiba y otros introdujeron un plásmido de baja copia, que expresaba las enzimas
del TrpD (inhibido por la retroalimentación) y TrpE en una cepa de trpR y tnaA
de doble deleción para el desarrollo de una cepa de producción de L-triptófano.

Para aumentar aún más la producción de L-triptófano, se

incorporó antranilato (ANTA) al medio de fermentación, lo que
dio lugar a una acumulación de L-triptófano de 6,2 g/L

Combinando la mutagénesis química con la adición de un

agente tensioactivo en el medio de fermentación, el
rendimiento final de L-triptófano llegó a ser de 54,5 g/L
Dado que la xilosa forma eritrosa 4 fosfato (E4P), se comprobó que la adición de
xilosa en el medio como cosustrato, aumentaba el suministro de E4P precursor
para la producción de L-triptófano.
 Indol y la L-serina son sustratos
importantes en biosíntesis de L-triptófano.

La suplementación con melaza de caña iraní, L-serina y

Tritón X-100 (indol) en el medio, mejoró la biosíntesis.

La adición de PL61 mejora de la producción de L-

triptófano, lo que conducía al valor de rendimiento más
alto (35,5 g/L) en un fermentador de 10 litros.

El glutamato se acumulaba en grandes

La sobreexpresión de la glutamina
cantidades, mientras que el contenido de
sintetasa mejoraría más la
glutamina, un sustrato crucial, se
producción de L-triptófano.
mantenía a un nivel relativamente bajo.