v = c/ E = hv

Diagrama de Jablonski

Conversión interna
S2
(10-12 s)

S1

(10-9 s-10-8 s)
Fluorescencia
Energía

Absorción
(10-15 s)

Nr

S0

Corrimiento de Stokes : emisión > absorción

 Diagrama de Jablonski

Conversión interna
S2
(10-12 s) Relajación del
solvente
S1 (10-10 s)
Energía

Absorción
(10-15 s)

S0

Corrimiento de Stokes : emisión > absorción

 Absorción

G
relajación térmica
relajación térmica

Fluorescencia
Propiedades fundamentales de la fluorescencia

(a) Principio de Frack-Condon: las transiciones son verticales (los núcleos no cambian
de posición en 10-15 s).

(c) La excitación es desde el nivel vibracional más bajo del estado basal hacia cualquier
nivel vibracional del estado excitado. La emisión es desde el menor nivel vibracional
del estado excitado hasta cualquier nivel vibracional del estado basal. La excitación
revela los estados vibracionales del estado excitado; la emisión los del estado basal.

(b) Si una transición es la más probable para la excitación, la recíproca lo será para la
emisión. Ej.: 0–2 (excitación), 0–2 (emisión). El espectro de emisión es una imagen
especular del de eexcitación.

(d) El espectro de emisión está corrido a menores energías respecto al de excitación

(corrimiento de Stokes).
Tiempos típicos de las interacciones entre la materia y la luz visible-UV

Absorción de fotones, 10-15 s

Vibración interatómica, 10-12 s

Conversión interna, relajación del solvente, 10-12–10-10 s

Emisión de fluorescencia 10 -10–10-9 s

Fosforescencia 10-3 s
Quantum yield
Tiempo de vida
Quenching the fluorescencia

Puede ser estático o dinámico

Resonance Energy Transfer
 FLUORÓFOROS INTRÍNSECOS
Triptofano es el fluoróforo
intrínseco dominante.

Trp es muy sensible al entorno.

Es posible ver cambios en los
espectros de emisión en respuesta
a cambios conformacionales,
asociación de subunidades, unión
de sustratos, desnaturalización y
cualquier cosa que afecte el
entorno local del anillo indol.

Trp es muy sensible a la

atenuación colisional, tanto por Trp puede ser excitado selectivamente a
grupos externos como por grupos 295 nm. (para evitar la excitación de la
vecinos, en la proteína. Tyr).
 Trp 48

Azurina 4AZU max= 308nm

Trp 48

Proteína G max= 342.5 nm

Trp 25

Glucagon 1GCN max 350.8 nm

 375
A

Flurescence (arbitrary units)

325

275

225

175

125

75

25
0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
[parinaric acid]/[YLSCP2]

225

B
Flurescence (arbitrary units)

200

175

150

125

100

75

50

25
0.0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0
[parinaric acid]/[IFABP]
 Fluoróforos extrínsecos
* et
_
(estable en
S1 ambiente polar)

(no polar)
S1 ct
+

Transferencia
electrónica fluorescencia
(ambiente
absorción polar)
fluorescencia
(no polar)

Variación en el
rendimiento
cuántico del ANS

S0 np
U ESβL9 (5 M GdmCl)  IP ESβL9  N ESβL9 (0.05 M GdmCl)

N-terminal

Esquema de la estructura de la
‑lactamasa. Se muestran las C-terminal
hélices C y N terminales.
Fluorescencia

Longitud de onda