UNIVERSIDAD NACIONAL DEL ALTIPLANO

FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA

PATOLOGA CLINICA

ELETROFORESIS

Docente
Uriel Santiago Marca Choque

Qu es la electroforesis?

Tcnica de separacin que se basa en la diferente
movilidad o velocidad de migracin de partculas
cargadas debido a la accin de un campo elctrico

SEPARACIN DE LOS ELEMENTOS DE UNA MEZCLA

Separa los diferentes elementos que componen una
mezcla compleja en funcin de la carga elctrica de los
mismos

VELOCIDAD DE LAS PARTICULAS

Depende de ...

La carga de las mismas
La intensidad del campo elctrico y
Del coeficiente de friccin de las molculas con el
medio

APLICACIN DE LA ELECTROFORESIS

Fraccionamiento de las hemoglobinas
Diferenciacin de la hemoglobina fetal
Diagnstico de talasemias, anemias falciformes, etc.
Protenas sricas
Protenas urinarias
Lipoprotenas
cidos nucleicos
Enzimas
Inmunoelectroforesis, etc.
Fundamento
Cuando una mezcla de molculas ionizadas y
con carga neta son colocadas en un campo
elctrico, estas experimentan una fuerza de
atraccin hacia el polo que posee carga opuesta,
dejando transcurrir cierto tiempo las molculas
cargadas positivamente se desplazaran hacia el
ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas
positivamente se desplazaran hacia el nodo (el
polo positivo).


El movimiento de las molculas esta gobernado
tambin por dos fuerzas adicionales;
inicialmente la friccin con el solvente
dificultar este movimiento originando una
fuerza que se opone , por otro lado las molculas
tienen que moverse en forma aleatoria o
movimiento browniano debido a que poseen
energa cintica propia denominado difusin.
La energa cintica de las molculas aumenta
con la temperatura, por ello a mayor
temperatura mayor difusin.
La suma de todas estas fuerzas provoca que las molculas no
migren de una manera homognea, de tal manera que, si las
molculas son colocadas en un cierto lugar de solucin, los
iones comenzaran a moverse formando un frente cuya anchura
aumentara con el tiempo.

Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el
movimiento de las molculas empleando un medio que
oponga mas resistencia a dicho movimiento. Una forma comn
de hacer esto es formar un gel. El gel consiste de un polmero
soluble de muy alto peso molecular que atrapa molculas de
agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los
solutos, consecuentemente, la migracin electrofortica de las
molculas ser mas lenta, pero el ensanchamiento del frente se
vera reducido tambin.


electro migracin
Mucha gente cree que la electro migracin es la
"migracin de electrones" pero en realidad es el
material que "migra" por causa de un flujo de
electrones, por eso se llama electro-migracin
La electro migracin es un fenmeno que depende
de la temperatura
Tipos de electroforesis

Las separaciones electroforticas se llevan a cabo habitualmente en dos
modalidades que difieren notablemente: electroforesis convencional y
electroforesis capilar.
La primera es la metodologa clsica que ha sido utilizada durante muchos
aos para separar especies complejas, de elevado peso molecular, de inters
biolgico y bioqumico. Las separaciones convencionales se llevan a cabo
sobre una capa delgada y plana o placa de un gel poroso que contiene un
tampn acuoso en el interior de sus poros.
Normalmente, esta placa tiene unas dimensiones de unos pocos
centmetros de lado, y al igual que las placas de cromatografa en capa fina,
es capaz de separar varias muestras simultneamente. Las muestras se
disponen como manchas o bandas sobre la placa, y se aplica el potencial de
corriente continua, a travs de la placa, durante un perodo de tiempo fijo.
Cuando se juzga que las separaciones se han completado, se interrumpe el
paso de la corriente, y las especies separadas se detienen para visualizarse
de modo similar
La electroforesis convencional es, actualmente, la tcnica de separacin
ms ampliamente utilizada por bilogos y bioqumicos.

FUNDAMENTO DE LAS SEPARACIONES ELECTROFORETICAS

La velocidad de migracin de un ion, v, en centmetros por segundo,
en el seno de un campo elctrico, es igual al producto de la intensidad
del campo elctrico E (V cm
-1
) por la movilidad electrofortica
e

(cm
2
V
-1
s
-1
), esto es:
v =
e
E

La movilidad electrofortica es directamente proporcional a la carga
elctrica del analito e inversamente proporcional a los factores de
retardo por rozamiento. El campo elctrico acta solamente sobre los
iones. Si dos especies difieren bien en la carga o en las fuerzas de
rozamiento, se movern a travs del tampn y se separan. Las especies
neutras no se separan
ELECTROFORESIS CAPILAR

La electroforesis convencional ha sido y continua siendo de gran utilidad;
sin embargo este tipo de separacin electrofortica es lenta, laboriosa y
difcil de automatizar, y adems no proporciona resultados cuantitativos
precisos. La investigacin y la aplicacin de la electroforesis llevada a
cabo en capilares tuvo un crecimiento explosivo durante la segunda
mitad de la dcada de los ochenta, ello unido a la aparicin de varios
instrumentos comerciales.

La electroforesis capilar da lugar a separaciones con volmenes de
muestra extraordinariamente pequeos (de 0,1 a 10 nL, en contraste con
la electroforesis convencional en la cual se emplean volmenes de
muestra del orden de L) y con una elevada resolucin y rapidez.
Adems, las especies separadas eluyen de uno de los extremos del capilar
VELOCIDADES DE MIGRACION Y ALTURAS DE PLATO EN ELECTROFORESIS CAPILAR












Esta relacion indica que es necesario que se apliquen potenciales elevados para obtener
migraciones ionicas rpidas y una rpida separacion. Si bien es deseable que las separaciones
sean rpidas, es an ms importante obtener separaciones de alta resolucion. Por ello, se hace
necesario examinar los factores que determinan la resolucion en la electroforesis.
INTRODUCCION DE LA MUESTRA

En el mtodo de inyeccin electrocintica, se retiran del deposito del tampn
uno de los extremos del capilar y el correspondiente electrodo, y se colocan en
un pequeo recipiente donde est situada la muestra. Se aplica entonces un
potencial durante un tiempo determinado, lo que hace que la muestra
penetre en el capilar debido a la actuacin conjunta de los fenmenos de
migracin inica y flujo electro osmtico. El extremo del capilar y el electrodo
vuelven a introducirse en la disolucin tampn, donde se mantienen durante
el resto del proceso de separacin. Esta tcnica de inyeccin es
discriminatoria al introducir mayor cantidad de los iones ms mviles
respecto a los ms lentos.
En el mtodo de inyeccin por presin, el extremo del capilar se coloca
momentneamente en un pequeo recipiente que contiene la muestra, y se
utiliza una diferencia de presin para conducir la muestra al interior del
capilar. Esta diferencia de presin proviene de aplicar vaco en el extremo del
detector o de la aplicacin de presin en el recipiente que contiene la
muestra, o bien se consigue por elevacin del extremo que contiene la
muestra. La inyeccin por presin no diferencia los iones segn su movilidad;
sin embargo, no puede utilizarse en capilares rellenos de gel.

Fundamento de la
deteccin
Limite de deteccion (moles
detectados)
Espectrometra
Absorcin 10
-15
-10
-13

Fluorescencia
Derivatizacion pre
columna
10
-17
-10
-20

Derivatizacion en
columna
8 x 10
-16

Derivatizacion pos
columna
2 x 10
-17

Fluorescencia indirecta 5 x 10
-17

Lentes trmicas 4 x 10
-17

Raman
c
2 x 10
-15

Espectrometra de
masas
1 x 10
-17

Electroqumica
Conductividad
c
1 x 10
-16

Potenciometria No
Amperometria 7 x 10
-19

Radiometria
c
1 x 10
-19

modalidades de deteccin en electroforesis capilar'
APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS CAPILAR


Las separaciones por electroforesis capilar se llevan a cabo
de distintas maneras, tambin llamadas modalidades. Es
interesante destacar que estas modalidades se emplearon
en primer lugar en la electroforesis convencional, y se
adaptaron posteriormente a la electroforesis capilar. Estas
modalidades son la electroforesis capilar de zona (CZE),
electroforesis capilar en gel (CGE), isoelectroenfoque
capilar (CIEF) e isotacoforesis capilar (CITP).
Mtodos electroforticos zonales.


Son los ms comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son
tiles para lograr la separacin de mezclas complejas. Se aplican pequeas
cantidades de la disolucin de protenas a un soporte slido, que se
impregna con una solucin tampn. Los soportes son en general polmeros
y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las molculas a
travs del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de
conveccin del solvente.

Como soporte han sido utilizados papel (celulosa), almidn, poliacrilamida,
agarosa y acetato de celulosa, entre otros. Este mtodo tiene gran poder
resolutivo por que se aplica una cantidad pequea de protena a una zona
estrecha, mientras que la longitud del trayecto es mucho mayor que la
zona de aplicacin. El equipamiento requerido es simple, fuente de
poder, cubeta vertical u horizontal donde se colocan el soporte y dos
electrodos
Electroforesis en gel de poliacrilamida.

Los geles de poliacrilamida se forman por polimerizacin de la acrilamida
por accin de un agente entrecuzador, es qumicamente inerte, de
propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rpida y
reproducible. Forma, adems, geles transparentes con estabilidad
mecnica, insolubles en agua, relativamente no inicos y que permiten
buena visualizacin de las bandas durante un tiempo prolongado.
Adems tiene la ventaja de que variando la concentracin de polmeros,
se puede modificar de manera controlada en el tamao del poro,
lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su
neurotoxocidad.


ISOELECTROENFOQUE CAPILAR
Se utiliza para la separacin de especies anfteras como
aminocidos y protenas que presentan en su estructura un
grupo carboxlico y un grupo amino

GRACIAS POR SU ATENCION