BACTEREOLIGIA

2.2.4: TINCION E IDENTIFICACION

EQUIPO:3
MATERIA:ANALISIS ORGANICO
  CONOCER LOS TIPOS DE TINCION EN BACTEREOLOGIA, ASI
OBJETIVO: COMO SUS PASOS A SEGUIR PARA LEALIZARLAS Y VER QUE
TIENEN DE DIFERENTE.
  Tipos
 a) Simples: utilización de un solo tinte con el cual podemos
evaluar solamente la morfología.  Las tinciones simples es
cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se utiliza un solo
colorante.
TIPOS  b) Compuestas ó especiales: constituidas por 2 ó más tintes o
reactivos y sirven para clasificar las bacterias u observar sus
características especiales.
 c) Positivas: se observa teñida la célula sobre un fondo claro.
 d) Negativas: El fondo se tiñe de oscuro para observar la célula o
estructuras refringentes.
  1. Tinción de Gram Principio: Composición de la pared celular de
las bacterias, las bacterias G+ está compuesta por varias capas de
TINCIONES peptidoglicanos, las bacterias G- tienen una membrana externa
con un componente estructural único que son los
COMPUESTAS. lipopolisacáridos. Las bacterias G+ retienen el cristal-violeta
después de la decoloración y aparecen de color azul intenso
(purpura), las bacterias G- no son capaces de retener el cristal-
violeta después de la decoloración y son teñidas de rojo con
safranina.
  a. Preparar la extensión del cultivo: En un
portaobjetos limpio, libre de grasa, y con un asa
bacteriológica colocar una pequeña cantidad de la
colonia bacteriana. a. Muestra solida: colocar
PASOS: solución salina previamente a colocar la colonia,
igual en muestra semisólida. b. Muestra liquida:
colocar la colonia directamente.
 b. Dejar secar al aire, luego fijar la preparación
pasando la placa rápidamente por el mechero (2 ó 3
veces)
  La fijación, procedimiento que permite preservar
estructuras celulares, se puede llevar a cabo con
diferentes tratamientos: fijación por calor o fijación
química. La fijación por calor es la más utilizada
para la observación de bacterias. Este
procedimiento consiste en pasar el portaobjetos,
. con la suspensión bacteriana extendida y seca, a
través de una llama de un mechero. La fijación por
calor preserva la morfología externa de los
microorganismos pero no las estructuras internas.
La fijación química con agentes como etanol,
formaldehído y ácido acético entre otros muchos,
se utiliza para preservar las estructuras celulares.
  c. Agregar violeta cristal durante 20 a 30 segundos
(Colorante primario), enjugar con agua
seguidamente.
 d. Agregar yodo Gram durante 40 a 60 segundos
(mordente), enjuagar con agua seguidamente.
.  e. Agregar alcohol acetona y enjuagar con agua
inmediatamente (decoloración, disuelve lípidos de
la pared de G- )
 f. Agregar safranina durante 20 segundos, enjuagar
con agua seguidamente.
  Principio: Se suspende una bacteria del genero Bacillus, evidencia
capsula incolora en un contraste morado.
2. TINCIÓN DE  Pasos:
MOELLER  a. Se prepara el extendido de la muestra
(ESPORAS)  b. Se deja secar y se fija con calor
 c. Se tiñe con carbol-fuschina hasta llenar por completo el
portaobjetos
 d. Pase un mechero por debajo de la placa calentando hasta que
vea que se emiten
 vapores y sin dejar que hierva por 3 minutos. Si la placa se va
secando, ir agregando
 más tinte hasta cumplir el tiempo. (Se calienta el tinte para que
penetre la espora
 que contiene dipecolinato de calcio)
 e. Se enjuaga con agua y se coloca ácido sulfúrico al 1% por 2
minutos (decolorante
 para retirar el carbol-fuchina)
 f. Se enjuaga con agua y se tiñe finalmente con azul de metileno
por 1 minuto
 g. Dejar secar
 Las esporas permiten a las bacterias pasar a un
estado latente en condiciones ambientales
 adversas. Su principal componente es Ca2+
fijado a ácido dipicolínico. El calor después de
 la tinción con carbol-fuscina con permite que
rompa la estructura que protege la espora para
 que así pueda penetrar el colorante. Con el
lavado de agua se retira todo tinte que se
adhirió
 a la bacteria, para después teñirse con azul de
metileno.
 Resalta de color rojo la espora y de color azul,
la bacteria.
  Principio: Es una tinción negativa en donde vemos la
3. TINCIÓN DE cápsula no teñida sobre un fondo morado y se visualiza
ANTHONY la bacteria en el centro de la cápsula, esta pude ser de
glicoproteínas o polisacáridos.
(CÁPSULA)  La cápsula es una sustancia viscosa producida por
algunas especies que la sintetizan a partir de
polipéptidos, polímeros de glucosa u otros amino
azúcares que contienen nitrógeno, que después de
combinarse con el agua es segregada por todo el
contorno de la pared celular como un moco gelatinoso.
Cuando la cápsula ha sido producida puede observarse
en los frotis coloreado por el método de Gram como un
halo incoloro alrededor de la bacteria. Cuando se
requiere ver la cápsula con más detalle o inducir su
producción se recurre a coloraciones especiales.
 Pasos: a. Colocar leche descremada al 20% o leche
litmus en un extremo del portaobjetos b. Agregar la
muestra de bacteria en la leche del borde c. Realizar un
extendido con la ayuda de otro portaobjetos d. Se deja
secar al aire (no se fija con calor ya que la leche se pega
al portaobjetos) e. Teñir por 2 minutos con violeta-
cristal. f. Lavar con sulfato de cobre. g. Se deja secar al
aire. Las cápsulas no se tiñen normalmente con
colorantes básicos como el cristal violeta o la safranina.
Tinción negativa de cápsulas en que la leche litmus se
tiñe con violeta cristal como contraste de un fondo
morado con el halo transparente de la cápsula incolora.
 4. Tinción de ácido-alcohol resistencia
 Principio: Se trata de un procedimiento
de tinción diferencial, conocido como
método de Ziehl-Neelsen, que tiene
gran relevancia por su aplicación clínica.
Permite poder distinguir aquellos
microorganismos cuya coloración
resiste la acción de alcoholes y ácidos
suaves (ácido-alcohol resistentes) de
otros que no resisten la decoloración
(no ácido-alcohol resistentes)
 Dentro de las bacterias ácido alcohol resistentes encontramos dos importantes
patógenos: Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae, microorganismos
responsables de la tuberculosis y la lepra respectivamente. Estas bacterias pertenecen al
Phyllum Actinobacteria, un grupo grande y complejo de bacterias gram positivas, que
incluye a la Familia Mycobacteriaceae caracterizada por contener en sus paredes
celulares un alto contenido lipídico, ceras con una gran diversidad de ácidos micólicos,
moléculas de 60 a 90 átomos de carbono. La presencia de estos lípidos, en la cara
externa de la pared, hacen que estas bacterias sean muy resistentes a la acción de
compuestos químicos presentes en su entorno, característica que se utiliza para aislar
estos microorganismos: uno de los medios más frecuentes es el Loewenstein-Jensen con
verde malaquita que permite el crecimiento selectivo de estos microorganismos.
 Procedimiento
 a. Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña porción de un cultivo
bacteriano con el asa de siembra estéril
 . b. Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos con el asa
de siembra. Dejar secar.
 c. Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el portaobjetos.
 d. Cubrir con unas gotas de fuchina fenicada y aplicar calor con un hisopo de lana
 e. de vidrio, mantener 5 minutos desde el comienzo de la emisión de vapores
 f. Lavar el exceso de colorante con agua.
 g. Añadir unas gotas de ácido nítrico al 33% durante 30-40 segundos.
 h. Lavar el exceso de colorante con agua.
 i. Lavar la preparación con alcohol de 96º durante 30 segundos.
 j. Lavar con abundante agua.
 k. Cubrir con el colorante de contraste, azul de metileno durante 1 minuto.
 l. Lavar el exceso de colorante con agua.
 m. Dejar secar al aire.
 n. Añadir una gota de aceite de inmersión.
 o. Observar con objetivo de inmersión (100 x).
 Estas bacterias son resistentes
al tratamiento con alcoholes y
ácidos suaves conservando el
colorante fundamental,
mientras que organismos que
no posean esta característica
son rápidamente decolorados y
pueden teñirse con el colorante
de contraste en este caso azul
de metileno.
 5. Tinción de azul algodón de lactofenol
 El examen microscópico es de gran importancia en micología para la observación
de las diferentes especies de hongos de interés clínico. Se deben utilizar tinciones
que logren preservar la integridad de las estructuras fúngicas. La tinción de azul
algodón de lactofenol no es considerada una tinción diferencial, sin embargo,
posee características tintoriales que permiten observar cada uno de los
componentes fúngicos y apreciar fácilmente las estructuras para una adecuada
identificación.
 Principio: El fenol inactiva las enzimas líticas de la célula e impide que ésta se rompa; de
igual forma, destruye la fl ora acompañante e inactiva a la célula, quitándole el grado de
patogenicidad; además, actúa como mordiente cuando se usa en combinación con
colorantes. El ácido láctico preserva las estructuras fúngicas al provocar un cambio de
gradiente osmótico con relación al interior fúngico, lo que genera una película
protectora. El azul de algodón es un colorante ácido, que tiñe el citoplasma y la quitina
presente en las células fúngicas, mientras que el glicerol mantiene húmeda la
preparación. Una vez preparado el colorante, se debe colocar la muestra microbiológica
en un portaobjetos por medio de una impronta (proceso en el cual se coloca una
impresión de la muestra sobre una estructura utilizando una cinta adhesiva
transparente).
 Preparación de la impronta a. Colocar el material necesario en la
campana de seguridad tipo 2A.
 b. Seleccionar las colonias para realizar las improntas.
 c. Cortar segmentos de cinta adhesiva transparente aproximadamente
de 1 cm.
 d. Pegar los segmentos de cinta en un asa micológica.
 e. Poner una gota de azul de algodón en el portaobjetos.
 f. Con el lado adhesivo de la cinta, tocar la parte superior de hongo.
 g. Colocar la cinta sobre la gota de azul de algodón y poner otra gota de
azul de algodón.
 h. Poner un cubreobjetos sobre la preparación.
 i. Observar en 40x.
 LAS ESTRUCTURAS
FÚNGICAS SE
OBSERVARÁN DE
COLOR AZUL SOBRE UN
FONDO BLANCO
 Bibliografía
 1. Luis Esaú López-Jácome, Melissa Hernández-Durán, Claudia Adriana Colín-
Castro, Silvestre Ortega-Peña, Guillermo Cerón-González, Rafael Franco-
Cendejas. (marzo, 2014) Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología.
Obtenido de http://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-2014/ir141b.pdf.
 2. Covadonga Vázquez, Ana Martín, Mª Isabel de Silóniz, Susana Serrano,
Departamento de Microbiología III. Facultad de Ciencias Biológicas. Universidad
Complutense. Madrid. (2010). Técnicas básicas de Microbiología, Observación de
bacterias. Obtenido de
http://revistareduca.es/index.php/biologia/article/view/819/834