BIOPLASTICOS:BACTE

RIAS PRODUCTORAS
DE PHA

BIOPLASTICOS

Polihidroxialcanoatos(PHA)
Son sintetizados por muchas especies de
distintos gneros bacterianos en condiciones de
crecimiento caracterizadas por exceso en la
fuente carbonada y limitacin de nutrientes
como N,P,S,Mg,O2 Estos polmeros se acumulan
en grnulos intracitoplasmticos y son utilizados
como fuente de carbono y energa en
condiciones de escasez nutricional.

POLIHIDROXIALCANOATOS
Bacterias que sintetizan PHA en la fase estacionaria
con limitacin de nutrientes y con exceso de fuente
de carbono (Cupriavidus necator, Pseudomonas
oleovorans ,Azotobacter beijerinckii, Azospirillum
brasilense): CULTIVO ALIMENTADO O FED BATCH
Bacterias
que acumulan PHA durante su
crecimiento sin que se agote algn nutriente
(Mesorhizobium plurifarium, Alcaligenes latus,
Pseudomonas putida, Haloferax mediterranei,
Azotobacter chrococcum): CULTIVO DISCONTINUO
O BATCH

Azospirillum spp. nativas productoras

de polihidroxialcanoatos (PHA)

Azosporillum brasilense y A.
lipoferum

1. Inculo: Azospirillum sp. en 1,5 mL de caldo Azotobacter modificado (30

C x 24 horas, constante agitacin )
2. Cultivo fed-batch o alimentado
- Inculo en 15 mL del mismo caldo : 30 C x 24 horas (150 rpm)
- Despus, alimentar con carbono: solucin saturada de cido mlico
cada 12 horas (24-36-48 horas)

24 horas: Primera alimentacin con 3 mL de solucin

saturada de cido mlico- Incubacin 30 C por 12 horas

36 horas :Primera toma de muestra y frotis para detectar

PHAs

Tincin con solucin de Sudn negro

B x 15 minutos

Decolorar con xilol y secar a temperatura

ambiente

Teir con safranina por 1 minuto y despus

enjuagar con agua destilada

Secar y observar: Clulas

vegetativas rosadas

36 horas: Segunda alimentacin con solucin saturada

de cido mlico- Incubacin 30 C por 12 horas

48 horas :Segunda toma de muestra y frotis para detectar PHA

Tincin con solucin de Sudn negro

B x 15 minutos

Decolorar con xilol y secar a temperatura

ambiente

Teir con safranina por 1 minuto y enjuagar

con agua destilada

DETECCIN DE PHA
Los grnulos de PHA se observan de color
gris o negro y las clulas vegetativas
rosadas

CUANTIFICACION DE BIOMASA
1. Centrifugar el caldo cultivado (3000 rpm por 30 minutos)

CUANTIFICACION DE BIOMASA
2.Lavar el paquete celular por dos veces (agregar solucin salina
y centrifugar)

CUANTIFICACION DE BIOMASA
3.Deshidratar (70C hasta peso constante) y pesar

CUANTIFICACION DE PHA
1.Agregar 1 mL de hipoclorito de sodio 5 % a la
biomasa deshidratada

CUANTIFICACION DE PHA
2. Mezclar durante 2 horas y luego agregar 1 mL de
cloroformo. Inmediatamente se forman dos fases. Centrifugar
(2000 rpm x 5 minutos)

CUANTIFICACION DE PHA
3. Se visualizan mejor las dos fases. Con una pipeta Pasteur extraer el
cloroformo con el polmero (fase inferior) y depositarlo en tubos de vidrio.
Evaporar el cloroformo ( estufa 24 horas)

CUANTIFICACION DE PHA
4. Remover el polmero con ayuda de un ansa

CUANTIFICACION DE PHA
4. Extraer el polmero PHA y pesar
Calcular el Y p/x (Rendimiento de biomasa en producto)

Verificacin de la naturaleza del

PHA
Digestin con cido sulfrico y corrida espectral con pico mximo a 235 nm

MUCHAS GRACIAS POR SU

ATENCIN !

BACTERIAS HALOFILAS

PHA sintetizado por bacterias

halfilas

Cupriavidus necator

Cupriavidus necator

Cupriavidus necator: No fermenta la

lactosa en Mac Conkey

Cupriavidus necator: No forma

fluoresceina en agar King B

Cupriavidus necator: Oxidasa

positivo

Cupriavidus necator: Fructosa como

fuente de carbono

Cupriavidus
necator:Alimentacin

Cupriavidus necator: Deteccin de

grnulos de PHAs

Cupriavidus necator

Cupriavidus necator

Gracias por su atencin