Assay for quantitative

determination of GSH and GSSG

levels using enzymatic recycling
method
Irfan Rahman, Aruna Kode & Saibal K Biswas.
Conceptos
 GSH: Antioxidante

 GSSG
 Protocolo: Ensayos
 GSH  GSSG

GSH + 5,5′−ditiobis−(ácido Monitoreo de NADPH mediante

2−nitrobenzoico) espectrofotometría
→ GS − TNB λ = 412𝑛𝑚

La tasa de formación de TNB es Extractos celulares tratados con

proporcional a la concentración 2-Vinilpiridina y su exceso se
de GSH en la muestra neutraliza con trietanolamina.
Equipos
 Lector de microplacas con 96 pozos con filtro de
abs a 415nm / espectrofotómetro UV normal
 Homogenizador para tejidos (Potter Elvejam o PRO
Scientific PRO-200)
 Procesador ultrasónico (Harvey instruments)
 Papel secante Whatmann 44 (Sigma)
 Jeringas de plástico de heparina con litio (BD
PharMingen)
 Kit de hemoglobina no. 577 sigma
Reactivos y muestras
 0,1𝑀 𝐾𝐻2 𝑃𝑂4 + 5 𝑚𝑀 𝐸𝐷𝑇𝐴 𝑎 𝑝𝐻 7,5 KPE

 Solución A: 6.8 g de 𝐾𝐻2 𝑃𝑂4 a 500ml de d𝐻2 𝑂

Almacenar a 4°C
 Solución B: 8,4 g de 𝐾𝐻2 𝑃𝑂4 + 11,4g de 𝐾𝐻2 𝑃𝑂4 . 3𝐻2 𝑂

 Amortiguadora de fosfato 0,1M: 16 ml de la sln A + 84 ml de la sln B (pH

7,5) + EDTA

 Tampón de extracción: 0,1% Tritón X-100 y 0,6% de ácido sulfosalicílico

en KPE.
 2-Vinilpiridina Diluir 1:10 con KPE Almacenar en
 Trietanolamina Diluir 1:6 con KPE hielo
Reactivos y muestras
 GSH estándar: Disolver GSSG estándar:
1mg/ml GSH en KPE Disolver 2,01 mg/ml
Almacenada a -20°C en KPE

Dilución 1:100 = 10µg/ml Dilución 1:200 = 10µg/ml

800 µl con 200 µl de KPE

( [] 26,4 nM/ml )

26,4 nM/ml 13,2 nM/ml 6,6 nM/ml 3,3 nM/ml 0,103 nM/ml
Reactivos y muestras

 DTNB: 2 mg de DTNB en 3 ml de KPE

Volumen según
 NADPH: 2 mg de β-NADPH en 3 ml de KPE necesidad
 GR: 40 µl de GR en 3 ml de KPE

 Muestra: FUENTES: células cultivadas, tejidos, células aisladas de

tejidos y sangre, fluidos biológicos como sangre total, plasma, lavado
broncoalveolar (BAL), líquido cefalorraquídeo (LCR) y orina.
 Procedimiento
 A: Células adherentes:
1000xg/5min/4°C

Cultivarlas hasta Lavar con 2 ml Recolectar con 500 Muestra para el recuento
confluencia del de PBS libre de µl de tripsina-EDTA celular y precipitar por
70 -80% 𝑪𝒂𝟐+ / 𝑴𝒈𝟐+ Neutralizar con 1ml centrifugación
de medio de cultivo
3000xg/4min/4°C
Suspenderlas en Sonicar la Lisación correcta: Centrifugar y transferir a
1 ml de tampón de suspensión en congelar a -70 °C Eppendor. Usar el
extracción en frío. agua helada y descongelar. sobrenadante para medir
Homogenizar. por 2-3 minutos (Repetir) GSH

 B: Células no adherentes:

Recolectar y lavar con 2 ml de Repetir últimos

PBS libre de 𝑪𝒂𝟐+ / 𝑴𝒈𝟐+ pasos
 C: Lisado de eritrocitos:

2500xg/5min/4°C 3000xg/10min/4°C
Suspender el precipitado en 4
Centrifugar 500 µl de Mezclar y centrifugar.
volúmenes de solución de trabajo
sangre entera y Recoger sobrenadante y
de ácido metafosfórico al 5% y
desechar sobrenadante almacenar 0-4 °C x 1hora
mantenerlo a 0-4 °C.

 D: Lisado de hematocitos:

3000xg/10min/4°C
Suspender precipitado en
Homogenizar y centrifugar.
500 µl en solución de
Recoger sobrenadante y
trabajo de ácido
almacenar 0-4 °C x 1hora
metafosfórico al 5%
 E: Células madre embrionarias:

Almacenar 2-3 semanas

Tripsinizar las células, Descongelar y añadir 0,5 Lisar congelando

lavarlas en PBS y ml de acido sulfosalicílico y descongelando
almacenar a -70°C 0,01% de Triton x-100 repetidamente

 F: Tejidos generales:

8000xg/10min/2-4°C
Homogenizar el tejido en
Centrifugar y transferir
una solución de ácido
sobrenadante a un tubo
sulfosalicílico Triton x-100
al 0,6%
 G: Hígado:

3000xg/10mis/4°C

Lavar tejido hepático en Picar y homogeneizar Centrifugar y

solución fría de acido tejido en acido recoger capa
sulfosalicílico metafosfórico al 5% acuosa superior.
Mantener a 0-4 °C

 H: Pulmón

2500xg/10min/2-4°C

Pesar 1g de tejido
Perfusión y Picar y secar en papel
pulmonar y homogeneizar
lavado de Whatmann el tejido
en 10 ml de acido
pulmón. conjuntivo.
sulfosalicílico. Y centrifugar.

Agregar 1 ml de
sobrenadante a 9ml de
tampón KPE.
 I: Contribución de los eritrocitos a lo niveles de GSH en los pulmones

Evaluar contribución. Retirar pulmones y Sonicar glóbulos

Abrir tórax y tomar realizar pasos H . rojos. Medir
muestra de sangre. concentración de
RBC
 J: Plasma/CSF:
8000xg/10min/4°C
1000xg/10min/4°C Transferir capa superior
Centrifugar y
Centrifugar la sangre a un tubo y agregar
transferir a un tubo
con anticoagulantes medio volumen de acido
nuevo
sulfosalicílico al 0,6%

Soluciones sobrantes:
 Medición de GSH, GSSG y GSH total
almacenar a 4°C por 2
semanas.
 Mantener las muestras y estándares NADPH; alicuotarse y
en hielo y los reactivos protegidos almacenar a -20°C.
de la luz DTB no debe tener coloración
alguna.
Método de ensayo GSH para
ensayo en placa de microtitulación
de 96 pocillos.

 Blanco: Añadir 20 µl de KPE al pocillo A

 Añadir 20 µl de cada patrón a los pocillos B-H de la columna 1, añadir 20

µl de muestra a los pocillos A-H de las columnas 2 y 3.

 Añadir 120 µl a cada pocillo de DTNB y GR (60-60 µl )

 Dejar 30 segundos para conversión de GSSG a GSH y añadir 60 µl de

NADPH

 Leer absorbancia cada 30 segundos durante 2 minutos. Cuantificar

Método de ensayo GSSG para
ensayo microtitulación de 96
pocillos.
 Añadir extracto celular de acido sulfosalicilico (100 µl)
a un tubo Eppendor 1,5 ml.
 Añadir 2 µl de 2-vinilpiridina. Mezclar para derivar
GSH.
 Añadir trietanolamina 6 µl y mezclar. Mantener pH en
6-7.
 Medir absorbancia en las mismas condiciones que en
GSH. Blanco: 2- vinilpiridina y trietanolamina.

Figura 1. Placa de
microtitulación de 96 pocillos.
Ensayo GSH Y GSSG por
espectrofotómetro

 Utilizar 100 µl de cada estándar.

 Utilizar como blanco KPE (700 µl ) en una cubeta de 1 ml de cuarzo.

 Mezclar DTNB y GR 120 µl. Esperar 30 segundos y añadir 60 µl de NADPH.

 Realizar ensayo a 412nm durante 2 minutos y registrar la absorbancia: 0 y

después de 1 y 2.

 Blanco de muestra: sin GSH