Universidad de Concepción

Tecnología Médica
Morfofisiopatología y Citodiagnóstico

Alumna: Nicole Fonseca Rivas

Docente: Patricia Grez Spikin
Curso: Microscopía Electrónica
• Desde el inicio de la microscopia electrónica el
estudio celular ha sido uno de los principales
temas de estudio, ya sea de organismos
eucariotas o procariotas, pero la gran piedra de
tope de los estudios, ya sean citoplasmáticos o
sobre ultraestructura celular ha sido el limite de
resolución de los equipos utilizados, tanto así
como los métodos de fijación utilizados y
finalmente por los métodos empleados para
incrementar el contraste.
• La estructura de los componentes de la pared
bacteriana se ha ido describiendo de manera
secuencial y detallada a la vez que se mejoran
las técnicas de estudio.
• Por ejemplo, lo que tradicionalmente se
describió como el espacio periplásmico y como
exclusivo de bacterias Gram negativas, hoy se
describe como periplasma y está constituido
por peptidoglican menos laxo que el del resto
de la pared y este periplasma es común a
bacterias Gram negativas y Gram positivas,
aunque es más prominente en las primeras.
• Los componentes extracelulares, como
glicocálix, son factores de virulencia
importantes.
Funciones del glucocálix:
1- Selectividad en la incorporación de sustancias de bajo peso
molecular a la célula.
2- Reconocimiento específico de células entre sí.
3- Uniones intercelulares y de las células con la matriz extracelular
mediante glucoproteínas transmembrana cómo: integrinas y
catherinas.
4- Propiedades inmunitarias.
5- Anclaxe de enzimas.
6 - Cambios en la carga eléctrica en medio extracelular.
• No obstante con el método convencional de
tinción para Inmunohistoquímica no se
evidencian claramente dichos componentes, es
por tanto q en este trabajo se evaluaran la
técnica convencional versus una técnica
alternativa de fijación que incluye rojo de rutenio
para estabilizar esos materiales extracelulares,
gracias al efecto estabilizador del rojo de rutenio
sobre grupos aniónicos, lo que pone de
manifiesto el glicocálix.
 Pseudomonas Aeruginosa
• Es una bacteria gram-negativa
• Bacilo que se puede hallar solo o en par.
• Es uno de los principales agentes aislados
de infecciones intrahospitalarias, entre
ellas, neumonía asociada a ventilación
mecánica, infecciones urinarias, de piel y
partes blandas
 Cepa de Pseudomonas Aeruginosa
Inoculación e incuvación 37ºC por 24hrs

Recolección de colonias
Y división en partes iguales
Protocolo Protocolo
Suspensión en convencional Modificado
Buffer Fostato pH Suspensión en Buffer
7.2 Cacodilato 0.1mM pH 7.2
1º fijación con Glutaraldehido
2,5% en buffer Fosfato 0,1mM fijación con Glutaraldehido 2,5% en
a pH 7,2 por 2 hrs a 4ºC buffer Cacodilato 0,1mM a pH 7,2 +
Rojo de Rutenio 0,075% y Lisina
Postfijación con Tetroxido de 50mM por 30min a tem. amb
Osmio en buffer Fosfato 0,1mM
a pH 7,2 por 1 Hrs a 4ºC fijación con Glutaraldehido 2,5%
en buffer Cacodilato 0,1mM a pH
Inclusión en coagulo de plasma 7,2 + Rojo de Rutenio 0,075% por
Y sección de 1mm3 100min a tem. amb

fijación con Glutaraldehido Deshidratación en etanol creciente de 30%

2,5% en buffer Fosfato 30min
Lavado en buffer
Postfijación con Tetroxido de
Osmio en buffer Fosfato 0,1mM
a pH 7,2 por 1 Hrs a 4ºC
a 100% por 10 min en c/u a tem. amb
Inclusión en resina SPURR
Tinción con Acetato de Uranilo
Y Citrato de Plomo
 Resultados
• En las muestras fijadas por el método
estándar se obtiene buena información del
citoplasma, pero la membrana
citoplasmática y la pared bacteriana
aparecen poco definidas; además, el
exterior de las bacterias aparece limpio
debido a la pérdida de materiales de
glicocalix (figs. 1 y 2).
 Fig. 1 Fig. 2

Figuras 1 y 2.- Micrografías electrónicas de transmisión,

correspondientes a un corte transversal y otro longitudinal de
Pseudomonas aeruginosa. Muestras procesadas con el método
estándar, utilizando una doble fijación con glutaraldehido
y osmio. Se observa una buena conservación del citoplasma y
pared bacteriana, pero el glicocálix no se evidencia. (Barra=
0.25 μM).
• Por otra parte, cuando se incluyó lisina y
rojo de rutenio en la solución fijadora se
aprecia un mayor contraste, que delimita
mejor los componentes como membrana
citoplásmica, capa de peptidoglican,
periplasma y membrana externa (figs. 3 y
4). Además, externamente a la pared
bacteriana aparece un material amorfo
electrón denso, que corresponde al
glicocálix.
 Fig. 3 Fig. 4
Figuras 3 y 4.- Micrografías electrónicas de transmisión de Pseudomonas aeruginosa. Al fijador,
tanto glutaraldehido como osmio, se agregó rojo de rutenio y lisina. Se aprecia un mayor contraste
y aparece el glicocálix como un meterial electrón denso (flechas pequeñas) rodeando las
bacterias. En la pared bacteriana se aprecian fácilmente los elementos constitutivos. La flecha
grande señala la capa de peptidglican, al lado interno aparece la membrana citoplasmática como
una línea negra y hacia el exterior el periplasma y la membrana externa. (Barra=0.25 μM).
 Discusión
• El método de fijación empleado en microscopia
electrónica más frecuentemente consiste en una doble
fijación secuencial con aldehidos. Generalmente se
utiliza glutaraldehido, en una concentración entre el 1%
y 6% en amortiguador de fosfatos a pH 7.2.
• Tal método ha brindado magníficos resultados para
describir la ultraestructura tanto de células eucariotas
como procariotas. El primer fijador estabiliza
fundamentalmente la matriz proteica de la células y el
segundo los lípidos. Sin embargo, el glicocálix, integrado
fundamentalmente por mucopolisacáridos y localizado
externamente a la membrana o a la pared bacteriana no
se evidencia con esta fijación estándar, por lo que las
células aparecen limpias.
• El método de fijación alterno, que emplea lisina y rojo de
rutenio en buffer cacodilato, el cual estabiliza los polímeros
constituyentes de la cápsula e incrementa su
electrodensidad, lo que facilita la observación al microscopio
electrónico de las estructuras externas a la membrana
citoplasmática (fig 3 y 4).
• En la mezcla de fijación la lisina actúa como agente
estabilizador de la cápsula y glicocálix. Además, tiene la
habilidad de formar largos polímeros cuando reacciona con
glutaraldehido, produciendo puentes cruzados, confiriendo
gran estabilidad a los constituyentes capsulares durante el
proceso de deshidratación y aumentando la electrodensidad
de la preparación. Por otro lado, el rojo de rutenio se une a
grupos aniónicos y sirve de receptor para el osmio, lo que
en última instancia se traduce en un aumento de la
electrodensidad en el glicocalix, lo que se evidencia en los
resultados obtenidos. Por lo tanto, recomendamos la
inclusión de lisina y rojo de rutenio en la fijación de
suspensiones.
 Bibliografía y Linkografía

• Comparación de dos métodos de fijación para la

estabilización de glicocálix bacteriano. Rev Biomed
1998; 9:7-11.
• Microbiología Médica, 5º edición, Patrick R. Murray,
editorial Elsevier Mosby.
• http://bases.bireme.br/cgi-bin/wxislind.exe/iah/online/?
IsisScript=iah/iah.xis&src=google&base=LILACS&lang=
p&nextAction=lnk&exprSearch=2346&indexSearch=ID
• http://www.elergonomista.com/biologia/cit12ma.htm
• http://www.microbiologia.org.mx/microbiosenlinea/CAPIT
ULO_06/Capitulo06.pdf