ROMPIMIENTO DE CELULAS DE LEVADURA POR ALTA

PRESION: USO DE OPERACIONES DE BAJA ESCALA CON

PREDICCION DE LIBERACION DE PROTEINAS Y
DISTRIBUCION DEL TAMAÑO DE RESTOS DE CELULAS.

BARBOSA NAVARRETE IRMA VERONICA

MARIA DE LOS ANGELES CUEVAS HERNANDEZ
NAVARRO GONZÁLES ALMA GUADALUPE
SANCHEZ FLORES HUGO
SEGOVIANO MOSQUEDA JANELLI ALEJANDRA
VILLAFAÑA DIOSDADO MAYRA ALEJANDRA
PROFESOR: Jose Luis López Sanchez
ITESI
 INTRODUCCION
En la industria de procesos bioquímicos del aislamiento de
productos intracelulares como las proteínas y las enzimas a
menudo implican la alteración física de la pared celular en
un homogeneizador de alta presión. La interrupción de la
célula debe ser alcanzada de manera eficiente con el fin de
asegurar la liberación máxima del producto, mientras que al
mismo tiempo, la exposición a condiciones severas en el
homogeneizador debe limitarse a fin de minimizar la
desnaturalización del producto y la formación excesiva de
pequeños fragmentos de restos celulares.
El trabajo se llevó a cabo en un homogeneizador de
alta presión de escala piloto Manton Gau-lin Micron
LAB60, con un caudal fijo de 60 L/h y una presión
máxima de 500 bar. Los cambios en los restos de
células PSD acompañadas por el proceso de ruptura
celular fueron simulados con éxito utilizando dos
parámetros basados en el modelo tipo de Boltzmann
de la ecuación dada por:
 MATERIALES Y METODOS

Todos los productos químicos utilizados son

de BDH Chemicals Ltd. Levadura envasada
(Saccharomyces cerevisiae) se obtuvo de
Distillers Company Ltd.
La levadura se desmoronó y se suspendió en una
solución tampón de K2HPO4 4 mM, y se ajusta
con concentrados NaOH a pH 5,6; el buffer se
mantuvo a 4-7 º C. Los experimentos se llevaron a
cabo con tres concentraciones de células de
levadura. Estas fueron: 1, 10 y 45% peso /
volumen.
Las células se rompieron con una escala de laboratorio
Manton Lab40, un escala-piloto APV Manton Gau-lin
LAB60 y un escala semi-industrial Manton-Gaulin K3
homogeneizador de alta presión.
Los experimentos de ruptura celular se llevaron a cabo como
función de la presión de operación, que se varió en el rango
de 100-1600 bar para el LAB 40 y 100 a 800 bar para el LAB
60 y las unidades de K3.
Toda la levadura y tamaños de partículas de restos
celulares se midieron con una zona de detección
eléctricos (ESZ) método. El instrumento fue un
modelo de 80XY Elzone . El analizador fue equipado
con un tubo de orificio de 30 µm calibrado
utilizando estándares de látex tamaños de 2.02, 5.00
y 10.18 µm para dar un rango de tamaño medido de
1.00 a 15.01 µm dividido en 128 canales.
 En este estudio, más del 99% de la masa total
fue> 1 µm en el tamaño de la gama de
condiciones de homogeneización de estudio.
Si bien la presencia de 1 µm de material
podría influenciar posteriores operaciones
tales como filtración.
 En todos los experimentos, fueron
duplicados para garantizar la coherencia de
los resultados a ± 2,0%. Los datos PSD se
almacenan como archivos ASCII para el
análisis estadístico posterior.
RESULTADOS Y
DISCUSION
La figura muestra los restos celulares y distribución del tamaño de partículas (PSD)
obtenidos para el homogeneizado producido a 500 bar. Con el número de pasadas a
través del LAB 60 homogeneizador como parámetro.
La distribución de tamaño en
cada paso se muestra en
Figura 2 representa a la vez
los restos celulares sin
interrupción de algunas
células enteras. Hay un
desplazamiento hacia
tamaños más pequeños y la
alteracion de la célula . Los
datos de la proteína liberada
confirmó que la liberación total
de proteínas (96 mg de
proteína / g de levadura) se
alcanzado a finales de la
quinta pasada a 500 bares de
presión lo que sugiere que la
mayoría de las células enteras
se vieron interrumpidas al final
del quinto pase.
La Figura 3 muestra una comparación del las
distribuciones del tamano de particulas del
homogeneizador (PSD) obtenidas para el APV
Gau-lin Manton K3, LAB60 LAB Micron y
homogeneizadores de alta presión,
respectivamente. Otros condiciones
experimentales se dan en las parcelas. La
similitud de los PSD para los tres
homogeneizadores representado en las
parcelas indican que dentro del rango de los
parámetros investigados, de formacion de los
desechos celulares es independiente de la
capacidad de rendimiento (Escala de
operación) y del diseño de la cabeza de la
válvula de el homogeneizador.
Estas observaciones son compatibles con datos de liberación de proteínas solubles que
representan en la Figura 4 para las tres unidades
Los resultados indican que para
que una presión fija y el número de
pasadas a través del
homogeneizador, el % de
liberación de proteínas no se ve
afectada por el tipo y la escala de la
operación. La línea continua a
través de los puntos de datos se
obtuvo utilizando la expresión de la
liberación de proteínas
(Hetherington et al., 1971), que
viene dada por (Siddiqi et al., Parte
II, 1996). Donde el la concentracion
es adimensional, y representa en la
medida de la liberación de la
proteína.
Rm es el máximo liberable de concentración de proteínas. En la, el coeficiente k1 es la
velocidad de liberación de proteínas con unidades de bar-2.9
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 El hecho de que las distribuciones
de tamaño de las partículas de
residuo de célula son independiente
de la escala de operación y la
geometría de la sección del
homogeneizador indica que debería
ser posible utilizar las ecuaciones

para simular los cambios en el PSD en función

de la presión de trabajo y el número de pasos a
través de las tres unidades diferentes.
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ecuaciones 1 a 3 b40) para imita r h o m o g e ne iz a d
o (M ic ro n L a
dispositiv
mayor) r) escscala.

debido a la misma presión aplicada y número de pasos, los restos

celulares de PSDs y la liberación de proteínas son similares para
los tres homogeneizadores, es razonable sugerir que el mismo
mecanismo de la ruptura celular se aplica en las tres unidades.
Varios modelos de ruptura celular se han propuesto en la
literatura. Los principales mecanismos dependen del origen de
las tensiones que se supone son responsables de la ruptura
celular.
Interrupción de la célula se ha supuesto que se producen por tensiones que se
originan en el campo de flujo turbulento generado en la brecha de la válvula
de homogenizador. El límite máximo nominal velocidad, uo, en el espacio
creado entre la cabeza de la válvula y el asiento de la válvula se puede
obtener a partir del caudal dominante, Q, la anchura de boquete, h, y el
radio, Ro . Por lo tanto:
 La velocidad, Uo , y la anchura de espacio, h, se puede utilizar para
definir un adecuado número de Reynolds para el flujo a través del
espacio como:

 Normalmente, el contenido de una celula es de aproximadamente

80% de agua (Brookman, 1974), y por lo tanto la densidad de la
suspensión puede suponerse que es de la fase continua.
 La viscosidad, m, de la suspensión de células enteras es una
función de la concentración de células. (Mosqueira et al.,
1981) .

 El aumento de la viscosidad de la suspensión se cree que es

debido a la fragmentación de los desechos de las células y
la liberación de componentes intracelulares solubles, como
las proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos.
 La viscosidad de todas las células empacadas de levadura
a una concentración de 45% w / v es 0.006Pa.s y su
densidad es de 1100 kg / m 3.

 A una concentración celular de 1%, los valores

correspondientes se supone que son los mismos que para
agua (0.001Pa.s y 1000 kg / m 3).

(al Mosqueira y otros., 1981),

  El cambio en la viscosidad es de 600%, mientras que la
densidad es sólo el 10%.
 Los cálculos basado en el flujo del número de Reynolds de
estos datos reveló que la concentración celular de 45%, el
número de Reynolds para el flujo en la válvula del LAB40
y LAB60 fueron 128 y 117, respectivamente, mientras que
en el caso de la homogeneizador K3 el número de
Reynolds fue de 535.
  Phipps (Phipps, 1971; Brookman, 1974) ha
argumentado que para el sistema de interés para
este investigación de flujo puede considerarse
laminar para Re <250, de transición para 250 <Re
<500 y turbulento para Re> 500.
 De acuerdo con los datos en las Figuras 3, 4 y 5,
los cambios en el flujo número de Reynolds
parecen no tener ningún efecto medible en
cualquiera de los restos celulares PSD o la
liberación de proteínas, lo que sugiere que
dependen sobre la existencia de un flujo turbulento
en la válvula principal del homogeneizador.
 Esto se confirma mas por los restos de la
célula PDS, los datos que se muestran en la
Figura 6 para la unidad de LAB40 Micron, en
los que se varió el flujo número de Reynolds
por las concentraciones de células con un
45%, 10% y 1% w / v.
 A medida que disminuyo la concentración del
45% al 1%, el flujo del número de Reynolds
aumento de 128 a 771, pero como se muestra en
la Figura 6, no se pudieron detectar diferencias en
los datos de PSD para las tres condiciones que
corresponden a un cambio de flujo laminar a
turbulento.
 La ruptura de la célula también se cree que
se producen por tensión elongacional que
actúa sobre las células a medida que viajan a
través de la cabeza de válvula.

Shamlou et al. (1995) han argumentado que

estas tensiones surgen en el campo de flujo
junto a la pared del asiento de la válvula y
cerca de la superficie del anillo de impacto.
El campo de flujo en estas regiones se supone
que es aproximadamente hiperbólica y un
modelo de ruptura celular fue propuesto y
probado utilizando una cantidad limitada de
datos experimentales.

Un supuesto clave del modelo es que la

vigente tensión elongacional hace hincapié en
las funciones de la velocidad media a través de
la brecha.
 Además, el trabajo anterior (Keshavarz-Moore
etal. 1990) ha sugerido que la ruptura celular
puede ocurrir por impacto.

A pesar de la retención no puede ser descartado

como un mecanismo de ruptura celular, los
últimos estudios (Shamlou et al., 1995) han
demostrado que este no es el único mecanismo
por el cual puede ocurrir la ruptura de la célula.
 Además, el reciente desarrollo de una
dispositivo de alta presión comercial (Collins
et al., 1996), que se basa casi exclusivamente
en el flujo de la suspensión a través de un
estrecho orificio para lograr la ruptura de
células sugiere que la tensión elongacional
generada por el flujo a través de la apertura
desempeña un papel clave en el proceso de
ruptura celular.
La variación de la anchura de boquete con respecto
a
la presión aplicada por los tres homogeneizadores.
 Estas parcelas fueron obtenidos utilizando las ecuaciones
recomendadas de flujo laminar y turbulento en el válvula de
vacío del homogeneizador, respectivamente (Phipps, 1971 y
1975). Por lo tanto, para el flujo laminar:

Y para flujo turbulento:

Figura 8. Variación de la velocidad máxima a través de la brecha de
los homogeneizadores en función de la presión de operación.
 La figura 8 muestra el cambio en la velocidad máxima, uo, de
la suspensión a través del espacio en función de la aplicación
la presión de los tres homogeneizadores.

 Es interesante observar que si bien existen algunas

diferencias en el valor de la UO,
sobre todo a altas presiones, la variación en uo en un
amplio rango de presión es relativamente pequeña de
las tres escalas de homogeneizadores de estudio.
 Teniendo en cuenta las condiciones de flujo complejo
en el hueco de la válvula, no es razonable concluir
que la velocidad máxima de la suspensión a través de
la brecha es bastante insensible a los cambios en la
escala de operación.
 Además, en el trabajo anterior de los autores
(Shamlou et al. 1996) la tasa de elongación
predominante fue definido por h= uo / D, donde D es
una longitud característica.
Se postuló que la tasa de elongación máxima se
obtiene cuando la dimensión característica fue
reemplazada por el diámetro de la célula.

En esta investigación, ya que la media del diámetro

de las células se mantuvo constante para todas las
geometrías del homogeneizador probadas, es
razonable sugerir que la máxima elongación el estrés
que actúa sobre una célula durante su paso a través de
la válvula cabeza también se vio afectada por los
cambios en la escala de la operación.
 Así, según el modelo de elongación del
rompimiento celular (Shamlou et al. 1995), por
un número fijo de pasos y la presión de
operación en la medida de la ruptura de la pared
celular en los tres homogeneizadores debe ser el
mismo. Esto es apoyado por los datos
presentados en las Figuras 3 y 4.
 Conclusiones
Los datos experimentales actuales obtenidos a partir
de la ruptura comercial de las células de levadura
comprimida en tres diferentes homogeneizadores de
alta presión indican las partículas de restos celulares
respecto a la distribución del tamaño y la magnitud de
la liberación de proteínas solubles difieren
independiente de la escala de operación y de el diseño
de la cabeza de la válvula.
 Conclusiones

 Una ecuación previamente publicada, fue utilizada

con éxito para simular el PSD (distribuciones de
tamaño de partícula) restos celulares obtenidos a
partir de los tres homogeneizadores.
 Conclusiones

Una de las conclusiones prácticas de estas

observaciones es que debe ser posible realizar
experimentos con ruptura de células en un
homogeneizador a escala reducida y con
confianza aplicar los resultados a unidades de
escala mayor, lo que ahorra un considerable
volumen de material requerido para ser
procesado.
 Conclusiones

Los restos celulares PSDs (distribuciones de tamaño

de partícula) y los datos de liberación de la proteína
de los experimentos llevados a cabo en este estudio
también permitió un examen de los posibles
mecanismos de ruptura celular en un
homogeneizador de alta presión.