INTRODUCCIN

1. Espectrofotometra
2. Determinacin de protenas

A.Lowry
B.UV
 PLANTEAMIENTO DEL
PROBLEMA

La mayora de los problemas analticos reales

comienzan con una compleja mezcla a partir de la
cual es necesario aislar, identificar y cuantificar uno
o ms componentes de la misma.

Se pueden plantear las siguientes cuestiones:

A) de carcter cualitativo: de qu componente se
trata?,
B) de carcter cuantitativo: cunto hay de ese
componente?

Determinacin cualitativa y/o

cuantitativa
Mtodo instrumental de anlisis, como
es la espectrofotometra para medir
la absorcin de radiacin ultravioleta y
visible que interacta con la materia
(tomos y molculas).
tcnica considerada como cuali y
cuantitativa basndose en la medicin
del color o de la longitud de onda de
una radiacin e intensidad de la misma.
La luz del sol y sus
componentes
Desde el siglo XVII sabemos,
con los trabajos de Newton y
Huygens, que la radiacin
luminosa, la luz, se desva al
atravesar un medio de
densidad distinta, como el
agua. Sufre una dispersin.
As, cuando la luz blanca que
procede del sol atraviesa gotas
de lluvia, esta se desva, y sus
componentes, que son las de
luz de color rojo, naranja,
amarillo, verde, azul, ail y
violeta, se separan formando el
arco iris.
Emisin y radiacin
Cmo medir la radiacin emitida o la
radiacin absorbida por los
cuerpos?.
Un aparato capaz de obtener el espectro de una
radiacin, es decir, de separar la radiacin en sus
componentes, se llama un espectroscopio.
Si el aparato es capaz de fotografiarla se llama un
espectrgrafo, y
si es capaz de medirla diremos que se trata de un
espectrmetro.
Cuando es capaz de medir tambin la intensidad de
la radiacin, se llama espectrofotmetro.
 ESPECTROFOTOMETRA
Definicin
Mtodo de anlisis ptico ms usado en las
investigaciones biolgicas.

El espectrofotmetro es un instrumento que

permite comparar la radiacin absorbida o
transmitida por una solucin que contiene una
cantidad desconocida de soluto, y una que contiene
una cantidad conocida de la misma sustancia
 ESPECTROFOTMETRO
Un espectrofotmetro tpico posee cuatro
componentes bsicos:
1. una fuente de radiacin que tiene intensidad
constante en el rango de longitud de onda que
cubre ( usualmente es lmpara de tungsteno para
luz visible,y deuterio para ultravioleta),
2. un compartimiento para la muestra,
3. un monocromador que separa la banda de
longitud de onda deseada del resto del espectro y la
dispersa al compartimiento de la muestra, y
4. un fotodetector, que mide cuantitativamente la
radiacin que pasa por la muestra.
ESPECTROFOTMETRO
LUZ VISIBLE
Es una regin muy
estrecha pero la ms
importante, ya que
nuestra retina es
sensible a las
radiaciones de estas
frecuencias.
A su vez, se subdivide
en seis intervalos que
definen los colores
bsicos (rojo, naranja,
amarillo, verde, azul y
violeta).
Espectrofotmetro
La luz monocromtica atraviesa la muestra, y llega al detector.
Las mediciones fotomtricas se hacen en base a la relacin
entre la potencia de luz que alcanza al detector cuando est
interpuesta la muestra (P) y cuando no lo est (P0) o cuando
est interpuesto un blanco.
Espectro de absorcin caracterstico
Espectro de emisin caracterstico
 Se acostumbra a llamar cuerpo negro al
cuerpo ideal que absorbe todas las longitudes de
onda y, por consiguiente, emite radiacin tambin a
todas las longitudes de onda. Sera, en definitiva,
un emisor perfecto de radiacin. A cada
temperatura emitira una cantidad definida de
energa por cada longitud de onda.
Transmitancia y absorbancia
La transmitancia se define como T = P / P0
y la absorbancia como
A = - log T = - log P / P0
Espectrofotmetro puede registrar la
luz en el rango de UV o del visible
Al campo de luz UV de 200 a 400 nm
se le conoce tambin como rango de
UV cercano , la espectrofotometra
visible solamente usa el rango del
campo electromagntico de la luz
visible , de 400 a 800 nm.
Ley de Lambert - Beer

Relaciona la absorcin de luz con

las propiedades del material
atravesado.
LEY DE LAMBERT Y BEER
La ley explica que hay una relacin exponencial
entre la transmisin de luz a travs de una sustancia
y la concentracin de la sustancia, as como tambin
entre la transmisin y la longitud del cuerpo que la
luz atraviesa.
Si conocemos l y A, la concentracin de la sustancia
puede ser deducida a partir de la cantidad de luz
transmitida.
A = cl
Donde:
A = absorbencia
= Coeficiente de extincin molar.
l = longitud de la celda.
COEFICIENTE DE EXTINCIN
MOLAR
Es una medida de la cantidad de luz absorbida
por unidad de concentracin.

Un compuesto con un alto valor de coeficiente de

extincin molar es muy eficiente en la absorcin
de luz de la longitud de onda adecuada y, por lo
tanto, puede detectarse por medidas de
absorcin cuando se encuentra en disolucin a
concentraciones muy BAJAS.
PROTENAS y la absorcin en la
regin UV
Las bandas de absorcin ms significativas se
encuentra en el ultravioleta cercano, en el intervalo
de longitud de onda entre 230 y 300 nm.
Concretamente absorben en este rango las cadenas
laterales de los aminocidos aromticos, la
histidina y la cistina.
La cistina presenta una banda centrada a 250 nm,
n-->s* (max ~ 300 M-1.cm-1), pero apenas se
puede considerar, ya que es muy dbil y el
porcentaje relativo de puentes disulfuro es muy
pequeo en una protena.
 PROTENAS
Los aromticos absorben de 260-290 nm. La fenilalanina. Es el
menos importante cuantitativamente, aunque muestra un espectro
complejo con mltiples bandas diferenciadas en torno a 250-260 nm.
Presenta tambin bandas de mayor energa que solapan con el espectro
del enlace peptdico en 215 y 180 nm. Sin embargo como no absorbe por
encima de 280 nm su contribucin al espectro en la zona del ultravioleta
cercano de protenas suele ser pequea.

La tirosina presenta un mximo a 275 nm con un hombro a

285 nm. La banda se desplaza a mayores longitudes de onda cuando se
produce la desprotonacin del OH del anillo aromtico.

El triptfano agrupa al menos tres bandas diferentes.bajo el espectro

centrado a 280 nm. Tambin presenta bandas en la zona del UV lejano.

Un cambio de pH produce grandes efectos en los espectros de tirosina y

triptfano ya que el lugar de protonacin afecta directamente a la
conjugacin electrnica de la cadena lateral.
 Curva Patrn
Es un marco de referencia que se construye de
cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo
la albmina srica bovina) que se utiliza para
determinar la cantidad de protenas presente en una
muestra incgnita.
En determinaciones colorimtricas, se cumple una
relacin proporcional entre la magnitud o intensidad
de color que da una reaccin y la cantidad del
reactivo que la provoca.
La intensidad de color se mide con un
espectrofotmetro o colormetro en funcin de las
concentraciones crecientes de la sustancia se
obtiene una recta. Es decir, a mayor cantidad de
protena, mayor cantidad de producto de reaccin y
por lo tanto, mayor intensidad de color.
CURVA PATRN BLANCO
La absorbancia de una solucin es la resultante de la
absorbancia del soluto cuya concentracin se desea conocer y
la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos) que
absorben tambin a esa longitud de onda.

Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para

ello es necesario hacer siempre una muestra que contenga
todas los componentes del sistema menos aquel que se desea
medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de ste
debe restarse a las muestras problema y a los patrones, o bien,
con el blanco se calibra el instrumento a absorbancia igual a 0,
o sea 100% de transmitancia.
CURVA PATRN
Cuantificacin de Protenas

Determinar la concentracin de protenas en una

muestra biolgica es una tcnica de rutina bsica
cuando se aborda un esquema de purificacin de una
protena concreta, cuando se quiere conocer la
actividad especfica de una preparacin enzimtica,
para el diagnstico de enfermedades, as como para
otros muchos propsitos.
Cuantificacin de Protenas
Existen diferentes mtodos para la
cuantificacin de protenas. Muchos de
estos mtodos se basan en:
a) la propiedad intrnseca de las protenas para
absorber luz en el UV,
b) para la formacin de derivados qumicos, o
c) la capacidad que tienen las protenas de
unir ciertos colorantes.
BIURET
Se basa en la formacin de un complejo coloreado
entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces
peptdicos en medio bsico.
1Cu2+ se acompleja con 4 NH.
La intensidad de coloracin es directamente
proporcional a la cantidad de protenas (enlaces
peptdicos) y la reaccin es bastante especfica, de
manera que pocas sustancias interfieren.
La sensibilidad del mtodo es muy baja y slo se
recomienda para la cuantificacin de protenas en
preparados muy concentrados (por ejemplo en
suero).
BRADFORD
Se basa en la unin de un colorante, Comassie Blue G-
250 (tambin Serva Blue) a las protenas.
El colorante, en solucin cida, existe en dos formas una
azul y otra naranja.
Las protenas se unen a la forma azul para formar un
complejo protena-colorante con un coeficiente de
extincin mayor que el colorante libre.
Este mtodo es sensible (1-15 g), simple, rpido, barato
y pocas sustancias interfieren en su determinacin.
Entre las sustancias que interfieren estn los detergentes
y las soluciones bsicas.
BCA
El cido bicinconnico, sal sdica, es un compuesto capaz de
formar un complejo prpura intenso con iones Cu1+ en medio
alcalino.
Este reactivo forma la base de un mtodo analtico capaz de
monitorizar el in cuproso producido en una reaccin entre las
protenas con Cu2+ en medio alcalino (reaccin de Biuret).
La estabilidad del reactivo y el cromforo proporciona un
mtodo para la cuantificacin de protenas que es sencillo,
rpido, muy sensible, y que muestra una gran tolerancia a
compuestos que afectan a otros mtodos.
OH-
Protena + Cu2+ Cu1+

Cu1+ + BCA complejo prpura BCA- Cu1+

LOWRY
ESTE PROCEDIMIENTO INVOLUCRA LA
FORMACIN DE UN COMPEJO COBRE -
PROTENA EN SOLUCIN ALCALINA.
ESTE COMPLEJO REDUCE AL REACTIVO
FOSFOMOLIBDICO- FOSFOTUNGSTATO LO QUE
PRODUCE UNA INTENSA COLORACIN AZUL.
Este mtodo se basa en la reaccin de Biuret, donde los enlaces
peptdicos reaccionan con el Cu2+ en condiciones alcalinas produciendo
Cu+, despus se reduce el reactivo de Folin por las protenas tratadas
con cobre a azul heteropolimolibdeno. El color se desarrolla en la
segunda reaccin (con el fosfomolibdotungstato) y es primeramente
debida a los aminocidos tirosina, triptfano, y en menor grado por
cistena, cistina e histidina.
Cuadro comparativo de sensibilidad de las
tcnicas de cuantificacin de Protenas