FACTORES AMBIENTALES

QUE AFECTAN EL
CRECIMIENTO, DESARROLLO
Y REPRODUCCION DE
MICROORGANSMOS.
 TINCIONES

 La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen

alguna afinidad específica por los materiales celulares.
 Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas
cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con
los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los
ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos.
 COLORANTES CATIONICOS

 azul de metileno, el cristal violeta y la safranina

 ANIONICOS

 eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo

 LIPOSOLUBLES

 Los colorantes de este grupo se combinan con los materiales

lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la localización
de las gotículas o depósitos de grasa. Un ejemplo de colorante
liposoluble es el negro Sudán.
 LOS MORDIENTES

 Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula

haya sido tratada con otra sustancia química, que no es un colorante
por sí mismo.

 El ácido tánico.

 El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera

de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante.
 TINCION NEGATIVA

 Las células se dejan sin teñir, pero se colorea en cambio el medio

que las rodea
 PREPARACIÓN DE UN
FROTIS

 Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota

del material que se va a teñir (si es líquido) o se hace rodar el hisopo
con que se tomó la muestra.

 Este material es suspendido en una gota de agua o solución salina

previamente colocada sobre el portaobjetos.
 TINCIÓN SIMPLE

 Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructuras

celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul Metileno
de Loeffler, Azul de lactofenol).

El Hidróxido de potasio al 10% (solución de

KOH) permite ver elementos de hongos ya que
el KOH digiere parcialmente los componentes
proteicos, por ejemplo de la célula huésped, pero
no actúa sobre los polisacáridos de las paredes
celulares de los hongos.
 La tinta china o
Nigrosina permite
observar células
levaduriformes capsuladas
(Cryptococcus), sobre todo
en LCR
 TINCIÓN DIFERENCIAL

 Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructuras celulares

se diferencian en función de los diferentes colorantes que fijan de
acuerdo con su propia constitución química
SIN TINCIÓN

 Es el montaje directo
húmedo o examen en
fresco: las muestras se
extienden directamente
sobre la superficie de un
portaobjetos para su
observación
 RODAMINA-AURAMINA

 Los ácidos micólicos de las paredes celulares de las micobacterias

poseen afinidad para los fluorocromos auramina y rodamina.
 Estos colorantes se fijan a las bacterias, que aparecen de color amarillo
o naranja brillante contra un fondo verdoso.
 El permanganato de potasio, empleado como contraste, evita la
fluorescencia inespecífica. Todos los microorganismos ácido-alcohol
resistentes, incluyendo los esporozoarios parásitos, se tiñen con estos
colorantes.
 NARANJA DE ACRIDINA

 El naranja de acridina ha sido empleado como colorante vital, que

da una fluorescencia verde si el microorganismo está vivo y roja si
está muerto
 ZIEHL -NEELSEN (BAAR)

 El frotis se tiñe durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando

calor suave. Lavar con agua. Decolorar con alcohol etílico 95% con
un 3% de ClH concentrado. Lavar y teñir durante 30-60 seg con Azul
de Metileno (color de contraste). Lavar y secar
BLANCO DE CALCOFLÚOR

 Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de

calcoflúor aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos
y otras muestras
 TEMPERATURA

 La temperatura afecta el crecimiento y la supervivencia de los

microorganismos.

 A medida que la temperatura se eleva las reacciones químicas

enzimáticas de la célula son más rápidas y el crecimiento se acelera
hasta un cierto punto. INACTIVACION
 TEMPERATURAS
CARDINALES O
FUNDAMENTALES.
PSICROFILAS
 PSICROFILAS.
CHLAMYDOMONAS
NIVALIS
 CLASES DE
MICROORGANISMOS
SEGÚN T ° CARDINALES.
 ESCHERICHIA COLI

 Mesófila

 39 °C?

 8°C?

 48°C?
PH.
ACTIVIDAD DEL AGUA.
OXIGENO
 MICRONUTRIENTES

 Cobalto: síntesis de la vitamina B12

 Cinc: papel estructural en muchas enzimas (ADN y ARN
polimerasas, proteínas de unión a ADN…)
 Molibdeno: necesario para la actividad de algunas enzimas
(Flavoproteínas, nitrogenasa, nitratorreductasa, sulfito oxidasa…)
 Manganeso: activador de muchas enzimas
 Cobre: grupo prostético de enzimas respiratorias
FACTORES DE
CRECIMIENTO
 PRINCIPIOS DE CULTIVO
MICROBIOLÓGICO

 Facilitar el crecimiento y el aislamiento de las bacterias presentes

en una muestra clínica.

 Determinar qué bacterias entre las que se desarrollan tienen más

probabilidades de ser las causantes de la infección y cuales son sus
posibles contaminantes o colonizadores.

 Obtener un desarrollo suficiente de las bacterias de importancia

clínica para permitir su identificación y su caracterización.
 DEFINICIÓN
 Sustrato sólido, líquido o semisólido que contiene todos los
nutrientes necesarios para el crecimiento y desarrollo de los
gérmenes.

 Fuentes de energía, carbono, nitrógeno, fósforo, azufre y

varios minerales.
 pH
Luz
Temperatura
 Esterilidad absoluta (salvo excepciones)
 Recipientes adecuados
Es importante destacar que la transición exitosa de un microorganismo in vivo a un
ambiente in vitro va a depender de:
Disponibilidad de nutrientes esenciales

Condiciones ambientales adecuadas

pH

Temperatura

Oxígeno y CO2

Presión

Luz
 SÓLIDOS

LÍQUIDOS

SEMISÓLIDOS

Clasificación de los medios de

cultivo según consistencia
semisólido
Caldo nutritivo

Caldos de enriquecimiento

Caldos revitalizadores
 Enriquecimiento

Nutritivo

Selectivo y
diferencial

Clasificación de los medios de

cultivo según utilización
MEDIOS NUTRITIVOS

Contienen nutrientes que

favorecen el desarrollo de la
mayoría de los microorganismos
sin requerimientos especiales de
cultivo.

No promueven el crecimiento
de ningún agente en particular
MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO
MEDIOS SELECTIVOS

Contienen uno o más agentes que inhiben el

crecimiento de los microorganismos que no se quieren
estudiar

Agentes inhibidores: colorantes, sales biliares,

alcoholes, ácidos y antibióticos
 MEDIOS DIFERENCIALES

Contienen un factor o factores que permite que las colonias de

una especie o un tipo bacteriano exhiban ciertas características
metabólicas o de cultivo que puedan utilizarse para
diferenciarlas de otras bacterias que crecen en el mismo agar
MEDIOS ESPECIALES

MEDIOS CROMÓGENOS

MEDIOS DE TRANSPORTE

MEDIOS DE CONSERVACIÓN
Sustancias cromogénicas:
- Son productos químicos de síntesis que son incoloros cuando
se unen a sustratos naturales por enlaces que son hidrolizados por
enzimas microbianas específicas.
- Cuando la enzima microbiana hidroliza el enlace, se libera el
compuesto cromogénico, que adquiere un color intenso.
- Ejemplo: Cromo agar (agentes uropatógenos), se pone en
evidencia la actividad enzimática de la B- glucoronidasa o B-
galactosidasa de las bacterias formándose colonias de diferentes
colonias según la especie.
- Identificación presuntiva, haciendo innecesaria la realización
de pruebas bioquímicas.
Medios para bacterias no exigentes
- agar
- extracto de carne
- peptona
- NACL
- leche descremada (congelar cepas)
 CONTROL DE CALIDAD

 El Control de Calidad en la preparación y evaluación de los

medios de cultivo es considerado como una esencial y buena
práctica de laboratorio, necesaria para mantener el nivel y la ejecución de
cualquier técnica microbiológica.

Proceso continuo que se extiende desde las materias primas ; a

través del productor hasta el producto final utilizado en los
diferentes departamentos de análisis y diagnóstico microbiológico.
▪ Recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés (Productividad)
▪ Inhibición o suspensión de los microorganismos no deseados.
(Selectividad)
▪ Propiedades bioquímicas (diferenciales y diagnósticas)
▪ Propiedades físicas (por ejemplo, pH, Volumen)
▪ Sea estéril .... etc.

 El Jefe inmediato responsable del área

* Deberá analizar mensualmente los resultados de las pruebas realizadas por el
responsable del departamento de control de calidad
* Evaluará el cumplimiento de objetivos a través de los resultados
CRITERIOS DE EVALUACIÓN DE LA CALIDAD
DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS PREPARADOS.

Se evalúa utilizando criterios objetivos del medio respecto a:

 La recuperación o supervivencia de los microorganismos de interés
 La inhibición o supresión de los microorganismos no deseados tiene que ser
cuantitativa
 Los atributos ( por ejemplo: Propiedades físicas y bioquímicas)
 Rajadura del plato o envase
 Variaciones en el volumen del medio
 Hemólisis
 Cristales en el medio
 Presencia de burbujas
 Presencia de coágulos
 Cambio de color normal
 Contaminación
 Falla en la inhibición de microorganismos saprofitos
 Esterilidad
PRUEBAS FUNCIONAMIENTO
 Para evaluar cada lote de medio de cultivo que sea recibido
en el laboratorio, se emplean cepas patrones (ATCC) de varios
géneros y especies de acuerdo al medio de cultivo a analizar.
 El control del funcionamiento consistirá en comprobar:
 capacidad del medio de recuperar un bajo número de
los microorganismos más sensibles para los que ha sido
preparado.
 capacidad de inhibir un alto número de los
microorganismos que deben ser inhibidos en caso de
los medios selectivos y
diferenciar los microorganismos para los que ha sido
diseñado en caso de los medios diferenciales.
 RECONSTRUCCIÓN DEL MEDIO DE
CULTIVO
DESHIDRATADO
• Cumplir con las instrucciones de preparación del medio de cultivo indicado en
la etiqueta del envase

• Cumplir con los procedimientos técnicos de fórmulas enviadas por el cliente

• Utilizar agua destilada de calidad

• Determinar el pH del M de C

• Esterilización del medio de cultivo

• Procedimiento escrito

• Control de esterilidad del Medio de Cultivo

AGAR INFUSION DE CARNE
MEDIO DE LOWENSTEIN
JENSEN
AGAR SANGRE
 ERRORES EN LA PREPARACIÓN

Apelmazamiento del producto deshidratado

 DEFECTO
 El envase no fue cerrado correctamente después de su
uso.
El envase permaneció
Apelmazamiento del abierto por largo rato.
El producto
Producto sobrepasó la fecha de vencimiento.
deshidratado

El valor de pH no coincide con el indicado

• No fue empleada agua destilada

• El medio fue sobrecalentado durante su preparación
• El Ph no fue determinado correctamente
•El El
valor de pH estaba
medio no coincide
vencido.
 Con el indicado
Aparición de turbiedad o precipitados:

 El medio preparado perdió agua por evaporación

 El medio se calentó en exceso

 El medio no se calentó lo suficiente.

 No fue empleada la cantidad del medio o suplemento recomendada.

El color del medio no coincide con el indicado:

 El medio fue sobrecalentado durante su preparación.

 El pH no fue ajustado correctamente.

 El recipiente empleado estaba sucio.

 Los azúcares contenidos en el medio se caramelizaron

El gel se obtiene más blando que lo característico para el medio:

 No fue garantizada la disolución total del agar durante la preparación del medio.
 No fue empleada la cantidad del medio recomendada o se añadió agua en exceso.

El crecimiento de los microorganismos es

pobre:

 El medio fue sobrecalentado

 El valor del pH no fue ajustado correctamente.
 La adición de suplementos al medio se efectuó a excesiva temperatura.
 El medio no fue mezclado correctamente.
El crecimiento de los microorganismos es atípico:

 Quedaron residuos de sustancias inhibidoras del crecimiento no

deseables, en los recipientes donde se preparó o distribuyó el medio.

 El medio de cultivo fue preparado de manera incorrecta.

 El producto sobrepasa la fecha de vencimiento.

 ES, POR LO TANTO, MUY IMPORTANTE
QUE EL TECNÓLOGO MÉDICO SEA QUIEN
SUPERVISE Y CONTROLE TODOS LOS
FACTORES NECESARIOS EN LA
PREPARACIÓN Y CONSERVACIÓN DE LOS
MEDIOS DE CULTIVO, PARA ASÍ LOGRAR
AISLAR E IDENTIFICAR CON
EXCELENCIA LOS DISTINTOS AGENTES
MICROBIANOS.
Microbiología, Prescott´s
Microbiología, Prescott´s
Los métodos de siembra se utilizan para
inocular por distintos métodos sobre un medio de
cultivo apropiado una muestra que contenga
bacterias con el fin de reproducirlas para
aumentar el número de individuos de la
población y formar colonias en el caso de medios
sólidos.
I. Siembra con rastrillo

II. Siembra con asa de cultivo

- Diseminación en superficie
- Agotamiento en superficie
- Tubos en superficie
- Tubos en profundidad o picada

III. Siembra con tórula

 Figura 12: Siembra con rastrillo
Manual de microbiología 2011, U. Mayor
Figura 13: Siembra de diseminación en
superficie
Manual de microbiología 2011, U Mayor
Figura 14: Siembra semi-cuantitativa de
agotamiento en superficie.
Manual de microbiología 2011, U Mayor
 Figura 15: Siembra de tubo en superficie.

Manual de microbiología 2011, U Mayor

 Figura 16: Siembra de tubo profundidad.

Manual de microbiología 2011, U Mayor

 Pared celular bacteria gram positiva y
gram negativa
Gram positiva Gram negativa
Gram negativa

de Braun
Gram positiva
 1 minuto 1 minuto

Decolorar 30
con alcohol- 15segundos segundos
acetona
 DIRECTOS

Primera aproximación al
posible diagnóstico
Técnicas rápidas y
baratas
Diagnósticos rápidos y
certeros
 EXAMEN AL FRESCO
MATERIA GENITAL

Secreción
Semen, Orina de
vaginal
secreción primer
y/o
prostática chorro
uretral
LEVADURAS

BACTERIAS

CLUE CELLS

LEUCOCITOS

TRICHOMONAS
 TIPOS

 CULTIVO PURO

 CULTIVO MIXTO

 CULTIVO CONTAMINADO
 CULTIVO PURO

 El modo de obtener estos cultivos consiste en obtener colonias

aisladas, que provienen de una sola célula.
 CARACTERÍSTICAS DE LOS
CULTIVOS PUROS:

 Las colonias deben ser iguales en forma, tamaño y color.

 Que no existan formas inhibidas.

 Al microscopio deben tener un aspecto común.

 Tienen que tener iguales propiedades tintoriales.

 Deben ser bioquímica y fisiológicamente igual

 SIEMBRA PARA
AISLAMIENTO:

 La finalidad de este tipo de siembras es la de obtener cultivos

puros. Se siembra en placa de Petri que contienen medios de cultivo
sólidos.

 Existen varios tipos de siembras para aislamiento: Siembra en

estría o zig-zag, siembra por estría múltiple, siembra de los cuatro
cuadrantes, siembra de los tres giros.
POR AGOTAMIENTO
 ESTRÍA ÚNICA

 Depositamos la muestra lo más alejado de nosotros y realizamos la

siembra en forma de zig-zag. De esta forma vamos descargando la
muestra del asa.
 ESTRIADO SOBRE CUATRO
CUADRANTES:

 Se utiliza cuando queremos conservar

algún microorganismo que nos interesa.
Consiste en sembrar uno a uno los
cuadrantes, sin flamear el asa entre estría y
estría, de tal forma que en el cuarto
cuadrante, al ir agotando la muestra del asa,
tendremos los microorganismos aislados.
 M É T O D O D E S I E M B R A PA R A
AISLAMIENTO POR DILUCIONES
S U C E S I VA S

 Consiste en diluir una

muestra hasta conseguir
muy pocas células que, tras
inocularse en un medio de
cultivo, generen colonias
aisladas.
 N=C • 1/D • 1/I

Dónde:
 N es el número de microorganismos presentes en la muestra
 C es el número de colonias contadas UFC (unidades formadoras de
colonias)
 D es la dilución
 I es el inóculo
 Debe haber entre 30 y 300 colonias. Si hay menos, no es significativo
(puede tratarse de una contaminación) y, si hay más, no están aisladas.
TÉCNICA DE SUPERFICIE
 TÉCNICA DEL CULTIVO
POR ENRIQUECIMIENTO

 Consiste en ajustar las condiciones de cultivo para seleccionar el

microorganismo que nos interesa aislar.
 Ejemplo: nos interesa aislar bacterias fotoautótrofas. Tomamos un
matraz con agua y sales y lo incubamos a la luz, de manera que crezcan las
bacterias fotoautótrofas. Ejemplo: queremos aislar bacterias
quimiolitótrofas del azufre; ponemos azufre, CO2 como fuente de
carbono (disuelto en agua) e incubamos en la oscuridad para eliminar
fotoautótrofos.
 CONSERVACIÓN DE
CULTIVOS PUROS

 Almacenamiento a temperaturas bajas. Ponemos las bacterias con

glicerol al 20 - 50% a -70º y podemos mantenerlas así durante años y
décadas.

 Liofilización
 CULTIVOS MIXTOS

 En un cultivo mixto, viven muchas y diferentes especies de forma

conjunta.