ELECTROFORESIS

MATERIA: ANALITICA II
INTRODUCCION

 Fue introducida por el bioquímico

sueco ARNE TISELION.
 El interés principal de este investigador
fue la química de las proteínas séricas
 Por su trabajo pionero en este campo,
Tiselion recibió el Premio Nobel en
1948.
El método para separar las proteínas de
una mescla, consistía en colocar un
volumen de una mezcla proteica en un
tubo de vidrio en forma de u sin llenarlo
completamente.
Luego el espacio restante en cada estreno
se ocupaba con el volumen necesario de
una solución de electrolitos libre de
proteínas, que actuaba como
amortiguador.
Debía tenerse mucha precaución al
adicionar la solución amortiguadora, evitar
que se mezclara con la solución de
proteínas a separar.
ELECTROFORESIS

 PROVIENE DEL GRIEGO PHOROS DONDE:

Electro Electricidad

Foresis Trasladar
ELECTROFORESIS
 La Electroforesis es una técnica separativa que emplea un
campo eléctrico Aplicado que actúa sobre partículas
cargadas ( anión (-) y catión (+) ) Causando su movimiento a
través de una matriz gelatinosa.
ELECTROFORESIS
Los métodos de electroforéticos son de alta sensibilidad,
eficacia, poder de resolución y versatilidad
1.Sus métodos nos sirven Para la separación de:
 Proteínas ( Albumina)
 Ácidos nucleicos (ADN y ARN)
 Otras biomoléculas
2.Permite determinar:
 Análisis sofisticado de la proteínas (Peso molecular)
 Visualización de las bandas de ADN o ARN de patógenos
 Detectar cambios o mutaciones a nivel genético
 Distinguir moléculas por su carga neta o forma
EQUIPO ELECTROFORETICO
PRINCIPIOS DE SEPARACION
La pared del capilar esta constituida por un entramado
grupo de silanol Si --OH, esto hace que el capilar
inicialmente este cargado negativamente silanoato Si-O
en su O en sus paredes, los H y otras cargas positivas
libres se sitúen cerca de las cargas negativas de la
pared formado una doble capa.
FLUJO ELECTROFORETICO
Es producido por la carga eléctrica de cada partícula existente en el
interior del capilar, y por lo tanto produce el efecto doble capa.

Capilar Con pared cargada -- Efecto doble carga

FLUJO ELECTROOSMÓTICO
flujo debido a la fuente de tension
Flujo total: flujo electroosmótico ± flujo Electroforetico.
SEPARACION DE ANALITOS
Se basa en las diferentes movilidades Electroforeticas de los solutos
ionicos que harán que los analitos migren a través del capilar y
lleguen a detector a diferentes tiempos
 La movilidad electroosmotica es mayor que la electroforetico
haciendo que sea posible separar aniones y cationes en una sola
inyección de la muestra.
Las partículas neutras son separadas debido a que poseen
movilidad electroforetica

Flujo electro osmótico + Flujo electroforético = flujo total

ELECTROOSMOSIS

Es el proceso de mover un líquido a través de un

material utilizando un campo eléctrico aplicado. El
movimiento puede ser a través de un material
poroso, a lo largo de un capilar, membrana, etc.
La velocidad del líquido es linealmente
proporcional al campo eléctrico aplicado.
También depende del material utilizado para
construir el canal y la solución utilizada. En la
interfaz, la solución y el material han obtenido
cargas opuestas y esto se conoce como una
doble capa eléctrica. Cuando se aplica un
campo eléctrico a la solución, la doble capa
eléctrica se mueve por la fuerza de Coulomb
resultante. Esto se conoce como el flujo electro-
osmótico.
ELECTROMIGRACION
Electromigracion es el transporte del material causado por el
movimiento gradual de los iones en un conductor debido a la
transferencia de calidad de movimiento entre los electrones de
conducción y los átomos de metal.
El efecto de la electromigración es importante en aplicaciones
donde se utiliza densidades de corrientes altas, como en la
microelectrónica y en estructuras relacionadas, como el tamaño de
la estructura en los dispositivos electrónicos y en los circuitos
integrados es muy pequeño, un la pérdida de material debido a la
emigración es de importancia mucha gente cree que era la
electromigracion es la “migración de electrones” pero en realidad es
el material que “emigra” por causa de un flujo de electrones, por eso
se llama electromigracion .Electromigracion es un fenómeno que
depende de la temperatura de servicio de la densidad de corriente
que circula por el semiconductor. La electromigracion ocurre sólo en
zonas donde el semiconductor está dopado o sea cuando está
excitado.
INSTRUMENTACION
Básicamente, costa de un tubo capilar, dos viales, un detector y una
fuente de alto voltaje. Los viales de entrada y salida contienen el
tampón de separación. En dichos viales se introducen los extremos
del capilar
Una vez rellenado con el tampón de separación, se introduce el
extremo del capilar de entrada en el vial de muestra para realizar
la introducción de ésta. La inyección de la muestra en el capilar se
puede realizar hidrodinámicamente
El sistema de detección más ampliamente utilizado en
electroforesis capilar es el de absorbancia en el rango UV-Vis,
debido a que es posible detectar una gran número de
compuestos y a su bajo coste.

Su principal inconveniente es su menor sensibilidad respecto a

otros sistemas de detección. Un sistema de detección con el que
se consigue aumentar sustancialmente la sensibilidad es la
detección de fluorescencia inducida por láser (LIF).
TIPOS DE ELECTROFORESIS CAPILAR

ELECTROFORESIS CONVECIONAL:
• Es muy utilizada para la detención y control de pureza,
caracterización y cuantificación (por comparacion con
controles) así como para la purificación de fragmentos de
ADN y ARN.
• Se lleva acabo sobre una capa delgada y sálica de gel,
semisólido y poroso que contiene un tampón en el interior de
sus poros que ofrece resistencia al movimiento.
• Se pueden separar varias muestras simultáneamente.
• Se aplica un potencial de corriente continua por un tiempo
fijo, transcurrido este se corta la corriente.
• Una vez que se produjo la separación de las especies, se realiza la
coloración para visualizarlas, se utilizan geles tridimensionales de
polímeros ramificados que contienen entre sus ramificaciones
espacios llenos de líquido.
• Esto permite la electroforesis: separación por relación carga/tamaño
y es tamizado: separación por tamaño.
• Los geles más comunes son agarosa y poliacrilamida, la contención
del gel define el poder de reticulación.
ELECTROFORESIS CAPILAR
• Surge a que debido la velocidad de separación y resolución de los compuestos
mejora a medida que aumentan la intensidad del campo eléctrico aplicado.
• Se realiza electroforesis en un tubo capilar de menos de 0.1 mm de diámetro
de 50 a 100 cm de longitud, reduce el efecto joule aumentando la disipación del
calor generado, el mecanismo de separación está basado en la relación
carga/masa.
• Se utilizan volúmenes pequeños de 0,1 a 10 nano litros con elevada resolución y
rapidez.
La electroforesis capilar también se divide: electroforesis capilar en gel, capilar de
zona, enfoque isoeléctrico, isotacoforesis.
CARACTERISTICAS
 ELEVADA RAPIDEZ DE ANALISIS: los tiempos de separación son
generalmente de varias Desenas de minutos
 ELEVADA EFICACIA DE SEPARACION: en los análisis de
proteínas suelen obtenerse eficacias en torno a los 10.000-
100.000 placas teóricos por metro de columna ,
dependiendo de la proteína a analizar y de las condiciones
de separación.
 PEQUEÑOS VOLUMENES DE MUESTRA: en cada separación de
utilizan unos pocos (10-50)nanolitros de muestra.
 LA TOTAL AUTOMATIZACION DEL ANALISIS: los instrumentos de
electroforesis capilar permiten llevar acabo los análisis sin la
constante atención del operador.
APLICACIONES
 BIOMEDICA
 BIOFARMACEUTICA
 ALIMENTOS
 CONTROL AMBIENTAL

CARACTERISTICAS

DISOLUCION TAMPON DISOLUSIONES QUE AFECTAN

• SOLUBILIDAD Y ESTABILIDAD • TIPO

• GRADO DE IONIZACION • COMPOSICION
• EFECTOS pH • pH
• EFECTOS MODIFICADORES • FUERZA IONICA
• DISIPACION
ELECTROFORESIS CAPILAR DE ZONA

ISOELECTROENFOQUE CAPILAR

ELECTROFORESIS EN GEL (CGE O ECG)

ISOTACOFORESIS