Biotecnología Prof.

Tamara Zilocchi

Unidad 2: Biotecnología microbiana. ADN y replicación.

Estructura y transformación de bacterias. Técnicas de
clonación y expresión.
Biotecnología Microbiana

• Aunque los microorganismos mas abundantes son las

bacterias, dentro de esta categoría también encontramos
a hongos, virus, algas y protozoos.

• Las bacterias llevan en la Tierra mas de 3.500 millones de

años y las podemos encontrar fácilmente a nuestro
alrededor. Viven en nuestra piel, nuestra boca, nuestros
intestinos… están en el aire y en cada superficie que
tocamos.

• Si bien solo se ha identificado, cultivado y estudiado en

laboratorio alrededor de solo el 1% de todas las bacterias,
estas han sido fuente de grandes avances biotecnológicos
y han estado presentes en practicas biotecnológicas
antiguas.
Algunos recordatorios antes de empezar
• El ADN no esta contenido en el núcleo
y generalmente consiste en un
cromosoma circular único que carece
de histonas.
• La bacteria puede contener ADN
plasmídico.
• La bacteria carece de organelas
limitadas por membrana.
• La pared celular contiene un complejo
polisacárido y una sustancia proteica
llamada peptidoglucano, que forman
una barrera exterior que protege a las
células y determina su tamaño.
• Algunas bacterias contienen una capa
exterior de carbohidratos que forman
una estructura llamada capsula.
• Las bacterias varían según su tamaño y forma.
• Las formas mas comunes son:
-Cocos
-Bacilos Formas
-Espiroquetas

• Las bacterias no forman tejidos multicelulares como las plantas y los animales, aunque
alguna de ellas pueden asociarse con otras para formar cadenas o filamentos de muchas
células conectadas.
 Pared

bacteriana

• Se encuentra por fuera de la membrana plasmática.

• Su estructura y composición identifica 2 tipos de bacterias:

Gram positivas:
-Pared muy ancha.
-Contiene numerosas capas de Muerina + acido teicoico.

Gram negativas:
-Pared delgada.
-Contiene una sola capa de Muerina + bicapa lipídica.
1 Cristal
violeta 2 Lugol
3 Alcohol
4 Safranina
 Capsula
Por fuera de la pared bacteriana se encuentra una capa formada por:
bacteriana
-polisacáridos. Glicocálix
-Proteínas.

Capsula bacteriana

-Les permite a las bacterias

adherirse a las superficies.

-Le permite a las bacterias

protegerse de los ataques del
sistema inmune.
 Membrana
• De estructura química similar a la de las células eucariotas:
-Proteínas. plasmática
-Fosfolípidos.
-Colesterol.
-Hidratos de carbono.

• Asociadas a la membrana se encuentran enzimas:

-Participan en procesos de utilización del oxigeno.

• Mesosomas:
-Invaginaciones de la membrana plasmática.
-Aumentan la superficie de intercambio.
 Ribosomas

• Numerosos.

• Dispersos en el citoplasma.

• Tienen la misma conformación

que los ribosomas eucarióticos.

Pero son mas

pequeños.
• Puede ser único o múltiple.
Flagelo
• Función:
-Movilizar a la bacteria.
• Es característico de cada tipo
de bacteria lo cual permite
identificarlas.
• Compuestos por:
-Flagelina.
• Ubicados por fuera de la
membrana plasmática, se
adhieren a ella mediante
anillos proteicos.
 Fimbria
o Pili
• Filamentos proteicos cortos.
• Se proyectan por fuera de la pared
celular.
• Funciones:
-Adherirse a la superficie de los
tejidos.
-Transmisión de genes entre las
bacterias.
• Formado por una sola molécula de ADN circular de doble cadena unida a pocas
proteínas.
• Se encuentra en una zona especifica llama nucleoide.
ADN
bacteriano
• Plásmidos:
-Moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal.
-Se replican y transcriben independientes del ADN cromosómico.
-A menudo contienen los genes de resistencia a los antibióticos.
-Son de suma importancia como herramienta en técnicas de ADN recombinante.

¡Un cromosoma bacteriano

contiene unos 2/4 millones
de bases, mientras que uno
humano contiene alrededor
de 200 millones!
 Cultivo

• La mayoría de las bacterias se pueden cultivar de diversas formas ya sea en un

medio acuoso o un medio solido.
• En un medio solido, como sucede en las placas de Petri con Agar-Agar, las bacterias
suelen crecer en grupos de forma circular llamados “colonias”  Una única colonia
puede contener millones de células bacterianas que provienen de la rápida división
de una célula original.
• En el caso de los fermentadores, se cultivan varios litros de bacterias en un medio
acuoso.
La importancia del ADN
 • En 1928 Griffith estudiaba dos cepas de la
bacteria Streptococcus pneumoniae.
Frederick Griffith
Este experimento demostró la
existencia de un factor de
transformación, si bien Griffin no
detecto al ADN como el causante,
La transformación es la captación de
sus teorías abrieron el camino para
ADN por las células bacterianas.
que en 1944 Avery, MacLeod y
McCarty si lo hicieran.
Al ser sometidas al calor, las células S
se rompían y liberaban su ADN en el
tubo donde este se combinaba con las
células R, transformado sus
propiedades y volviéndolas virulentas.

La transformación es una técnica de

gran alcance en biología molecular y
se utiliza rutinariamente para
introducir genes en bacterias para la
clonación de ADN, producción de
proteínas y otras aplicaciones.
 Estructura del ADN

• La unidad de construcción del ADN es el nucleótido.

Molécula Fosfato

Pentosa  Desoxirribosa
Adenina
Base Nitrogenada Purinas
Guanina

Timina
Pirimidinas Citosina
• Una hebra de ADN es una cadena de
nucleótidos unidos por enlaces
fosfodiéster que conectan el azúcar de
un nucleótido al fosfato de un nucleótido
adyacente.
• La secuencia de bases en una cadena
puede variar.
• Cada cadena de nucleótidos tiene
polaridad; hay un extremo 5’ y un
extremo 3’.
• Cada molécula de ADN consta de dos Adenina Timina
cadenas interconectadas que se enrollan
entre si para formar una doble hélice en
sentido dextrógiro.
• Las dos hebras de una molécula están
unidas por puentes de hidrogeno entre Citosina Guanina
pares de bases complementarias de
cadenas opuestas.
 Genes
• Un gen es una secuencia de nucleótidos que
proporcionan a las células las instrucciones
necesarias para la síntesis de una proteína
especifica o un tipo particular de ARN.
• Al controlar las proteínas producidas en una
célula los genes influyen en la apariencia de las
células, tejidos y órganos, incluso a simple
vista  Rasgo.
• Algunos rasgos son controlados por un único
gen, mientras que otros están determinados
por múltiples genes que codifican proteínas
que interactúan de manera compleja.
Replicación del ADN

• Es un proceso semiconservativo necesario para que las células

puedan llevar a cabo la división celular.

• Antes de que comience la replicación las dos hebras de ADN deben

ser separadas en hebras simples, para servir de molde y lograr dos
cadenas nuevas de ADN.

• Cada nueva hélice contiene una cadena original “parental” y una

cadena de nueva síntesis  Semiconservativo!

• Se lleva a cabo en etapas en las que median diferentes proteínas.

• La replicación es iniciada por la ADN helicasa  enzima que
separa ambas cadenas de nucleótidos rompiendo los puentes de
hidrogeno entre bases complementarias.

• Se forma una horquilla de replicación.

• Mientras la DNA helicasa continua “desenrollando” el ADN,

proteínas de unión a cadena sencilla, se unen a cada hebra y
evitan que las bases vuelvan a aparearse.

• La separación de las cadenas complementarias se produce en las

regiones del ADN llamadas orígenes de replicación  En células
bacterianas habrá uno solo, mientras que en células eucariotas
existen múltiples sitios de origen.
• Pequeñas secuencias de ARN llamadas cebadores o
oligonucleótidos, son sintetizados por la enzima primasa.

• Estos cebadores inician el proceso de replicación porque sirven

como sitios de unión para las ADN polimerasas  enzimas que
sintetizan las nuevas hebras de ADN.

• La ADN polimerasa siempre trabaja en una dirección, sintetizando

las nuevas cadenas con orientación 5’ a 3’ y añadiendo nucleótidos
al extremo 3’ de una cadena de nueva síntesis mediante la
formación de enlaces fosfodiéster entre el fosfato de un
nucleótido y el azúcar de un nucleótido anterior.
• Debido a que la ADN polimerasa solo sintetiza en dirección 5’ a 3’,
habrá una cadena líder en la cual la replicación sucederá de
manera continua, y una cadena retrasada donde la replicación se
dará en forma discontinua.

• Sobre la cadena retrasada se sintetizan fragmentos cortos de ADN

 Fragmentos de Okazaki.

• La ADN ligasa será quien catalizara los enlaces covalentes entre

los fragmentos de Okazaki de la cadena retrasada para garantizar
que no haya “huecos” en el esqueleto fosfodiéster.

• Como ultimo paso, los cebadores son retirados y sustituidos por la

ADN polimerasa.
Microorganismos utilizados
como herramientas
 Enzimas microbianas

• Algunas de las primeras enzimas disponibles en comercio,

aisladas para su uso en biología molecular fueron las
polimerasas de ADN y las enzimas de restricción
procedentes de las bacterias.

• Bacterias como la thermus aquaticus, han permitido que se

aísle la ADN taq polimersa, una enzima termoestable que
se utiliza en una gran cantidad de técnicas de ADN
recombinante  Ej: el marcaje de secuencias de ADN para
investigación.

• La enzima celulasa aislada de la E. Coli, degrada la celulosa

y se utiliza para hacer que los alimentos para los animales
puedan digerirse mas fácilmente, e incluso para lograr el
efecto de los famosos jeans “lavados a piedra”.
 • La proteasa Subtilisina, una variante de
Bacillus Subtilis, es un componente muy
importante de muchos detergentes cuya
función es degradar y eliminar las manchas
de proteínas de la ropa.

• Las amilasas son proteínas hidrolíticas

utilizadas para degradar el almidón.
• A fines alimenticios permiten obtener
jarabe de maíz, elemento que se utiliza
como aditivo a gran cantidad de productos.
• Se pueden obtener por ejemplo del Bacilo
Licheniformis.
 Transformación bacteriana

• La mayoría de las bacterias no captan

el ADN fácilmente a menos que sean
tratadas para ser mas receptivas.

• Las células que han sido tratadas para

tu transformación se llaman células
competentes.

• Llamamos transformación a este

proceso, porque se puede cambiar la
apariencia o las propiedades de la
célula bacteriana al introducir en ella
genes extraños.
Técnica con Cloruro Cálcico

• Se trata a las células con una solución de cloruro cálcico

helada.

• Los átomos cargados positivamente en esta solución atacan la

pared bacteriana y la membrana para crear agujeros a través
de los cuales pueda penetrar el ADN.

• Para mantener su estado competente y que puedan ser

utilizadas en laboratorio, se debe congela las células a
aproximadamente -80/60°C.
• Una vez preparadas las células, la transformación es relativamente
simple.

• Generalmente el ADN que se introduce en las bacterias se inserta en un

plásmido que contiene uno o mas genes de resistencia.

• El plásmido vector se mezcla en un tubo con las células competentes y

se sumerge en hielo por algunos minutos.

• Seguidamente, las células se calientan por aproximadamente un minuto

a 37/42°C  Golpe de calor.
• Tras permitir que las células crezcan
en un medio liquido, puede ser
cubiertas por un medio con agar-agar
que contenga antibióticos.

• Solamente aquellas células que fueron

transformadas por el ADN plasmídico
que contenían los genes de resistencia
crecerán para producir colonias 
Selección antibiótica.

• En la cinética normal de las colonias

cultivadas, los genes contenidos en el
plásmido son transcriptos y traducidos
con normalidad, expresando proteínas
recombinantes.
 Técnica de Electroporación

• Esta técnica utiliza un instrumento llamado

electropolador para producir un breve choque eléctrico
que introduce el ADN en las células bacterianas sin
matar a la mayoría de ellas.

• En comparación al tratamiento con Cloruro cálcico, esta

técnica es mas rápida, mas eficaz, requiere menos
células y puede utilizarse para trabajar con otros tipos
celulares (levaduras, hongos, animales y plantas)
 Técnicas de clonación y expresión

• Una de las razones por las cuales se transforman las Ese ADN recombinante
células bacterianas es para duplicar el ADN puede lograr que la bacteria
exprese proteínas en masa
recombinante de interés. con diversos objetivos como
vimos la clase pasada.

• Vamos a explorar dos técnicas utilizadas:

-Creación de proteínas de fusión bacteriana.
-Proteínas bacterianas como informadores.
 Creación de proteínas de fusión
bacteriana

• Existen muchas formas de producir proteínas de fusión, pero lo fundamental de

esta técnica es utilizar métodos recombinantes de ADN para insertar un gen de la
proteína de interés en un plásmido que contenga un gen de una proteína conocida
que sirva como marcador.

• La proteína marcada permite el asilamiento y la purificación de la proteína

recombinante como proteína de fusión.

• Los vectores plasmídicos necesarios para crear proteínas de fusión se llaman

habitualmente  vectores de expresión (hacen posible que las células produzcan
o expresen grandes cantidades de proteínas).
• Los vectores por lo general sintetizan proteínas como :
-Proteina de unión a maltosa.
-Glutation S-Transferasa.
-Luciferasa.
-Proteina fluorescente verde.
-Beta-Galactosidasa.

• Los vectores contienen secuencias promotoras procariotas, por lo que las

cadenas de ARN mensajero transcritas son moléculas hibridas que
contienen secuencias codificadoras para los genes de interés y la
proteína marcada  Se sintetiza una proteína de fusión.

• Para aislar la proteína de fusión y separarla del resto de las proteínas

generadas por la bacteria, las células son lisadas y homogeneizadas,
creando una especie de batido de bacterias  extracto.
La somatostatina cumple una función
reguladora de la glucemia, inhibiendo la
secreción de insulina y glucagón.
Quizás una de sus funciones de mayor
interés es que también inhibe la
síntesis/secreción de la hormona de
crecimiento humano y el eje
hipotálamo-hipófisis-tiroides, lo que la
hace útil tanto para combatir tumores
como para diagnosticar ca de tiroides.
• Como paso siguiente, se hace pasar el extracto por una columna que
esta llena de esferas cubiertas de moléculas que se unirán a la porción
proteica marcada de la proteína de fusión  cromatografía por
afinidad.

• Posteriormente un tratamiento con enzimas proteasas, que rompen los

enlaces peptídicos, aísla la proteína de interés.

• Algunas técnicas utilizan pequeño péptidos marcados, como por ej los

marcadores poli His (pequeña seria del aminoácido histidina)  El
beneficio reside en que no afectan la estructura y función de la
proteína a la que están fusionadas y en lo general pueden no
eliminarse.
 Proteínas bacterianas como
informadores

• Estudiando el proceso de bioluminiscencia de especies marinas, se logro relacionar

este efecto con las bacterias Vibrio Fisheri y Vibrio Harveyi, que crean luz a partir
de los genes lux  varios genes lux codifican las subunidades proteicas que forman
una enzima llamada luciferasa.
• Los genes lux se han clonado y utilizado para estudiar la expresión génica de varias
formas especificas  actúan como genes informadores, reporteros o marcadores.
• Si la luciferasa codificada por los genes lux es introducida en células animales o
vegetales, estas adquieren un brillo fluorescente que proporciona una señal visual
de la expresión génica.