Separación y Procesos

Biotecnológicos

BT56A-IQ742
 Clases
CATEDRA
LUNES 12:00-13:30
VIERNES 12:00-13:30
AUXILIAR
Miércoles 14:30-16:00
Ejercicios todas las clases

FECHA DE CONTROLES:
• CONTROL 1: Miércoles 31 de agosto
• CONTROL 2: Miércoles 5 de Octubre
• CONTROL 3: Miércoles 9 de Noviembre
 Programa
Recuperación de Proteínas
Separación Sólido-Líquido:
• Centrifugación
• Filtración
– Coagulación
– Floculación
• Procesos de Membrana
– Micro filtración
– Ultra filtración
– Diálisis
 Rompimiento de Células
– Métodos Mecánicos
• Homogenizadores
• Molinos de Bolas
– Métodos No Mecánicos
• Solventes
• Álcalis
• Enzimáticos
Concentración de Proteínas
– Precipitación
• Selectiva
• No selectiva
– Extracción Líquido-Líquido
 Purificación de Proteínas
• Técnicas Cromatográficas
– Adsorción, Adsorción en Columnas
– Teoría de Cromatografía de Proteínas
• Cromatografía de Filtración por Geles
• Cromatografía de Intercambio Iónico
• Cromatofocusing
• Cromatografía de Interacción Hidrofóbica
• Cromatografía de Fase reversa
• Cromatografía de Afinidad
• Cromatografía de lecho expandido
Técnicas Electroforéticas
• Electroforesis
• Isoelectroenfoque
• Diseño de Procesos de Separación
• Cultivo de Células Animales y Vegetales
• Procesos Biotecnológicos
• Industria Biotecnológica de Proteínas

Material del Curso

En U_ Cursos
 Evaluación

• 3 Controles y Examen (Nc)

• Ejercicios y Tareas (Ne)
• Actividades de Laboratorio

• NF = 0.85 Nc+0.15 Ne
 Bibliografía

1. Scope R.K "Protein Purification: Principles and Practice" 3er Edición,

Spingerm 1994
2. Harris E.L. and Angal S. "Protein purification methods: A practical
approach" 1ª Edición, IRL Press, 1989
3. Belter P., Cussler E.L. and Hu Wei Shou "Bioseparations : Dowstream
Processing for Biotechnology":, John Wiley and Sons , 1988.
4. Doran M." Bioprocess Engineering Principles", Academic Press,
1995.
5. Asenjo J.A. "Separation processes in Biotechnology", Marcel Dekker,
1990
6. Tejeda, R.M.Montesinos, R.Guzman "Bioseparaciones", Editorial
Unison, 1995.
7. Ahuja S “Handbook of Bioseparations”, Academic Press, 2000.
 Clases

Material
En U Cursos
DEBEN TRAER EL MATERIAL

Presentar la materia
Hacer Ejercicios para aplicarla
Introducción
 INTRODUCCION

• La biotecnología ha avanzado en los últimos años.

• La oferta de empresas en el área de ingeniería genética son
generalmente reportados en las páginas financieras,

=> Esto implica un futuro promisorio para el área.

 Producción Mundial y Valores de Mercado de Productos Proteínicos Típicos

Categoría Fuente de Proteína Producción Precio Aproximado

proteína Anual (t) (£/t)

Nutricional Soya Harina de soya > 2·107 130

Funcional Soya Aislado soya > 105 1500

Suero de Leche Proteína de 500 3000 - 6000

suero de leche

Reactivo Almidón Amilasas 600 15000-30000

Tejido Animal Renina 60 108

Salud Azúcar Hormona de 20 kg 1010

crecimiento
humano

Suero Bovino Anticuerpos 10 kg 3·109

monoclonales
 La biotecnología se refiere a cultivos:

» Microbianos
» Células animales
» Plantas
» Virus

Para producir productos útiles para los humanos y que

generen ganancias a los inversionistas
 ANTECEDENTES

Los primeros productos “biotecnológicos” se conocen desde

4000 a.C. cuando se producían pan, queso y yogurt.

La definición de biotecnología proviene de aproximadamente

100 años atrás. Se orienta principalmente a productos orgánicos
generados por fermentaciones.
Acetona (Industria de municiones I Guerra Mundial).
Ácido cítrico y glutámico.
Antibióticos acaparó toda la atención, resultando el producto más importante
de la biotecnología, este metabolito secundario produjo grandes beneficios.
 Esquema general de la producción de productos biotecnológicos

Fermentación Cosecha Disrupción Separación Desechos

Proteínas Concentración
60 - 70 g/l Agua

Downstream processing (DSP)

Preacondicionamiento Purificación de
Pulimento
alta resolución
 Características de la bioseparación

La separación de los productos biotecnológicos resulta

relativamente más difícil que las separaciones en la
ingeniería química convencional, ya que las moléculas que
se separar resultan ser extremadamente frágiles y de
propiedades fisicoquímicas y bioquímicas muy similares
entre ellas.
Cualquier empresa que trabaje en la producción de
bioproductos, trabaja con alrededor de 200 compuestos
diferentes, mientras que la empresa petroquímica sólo
trabaja con alrededor de 10 compuestos.
 Parámetros típicos relacionados con DSP

Productos Antibiótico Enzima Proteínas

Químicos Terapeúticas
Concentración en el 100 - 120 10 - 40 1-5 0.1 - 5
medio (g/l)

Contaminación Baja Baja Baja Alta

Tiempo de 12 - 24 10 - 24 6 - 12 1+
procesamiento (h)

Purificación Alta Alta Baja Muy alta

Producción/lote (kg) Hasta 24000 Hasta 8000 Hasta 400 Hasta 3+

DSP por lote Continua Continua Continua Usualmente

Número de etapas 5 - 10 5-7 3-6 8 - 14

DSP
 Composición de una Corriente de Entrada a DSP

Componente Concentración Comentario

Agua 900 + g/l Mayor costo de separación para
productos de bajo valor
Materia celular 20 - 100 g/l Desecho, reciclado o producto

Producto Hasta 120 g/l

Sales inorgánicas Trazas hasta 10 g/l Usualmente removidas con el medio

Proteínas (no producto) Trazas hasta 3 g/l Problema de remoción mayor con
productos enzimáticos intracelulares

Acidos nucleicos Trazas hasta 6 g/l (ICP) Problema de remoción mayor para
proteínas intracelulares o productos
enzimáticos
Polisacáridos 1% + (ICP) Usualmente removidos con el
medio, medios residuales
Productos orgánicos Trazas en bajo De materias primas (por ejemplo,
(color) contenido melaza) y los microorganismos
mismos
Sólidos orgánicos Bajo contenido
Del medio
Productos Biotecnológicos de Interés
– Biomasa
–Levadura Hongos
–Bacterias
–Virus
– Adenovirus Herpes virus
– Retrovirus Baculo virus
– Adenoasociados
– Metabolitos
– Alcoholes Antibióticos
– Ácidos
– Proteínas
 PProcesos de Producción de Bioproductos
¿ Qué se desea?
Desde una suspensión diluída se desea un productos biotecnológico
con:

- Máximo rendimiento R = Pf/Pi

Pf: Concentración Producto Final
Pi : Concentración producto inicial

- Máxima Pureza Pureza = Pf / S P

S P: Sumatoria de la concentración de todos los compuestos presentes

- - Producto con propiedades funcionales

Cumpliendo las condiciones de: Costo Razonable, dado que los

costos de proceso son muy caros, siendo un porcentaje bastante
significativo los equipos.
 Diseño del Proceso de recuperación y purificación
(Downstream processing DSP)
Para el diseño del DSP se debe conocer las respuestas a las siguientes
preguntas:

¿ Cuál es el precio del producto?

¿ Cuál es el nivel de producción?
¿Dónde está el producto en cada etapa?
¿Cuáles son las propiedades fisicoquímicas y/o
bioquímicas que diferencian al producto de sus
contaminantes?
¿Cuál es el costo de las diferentes alternativas del
DSP?
¿cuál es la eficiencia de cada etapa?
Preguntas ????
 Proceso de producción de Biomasa

• Crecimiento de la Biomasa (Fermentación)

• Separación de la biomasa del medio de
cultivo.
• Secado y post-tratamientos
• Almacenamiento de la biomasa
 Flowsheet Producción Biomasa

Gas Out

A FL N -1 0 2 / A F -1 0 2

W a te r A ir F iltra tio n

H S R L -1 0 1 / S T -1 0 1
S -1 0 7
H e a t S te riliza tio n
S -1 0 6
N u trie n ts

A m m o n ia
S -1 1 3
B L N D -1 0 1 / V -1 0 1
B le n d in g

F R M N -1 0 1 / F -1 0 1
S T R G -1 0 1 / V -1 0 2
F e rm e nta tio n
A ir S to ra g e
S -1 0 1

C M P S -1 0 1 / G -1 0 1 S -1 0 8 A FL N -1 0 1 / A F -1 0 1

C F C o m p re sso r A ir F iltra tio n

S -1 0 2
S -1 1 4
S -1 0 9
S -1 0 3

C FG N -1 0 1 / D S -1 0 1 S -1 1 5
S -1 1 2
D is k -S ta c k Ce n trifu g a tio n
S -1 1 6
F B D N G -1 0 1 / F B D -1 0 1 S -1 1 8
R V F L -1 0 1 / R V F -1 0 1 F IL L -1 0 1 / F R -1 0 1
S -1 0 4 F lu id B e d D ryin g F illin g
R o ta ry V a c u u m F iltra tioSn-1 0 5 S -1 1 7 B O X -1 0 1 / B X -1 0 1
B o x in g
 Proceso de producción de Virus
• Crecimiento de Células empaquetadoras
• Infección de Células empaquetadoras
• Crecimiento de Células empaquetadoras
infectadas
• Recuperación de Células empaquetadoras
• Rompimiento de las células (según virus)
• Separación de los debris celulares
• Purificación de los virus
• Almacenamiento de los virus
Producción y Purificación de Adenovirus
 Método Tradicional de Purificación :
CsCl Gradiente + Diálisis

Centrifu- Dialisis
gacion
+
Recuperación
Adenovirus
Adenovirus
Gradiente de Puro
CsCl
 Método Propuesto de Purificación
Dos Fase acuosas + Cromatografía

PEG PEG
+
Sal Sal Adenovirus
Recuperación
Puro
Adenovirus
ATPS Cromatografía de
Intercambio Iónico
 Proceso de producción de
Metabolitos
• Crecimiento de la Biomasa (Fermentación)
• Separación del metabolito de la biomasa.
• Tratamiento y purificación del metabolito
• Almacenamiento del metabolito
 Producción de Ácido Cítrico

S -1 2 0
C-Source

Water 1 A FL N -1 0 2 / A F -1 0 2
A ir F iltra tio n
S -1 1 9
B L N D -1 0 1 / V -1 0 1 S -1 0 2
H S R L -1 0 1 / S T -1 0 1
B le n d in g S -1 1 7
H e a t S te riliza tio n
S -1 1 3
Biomass

S -1 2 1

S -1 0 1
S T R G -1 0 1 / V -1 0 3 R V F L -1 0 1 / R V F -1 0 1

F R M N -1 0 1 / F -1 0 1 S to ra g e T a n k R o ta ry V a c u u m F iltra tio n

F e rm e n ta tio n

Air S -1 1 5 A FL N -1 0 1 / A F -1 0 1
A ir F iltra tio n S -1 1 8
C M P S -1 0 1 / G -1 0 1
C F C o m p re sso r

S -1 2 3
S -1 3 3 S -1 2 8
S -1 2 9
Sulfuric Acid
Gypsum S -1 3 1
S -1 2 5

S -1 2 2
S -1 2 6 Lime
S -1 3 0
R V F L -1 0 3 / R V F -1 0 3 R V F L -1 0 2 / R V F -1 0 2
P ro d u c to C CR N -1 0 1 / R -1 0 3 S -1 2 4 R X N -1 0 1 / R -1 0 1
R o ta ry V a c u u m F iltra tio n
C o n t. C rysta lliza tio n
R X N -1 0 2 / R -1 0 2 S-127 R o ta ry V a c u u m F iltra tio n
P ro d u c t P re c ip ita tio n
G yp s u m F o rm a tio n
Proceso de producción de
proteínas
 Caldo de Fermentación
Con Células Sin Células
•Células inmovilizadas
•Células retenidas
Separación de Células
Células

Rompimiento Células

Separación Material
Intracelular (Desechos)
Sobrenadante
Precipitación Ácidos
Nucleicos, Proteasas

Tratamiento de cuerpos
incluidos
Concentración

Purificación Alta
Resolución

Permite
Refinamiento •Altos niveles de pureza
•Estabilidad del producto
Efecto de la eficiencia de cada etapa
100.0

80.0
% Recuperación

60.0

40.0

20.0

0.0
0 1 2 3 4 5 6
Número Etapas

95% 80% 70% Eficiencia

REGLAS HEURISTICAS PARA EL
DISEÑO DE SISTEMAS DE
SEPARACION
 Reducción de la Carga de Separación
Regla 1
"Mientras sea posible, reducir la carga o flujo másico de
separación por medio de división y mezclas de corrientes".
Mezcla
División

Carga División = 0 ton/día Carga Mezcla= 0 ton/día

 Secuenciamiento de Operaciones
Heurística:
Siendo todos los compuestos similares, intente
separar los más abundantes primero.

Ejemplo 2:
Se tiene un caldo de proteínas que contiene un 50% de
lisozima, 20% ovalbúmina, 15% conalbúmina, etc.
¿Cuál separaría primero?
"Siendo el resto igual, desechar aquellas
separaciones que involucren especies que no están
normalmente presentes en el proceso. Sin embargo,
si se adiciona una especie extraña, se debe remover
inmediatamente después de ser utilizada".

“Remover primero las especies corrosivas”