The Oleaginous Yeast Meyerozyma

guilliermondii BI281A as a New

Potential Biodiesel Feedstock: Selection
and Lipid Production Optimization

PRESENTADO POR:
Charry Hernández arley
Becerra Aguirre Nalley Alejandra
Maya telles Jorge Andrés
Rengifo Gómez Andrés Felipe
 Resumen.

◎ Se realizo un estudio a una levadura oleaginosa “meyerosyma

guilliermondii” BI281A por medio de la evaluación del contenido de
lípidos celulares basado en lecturas de fluorescencia del rojo del Nilo.
La producción de lípidos de la cepa se optimizo usando glicerol puro
como fuente de carbono, donde la cepa demostró ser capaz de acumular
aceite, usando glicerol crudo de una refinería de biodiesel.  El perfil
lipídico mostró ácidos grasos monoinsaturados (MUFA) que varían
entre 56 o 74% en glicerol puro o crudo, respectivamente.
◎ la m.guilliermondii tiene potencial como nueva materia prima de
biodiesel.

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Introducción
a producción de biodiesel que emplea microorganismos oleaginosos es una
alternativa prometedora para superar los cuellos de botella críticos del biodiesel
de primera generación (Sitepu et al., 2014 ), que utiliza aceite vegetal como
materia prima y compite con la comida humana. Las levaduras son una fuente
prometedora de aceite microbiano (Poli et al., 2013 , 2014b ; Sitepu et
al., 2014 ), ya que estos microorganismos pueden acumular hasta el 70% de su
peso seco como lípidos (Angerbauer et al., 2008 ). 
Aunque varias levaduras oleaginosas se han descrito en la literatura como
posibles productores de aceite como materia prima para el biodiesel (Ageitos et
al., 2011 ; Duarte et al., 2013 ; Poli et al., 2013, 2014a ; Garay et al., 2016 ), la
producción de biocombustibles a partir del aceite de levadura aún no es una
realidad, principalmente debido al alto costo de la producción de aceite
microbiano. 

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A la luz de estas consideraciones, el objetivo principal
de este estudio fue seleccionar una nueva cepa de
levadura oleaginosa de una colección de cultivos
brasileños, capaz de acumular petróleo usando
glicerol crudo, un subproducto de refinerías de
biodiesel, como fuente de carbono. Una metodología
de detección de alto rendimiento (HTS) permitió la
evaluación exhaustiva de la capacidad de
acumulación de lípidos de las cepas de levadura y la
selección de una nueva levadura oleaginosa,
identificada como Meyerozyma
guilliermondii BI281A. Finalmente, las condiciones
de cultivo fueron optimizadas para mejorar su
producción de lípidos.

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 Metodología

◎ Microorganismos
Las cepas de levadura probadas se recuperaron de una colección de
cultivos de levadura ubicada en la Universidad Federal de Rio Grande
do Sul (Porto Alegre, Brasil, Tabla S1 ). Utilizamos Y. lipolytica QU21
como una cepa de referencia de levadura oleaginosa (Poli et
al., 2013 ). Se usó S. cerevisiae CBS 1171 como control negativo en los
experimentos. M. guilliermondii BI281A se identificó utilizando la
secuenciación molecular de la región ITS, según Ramirez-Castrillon et
al. ( 2014 ) (Número de acceso de Genbank: MF599409 ). La cepa se
depositó en la Colección de Microorganismos, ADN y Células de la
Universidad Federal de Minas Gerais (UFMG) bajo el código CM-
UFMG-Y6124.

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◎ Métodos de comunicación.
Medio GYP (10 g / L de extracto de levadura, 10 g / L de peptona, 20
g / L de glucosa) o medio YM (3 g / L de extracto de levadura, 3 g / L
de extracto de malta, 10 g / L de peptona y 20 g / L L glucosa) se
utilizaron para el pre-cultivo de las cepas. Los medios A, A-glicerol y
A-glicerol en bruto tenían la siguiente composición: 1 g / L
KH 2 PO 4 , 1 g / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 0,5 g / L MgCl2-6H 2 O, más 100
g / L de glucosa, 15% (v / v) de glicerol, o 15% (v / v) de glicerol
crudo, respectivamente. El glicerol crudo fue suministrado por una
fábrica de biodiesel a base de aceite (Canoas, Brasil), y contiene: (como
porcentaje en peso) 82.97% de glicerol, 10.62% de humedad, 5.72% de
NaCl, 0.75% de monoglicéridos y trazas de concentración de cenizas y
metanol residual.

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◎ Métodos de comunicación.
La metodología HTS se basó en Sitepu et al. ( 2012 )
con modificaciones. Las cepas se cultivaron
inicialmente en medio GYP o YM durante 48 horas a
28ºC para obtener células metabólicamente
activas. Posteriormente, cada cepa se transfirió a 25
ml de medio A (glucosa) en un matraz de 125 ml y se
cultivó durante 24 horas a 28 ° C y 150 rpm. Se
inoculó 1 ml del cultivo previo (7 x 10 7 células / ml)
en 75 ml de medio A en un matraz de 250 ml (para
mantener una proporción de 2/3 como volumen libre
como lo mencionó Poli et al., 2014b ) Durante 72 h,
28 ° C y 150 rpm en coctelera.

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◎ Se centrifugó un volumen de 2 ml de cultivo (4,293 g durante 5 min) y
el sedimento celular se resuspendió en una solución de PBS 1X (NaCl
137 mM, KCl 2,7 mM, Na 2 HPO 4 8 mM y KH 2 PO 2 mM). 4 ),
isopropanol al 5% (v / v) y Tween 20 en una concentración crítica de
micelas (CMC 0.06 mM). Una alícuota de 150 μL (10 7Se transfirieron
células / ml a una placa de prueba de 96 pocillos de fondo negro (Jet
Biofil, China) y se midió la fluorescencia relativa en un equipo Perkin
Elmer Enspire Multimode Plate Reader 2300 (488 nm de excitación,
585 nm de emisión). Después de medir la intensidad de fluorescencia
basal en cada muestra sin colorante, se agregaron 50 μL de Nile Red
(50 mg / L) a la reacción, se incubaron dentro del equipo durante 10
minutos con agitación y finalmente se midieron las muestras con
colorante. Las diferencias en las lecturas de las muestras con colorante,
sin colorante, y el blanco (sin muestra) fueron la fluorescencia relativa
expresada como RFU (Unidades de Fluorescencia Relativa). Cada
muestra tenía triplicados técnicos y biológicos. Utilizamos Y. lipolytica
QU21 como control positivo y S. cerevisiae.CBS 1171 como control
negativo. Las cepas con RFU iguales o superiores a QU21 como
posibles levaduras oleaginosas.

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◎ Curva de calibración.
Construimos una curva de calibración para
obtener una estimación del contenido de
lípidos dentro de las células de levadura
usando una solución de trioleína, en el
intervalo de 10 a 50 mg / L disuelto en PBS
1X, isopropanol al 5% (v / v) y Tween 20 en
CMC (0.06 mM). El contenido de lípidos se
estimó en comparación con la curva de
calibración y se expresó como mg de
lípidos / L medio.

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◎ Determinación gravimétrica de biomasa
Para el análisis gravimétrico de la biomasa,
transferimos 45 ml de los cultivos cultivados a tubos
cónicos de 50 ml, y se centrifugaron a 4.233 g durante
10 minutos para eliminar el sobrenadante, seguido de
dos lavados con 15 ml de PBS 1X cada vez. Secamos
los sedimentos celulares a 60 ° C hasta peso
constante. Medimos la biomasa utilizando un
equilibrio analítico (Shimadzu AY220) y las células
secas se utilizaron para la extracción de lípidos. Todos
los experimentos fueron realizados por triplicado.

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◎ Determinación gravimétrica de lípidos totales.
Extrajimos los lípidos de la biomasa siguiendo el método de Bligh
y Dyer ( 1959 ). La biomasa seca se suspendió en cloroformo /
metanol (2: 1, v / v) y se produjo la lisis celular utilizando un
homogeneizador Turrax (ULTRA-TURRAX T18; IKA), con cuatro
ciclos de homogeneización durante 2 min y enfriamiento con hielo
durante 1 min para evitar Calentamiento lipídico. Para la
determinación del contenido total de lípidos, los disolventes se
evaporaron a 60 ° C utilizando un evaporador rotatorio (Laborota
4,000eco) y se secaron a 60 ° C durante 24 h. Finalmente, se midió
el peso de lípidos extraídos utilizando un equilibrio analítico
(Shimadzu AY220). Expresamos el rendimiento de lípidos como
concentración (medio g / L), el contenido de lípidos como
porcentaje del peso de lípidos en relación con el peso de biomasa
seca (% p / p) y la productividad como g de lípidos / (g biomasa x
h).
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 Perfil lípido
◎ Transesteri
◎ ficamos los extractos lipídicos secos siguiendo el método de Hartman y Lago
( 1973).). Se transfirió un volumen de 1 ml de ésteres metílicos de ácidos
grasos (FAME) a ​un inserto de vial de 2 ml GC, que contenía 0,5 ml de
solución de BHT (hidroxitolueno butilado) (0,4 mg / ml). El perfil y la
cuantificación FAME se realizaron utilizando un cromatógrafo de gases (GC-
2010 PLUS, SHIMADZU) equipado con un inyector dividido y un detector de
ionización de llama (FID) con hidrógeno como gas portador con un flujo de
57,1 ml / min, equipado con un SUPELCO Columna GC capilar SLB-IL100
(30 m de longitud, diámetro interno de 0,25 mm con columna de sílice fundida
recubierta con una película de polietilenglicol de 0,2 µm) (Nº de catálogo
28884-U, Sigma-Aldrich). Se inyectaron muestras de 1.0 μL usando una
jeringa de 10.0 μL. La temperatura del detector se ajustó a 250 ° C; el gas
portador fue hidrógeno a una velocidad de flujo de 40 ml / min, una velocidad
promedio de 31 cm / s, y una presión constante de 46.0 kPa. El flujo de aire fue
de 400 mL / min.

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◎ Procesamos las áreas de los picos de los ácidos grasos
utilizando la solución GC Postrun (versión 2.42 SU1,
Shimadzu) y determinamos el perfil del éster metílico de los
ácidos grasos de cada muestra comparando el tiempo de
retención de cada pico FAME presente en la muestra con el
tiempo de retención de FAME estándares de referencia
contenidos en la mezcla estándar de referencia SUPELCO
SLB-IL100 Columna GC Capilar. Incluimos BHT en el
prospecto del vial de GC para cada muestra como el estándar
interno para la cuantificación de ácidos grasos. Calculamos el
porcentaje del contenido total de ácidos grasos como la
relación del área de picos de FAME individual a la suma de
todas las áreas de picos de FAME, excluyendo el pico de
BHT.

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 Optimización de la producción de lípidos

Se evaluaron cuatro variables de forma independiente para mejorar la producción de lípidos en M.
guilliermondii BI281A: fuente de carbono (glucosa o glicerol), fuente de nitrógeno [extracto de malta, peptona,
triptona, NH 4 NO 3 y (NH 4 ) 2 SO 4 ], tiempo de cultivo (24–120 h) y temperatura (20, 26, 28, 30 y 37 ° C). Para
evaluar las fuentes de carbono y nitrógeno, modificamos el medio A para cambiar el componente predeterminado de
carbono o nitrógeno en la preparación, respectivamente. Por ejemplo, cambiamos 100 g / L de glucosa en un 15% (v /
v) de glicerol. Las variables de respuesta fueron biomasa seca (g / L), densidad óptica (DO 600 nm).), y la producción de
lípidos (estimación mg / L a partir de fluorescencia relativa). Todos los experimentos fueron medidos en triplicados
técnicos y biológicos.
Sobre la base de los resultados univariados, elegimos tres variables independientes para la optimización de la
producción de lípidos con glicerol y sulfato de amonio como fuentes de carbono y nitrógeno, respectivamente,
utilizando el Diseño compuesto central (CCD) y la Metodología de superficie de respuesta (RSM). La variable
dependiente seleccionada para este estudio fue la producción de lípidos (mg / L). Las variables independientes fueron
el tiempo de cultivo (X 1 ), la relación C / N media (X 2 ) y la agitación (rpm) (X 3 ). Cada variable se estudió en tres
niveles (-α, 0, + alpha) con dos puntos axiales (-1,68 alpha y +1.68 α), y el intervalo y niveles de estas variables se
muestran en la Tabla Tabla1.1. El diseño experimental incluyó 15 carreras con tres repeticiones en el punto central. La
relación matemática entre la variable de respuesta (producción de lípidos) y las variables X1, X2, X3 se aproximó
mediante una ecuación de modelo cuadrático, de acuerdo con la Ecuación polinómica general de segundo grado (1):

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Donde z es la respuesta predicha (producción de lípidos, mg / l); β 0 es la intersección, β i el
coeficiente lineal, β ij el coeficiente cuadrático, β ii es la interacción lineal entre x i y
y j coeficientes de regresión, y x i , y j son las variables evaluadas (x 1 , x 2 , x 3 ) que definen
la función matemática de z . la precisión del modelo polinomial anterior se evaluó mediante
el coeficiente de determinación r 2 , y la significación estadística se determinó mediante
la prueba f .

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Resultados

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Figura 1. Intensidad de la fluorescencia de las cepas
de levadura cultivadas en medio A utilizando
colorante rojo Nilo (50 mg mL- 1 ). Las longitudes
de onda de absorción y emisión fueron 488 y 585
nm, respectivamente. La línea continua horizontal
indica las Unidades de Fluorescencia Relativa
promedio (RFU) del control positivo ( Y. lipolytica
QU21) y la línea de puntos horizontal indica la RFU
promedio del control negativo ( S. cerevisiaeCBS
1171). Las cepas con RFU por encima del control
positivo están rellenas de negro, las tensiones entre
el control positivo y el control negativo están
rellenas de patrón y las tensiones con RFU por
debajo del control negativo no están rellenas. Las
cepas sin emisión de fluorescencia no se incluyeron
en la figura. Todos los experimentos se realizaron
por triplicado biológico y técnico.

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 OPTIMIZACIÓN DE LAS CONDICIONES PARA
AUMENTAR LA PRODUCCIÓN DE LÍPIDOS EN M.
GUILLIERMONDII BI281A

INICIALMENTE EVALUAMOS CUATRO VARIABLES PARA MEJORAR LA PRODUCCIÓN DE

LÍPIDOS EN M. GUILLIERMONDIIBI281A EN EXPERIMENTOS INDEPENDIENTES (ENFOQUE
UNIVARIADO). EN PRIMER LUGAR, SE ANALIZÓ EL TIEMPO DE CULTIVO UTILIZANDO
MEDIO A (GLUCOSA) PARA ESTABLECER LA CURVA DE CRECIMIENTO Y EL TIEMPO
MÁXIMO DE LA PRODUCCIÓN DE LÍPIDOS (FIGURA (FIGURA 2).2 ). EN SEGUNDO LUGAR,
SE ANALIZARON DIFERENTES TEMPERATURAS A LAS 72 H DE CRECIMIENTO DE LAS
CÉLULAS (FIGURA (FIGURE3A).3A ). ENCONTRAMOS DIFERENCIAS ESTADÍSTICAS PARA
LA BIOMASA Y DE LÍPIDOS DE PRODUCCIÓN (FIGURA (FIGURE3B,3B , ANOVA, P <0,05). LA
BIOMASA Y DE LÍPIDOS DE PRODUCCIÓN MÁS BAJO SE OBTUVIERON A 20 ° C, EN
COMPARACIÓN CON OTRAS TEMPERATURAS ( P<0.05). SIN EMBARGO, NO HUBO
DIFERENCIAS ESTADÍSTICAS ENTRE LA PRODUCCIÓN DE LÍPIDOS A 26, 28, 30 O 37 ° C
( VALORES DE P ENTRE 0.1167 Y 0.7391), Y COMO LAS TEMPERATURAS ENTRE 25 Y 28 ° C
DEMANDAN MENOS ENERGÍA, ELEGIMOS 26 ° C PARA LOS SIGUIENTES EXPERIMENTOS.
FIGURA 2.
CURVA DE CRECIMIENTO DE M.
GUILLIERMONDII BI281A UTILIZANDO
GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO. LA
LÍNEA CONTINUA REPRESENTA LA BIOMASA
SECA (G / L) Y LA LÍNEA PUNTEADA
REPRESENTA LA PRODUCCIÓN DE LÍPIDOS
(MG / L). TODOS LOS EXPERIMENTOS SE
REALIZARON POR TRIPLICADO BIOLÓGICO.
(A, B) COMPARACIÓN DE DIFERENTES
TEMPERATURAS EN DENSIDAD ÓPTICA (OD600 NM)
Y PRODUCCIÓN DE LÍPIDOS (MG / L) DE M.
GUILLIERMONDII BI281A. (C, D) EVALUACIÓN DE
GLUCOSA Y GLICEROL COMO FUENTE DE
CARBONO, Y (E, F)DIFERENTES FUENTES DE
NITRÓGENO EN LA PRODUCCIÓN DE BIOMASA (G /
L) O LÍPIDOS (MG / L) DE M.
GUILLIERMONDIIDESPUÉS DE 72 H DE
CRECIMIENTO CELULAR, 26 ° C, 150 RPM (MEDIO
A). TODOS LOS EXPERIMENTOS FUERON
EVALUADOS INDEPENDIENTEMENTE POR
TRIPLICADO BIOLÓGICO Y
TÉCNICO. * P <0.05, ** P <0.01, NS, NO SIGNIFICATIVO.
SE REPRESENTAN LA BIOMASA (X), LA PRODUCCIÓN
DE LÍPIDOS (L), LA PRODUCTIVIDAD DE LOS LÍPIDOS
(YMAX L / X / T) Y LA CONCENTRACIÓN MÁXIMA DE
LÍPIDOS CELULARES (LMAX) (%, SEGÚN EL PESO
SECO CELULAR TOTAL). TODOS LOS MEDIOS DE
CULTIVO SE SUPLEMENTARON CON KH 2 PO 4 AL 0,1% Y
MGCL 2 6H 2 O AL 0,05% . LAS CONDICIONES DE
CULTIVO FUERON 150 RPM, 26 ° C DURANTE 96 H
PARA GLUCOSA Y 120 H PARA GLICEROL .
VALOR SIN TRIPLICADO. POR ESTA RAZÓN, NO SE
* 

MUESTRA LA ESTIMACIÓN DE LMAX (ND) .

 OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE
LÍPIDOS POR M. GUILLIERMONDII BL281A

DESPUÉS DE DEFINIR LA MEJOR COMBINACIÓN DE FUENTES DE CARBONO Y

NITRÓGENO Y LA TEMPERATURA DE INCUBACIÓN, DISEÑAMOS UN DISEÑO
EXPERIMENTAL MULTIVARIADO (CCD) PARA MEJORAR LA PRODUCCIÓN DE LÍPIDOS
EN M. GUILLIERMONDII BI281A. TABLA TABLA11 MUESTRA LOS NIVELES MÁXIMO Y
MÍNIMO DE VARIABLES ELEGIDAS PARA LOS ENSAYOS EN EL CCD. LAS RESPUESTAS
EXPERIMENTALES SE PRESENTAN EN LA TABLA TABLA 3,3 , QUE MUESTRA LAS
VARIACIONES CONSIDERABLES EN LA CANTIDAD DE LA PRODUCCIÓN DE LÍPIDOS EN
FUNCIÓN DE LAS TRES VARIABLES INDEPENDIENTES ENSAYADAS. LA VARIABLE DE
RESPUESTA, LA PRODUCCIÓN DE LÍPIDOS EXPRESADA EN RFU, SE TRANSFORMÓ EN
MG / L SEGÚN LA CURVA DE CALIBRACIÓN Y VARIÓ DE 10.13 A 198.79 MG / L. COMO SE
MUESTRA EN LA TABLA TABLA 3,3, HUBO UNA CORRESPONDENCIA ENTRE LOS
VALORES OBSERVADOS Y PREDICHOS DE LOS PARÁMETROS ANTERIORES
• LOS EXPERIMENTOS SE REALIZARON POR
TRIPLICADO Y LOS VALORES SE
PRESENTAN EN PORCENTAJE (%
PROMEDIO ± DESVIACIÓN ESTÁNDAR) .
• * SFA, ÁCIDO GRASO SATURADO; MUFA,
ÁCIDO GRASO MONOINSATURADO; PUFA,
ÁCIDO GRASO POLI INSATURADO; ND, NO
DETECTADO .
• ÉSTER METÍLICO DEL ÁCIDO GRASO
** EL 

SE DETECTÓ SOLO EN UNA MUESTRA .

FIGURA 5
CURVA DE CRECIMIENTO (OD600 NM) Y
CINÉTICA DE LA PRODUCCIÓN DE LÍPIDOS (MG
/ L) DE M. GUILLIERMONDIIBI281A. LAS LÍNEAS
CONTINUAS INDICAN GLICEROL PURO Y LAS
LÍNEAS DE PUNTOS INDICAN GLICEROL
CRUDO. LOS EXPERIMENTOS SE MIDIERON
POR TRIPLICADO BIOLÓGICO (PROMEDIO ±
DESVIACIÓN ESTÁNDAR) DURANTE 12
DÍAS. SE TOMARON MUESTRAS EN 5 Y 12 DÍAS
PARA EXTRACCIÓN DE LÍPIDOS,
TRANSESTERIFICACIÓN Y PERFILADO.
DISCUSIÓN:
• LA UTILIZACIÓN DE GLICEROL PARA LA ACUMULACIÓN DE LÍPIDOS ES UN ENFOQUE INTERESANTE
PORQUE M. GUILLIERMONDII BI281A CRECIÓ MEJOR EN GLICEROL QUE EN GLUCOSA, PRODUCIENDO
ALTOS RENDIMIENTOS DE LÍPIDOS, Y ACTUALMENTE EXISTE UNA TENDENCIA A USAR GLICEROL
CRUDO RESIDUAL DE LAS INDUSTRIAS DE BIODIESEL COMO FUENTE DE CARBONO EN LOS
BIOPROCESOS (THOMPSON Y HE, 2006 ; DE SOUZA ET AL., 2014 ; SPIER ET AL., 2015 ; TCHAKOUTEU ET
AL., 2015 ). NUESTROS RESULTADOS SUGIEREN QUE NO HUBO DIFERENCIAS EN LA PRODUCCIÓN DE
LÍPIDOS ENTRE EL CRECIMIENTO EN GLICEROL PURO O GLICEROL EN BRUTO (FIGURA (FIGURA5),5),
SIN EMBARGO, EL PORCENTAJE DE MUFA (EN RELACIÓN CON LOS ÉSTERES METÍLICOS DE ÁCIDOS
GRASOS TOTALES) FUE MAYOR EN GLICEROL EN BRUTO (DESPUÉS DE 12 DÍAS), LO QUE SUGIERE
QUE EL GLICEROL EN BRUTO ES UNA BUENA MATERIA PRIMA RESIDUAL PARA LA ACUMULACIÓN
DE LÍPIDOS. 
EN CONCLUSIÓN, LA METODOLOGÍA DE CRIBADO DE ALTO RENDIMIENTO APLICADA PERMITIÓ UNA
ESTIMACIÓN RÁPIDA DE LA PRODUCCIÓN DE LÍPIDOS CELULARES EN LEVADURAS, SIENDO ÚTIL
PARA EL CRIBADO DE CÉLULAS DE LEVADURA OLEAGINOSAS Y PARA LA OPTIMIZACIÓN DE LAS
CONDICIONES DE CULTIVO PARA MEJORAR LA PRODUCCIÓN DE LÍPIDOS. M. GUILLIERMONDII BI281A
SE INFORMÓ COMO UNA LEVADURA OLEAGINOSA. TIENE POTENCIAL PARA ACUMULAR LÍPIDOS EN
GLUCOSA O EN GLICEROL COMO FUENTES DE CARBONO, PRODUCIENDO HASTA 52.38 O 34.97% DEL
TOTAL DE LÍPIDOS (EN RELACIÓN CON EL PESO SECO). ADEMÁS, EL PERFIL LIPÍDICO MOSTRÓ DE 56
A 74% DE MUFA EN RELACIÓN CON EL PESO SECO DE LA BIOMASA EN GLICEROL PURO O CRUDO,
RESPECTIVAMENTE. SUGERIMOS EL ACEITE PRODUCIDO POR M. GUILLIERMONDII BI281A COMO UNA
NUEVA MATERIA PRIMA POTENCIAL DE BIODIESEL.