James Dewey Watson Nobel de Medicina 1962

Francis Crick

Factores de transcripcin

La enzima de restriccin EcoRV (verde)

factor de transcripcin represor del fago lambda

Algunos FT actan como oncoprotenas cabe destacar Myc, Max, Myb, Fos, Jun, Rel, Ets

Especificidad de factores de transcripcin

Los FT son generalmente especficos de cada clase de genes. Reconocen y se unen a secuencias determinadas cerca del sitio de iniciacin de la transcripcin. Las secuencias a las que se unen los FT de los promotores de genes de clase I varan enormemente de organismo a organismo. Los FT de los genes de clase II se unen a secuencias de promotores situados antes del sitio de iniciacin de la transcripcin. La TATA es la ms frecuente. Los sitios de unin de los FT de los genes de la clase III se localizan dentro de la regin transcrita del mismo gen, y se denominan regiones internas de control.

factores de transcripcin
Las RIC se unen a varios factores y forman un complejo de transcripcin estable al cual se une la ARN polimerasa III. Los complejos de transcripcin estables permanecen ensamblados a lo largo de muchos ciclos de transcripcin. Los factores basales de transcripcin son necesarios para iniciar la sntesis de ARN en todos los promotores. Junto con la ARN polimerasa constituyen el aparato de transcripcin basal. Los factores genricos reconocen promotores de genes expresados constitutivamente. Los factores especficos reconocen promotores de genes especficos de tejido.

ARN polimerasa T7 (azul) produciendo un ARNm (verde) a partir de un molde de ADN (naranja).

Una enzima de restriccin (o endonucleasas de restriccin) es aquella que puede reconocer una secuencia caracterstica de nucletidos dentro de una molcula de ADN y cortar el ADN en ese punto en concreto, llamado sitio o diana de restriccin, o en un sitio no muy lejano a ste, dependiendo de la enzima. Los sitios de restriccin cuentan con entre 4 y 12 pb, con las que son reconocidos. El mecanismo de corte de DNA se realiza a travs de la ruptura de 2 enlaces fosfodiester en la doble hebra, lo que da lugar a dos extremos de DNA. stos pueden ser romos (cuando los enlaces rotos coinciden) o cohesivos/escalonados.
Estos ltimos tienen tendencia a volver a unirse de modo espontneo, ya que los extremos se pueden unir a otros extremos coincidentes que pueda haber en la cercana (Apareamiento de Watson & Crick).
Corte cohesivo Corte romo

SmaI
Eco RI

Tipo 1: Una sola enzima (con 3 subunidades) tiene actividad de restriccin (corta) y modificacin (metila). Al reconocer la secuencia especfica de DNA corta al azar en sitios distintos al sitio de reconocimiento, ya sea aguas arriba o aguas abajo. El corte deja extremos cohesivos. Necesitan de ATP para moverse en el DNA, desde el lugar de reconocimiento hasta el sitio de corte (unas 1000 pb aprox), adems de SAM (S-adenosilmetionina) y Mg++ como cofactores.

Tipo 2: Solo tienen actividad de restriccin. Otras enzimas llevan a cabo la metilacin. El corte es efectuado en el sitio de reconocimiento, o bien, cerca de l, por lo que el corte es resistente y predecible. Por esta caracterstica es que son muy utilizadas para clonacin de genes, ya que al cortar en sitios especficos se pueden recuperar secuencias conocidas. Slo requieren Mg++ como cofactor, no necesitan de ATP.

Tipo 3: Se utiliza una enzima oligomrica que realiza todas las actividades enzimticas. Tienen funcin de restriccin y modificacin. Cortan de 25 a 27 pb lejos del sitio de reconocimiento, dejando extremos cohesivos.

Requieren dos secuencias de reconocimiento en orientacin opuesta en la misma cadena de DNA. Necesitan ATP, Mg++ y SAM (S-adenosil-metionina) como cofactores.
Hay otros sistemas de restriccin descubiertos actualmente, como el sistema tipo 4 de E. coli (Eco571) que consta de una sola enzima que corta nicamente DNA metilado en una secuencia especfica, y que adems metila.

Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por otras enzimas llamadas ligasas. Conocemos as el ADN vector, que sera aquel que es capaz de

replicarse independientemente del ADN de la clula

anfitriona en la cual crece.

Dentro de este grupo de vectores estn los Plsmidos,

molculas circulares de ADN halladas en las bacterias.

Las enzimas de restriccin que a pesar de ser

distintas y provenir de distintas especies, tienen la

misma secuencia de reconocimiento y dejan el mismo extremo cohesivo, pero no cortan en el mismo sitio, son llamadas Isoesquizmeros. Por ejemplo, estn los isoesquizmeros Asp718 y KpnI.
El Premio Nobel de Medicina de 1978: Werner Arber, Daniel Nathans y Hamilton Smith por el descubrimiento de las endonucleasas de restriccin lo que condujo al desarrollo de la tecnologa de ADN recombinante. El primer uso prctico de su trabajo fue la manipulacin de la bacteria E. coli para producir insulina humana para los diabticos.

NOMENCLATURA El nombre de cada enzima de restriccin est asignado segn el origen

bacteriano de la misma. La nomenclatura utilizada para denominar estas

enzimas consiste en: 1. Tres letras que corresponden al nombre cientfico del microorganismo (ej.

Escherichia coli (Eco); Haemophilus influenzae (Hin)); y por ello las tres
primeras letras del nombre se escriben en cursiva. 2. La cepa o estirpe si la hubiese (ej. EcoR, aislada de la cepa "RY13" de E. coli ) 3. En nmeros romanos, un nmero para distinguir si hay ms de una endonucleasa aislada de esa misma especie. No confundir con el tipo de enzima de restriccin. 4. Todas deberan llevar delante una R de restriccin o un M de metilasa segn la funcin de la enzima, pero generalmente se omite.

EcoRI se construira de la siguiente manera:

Nomenclatura E

Ejemplo Escherichia

Corresponde a: Gnero de la bacteria

co
R

coli
RY13 La primera enzima identificada

Especie de la bacteria
Cepa de la bacteria Orden de identificacin de la enzima en la bacteria

Enzima EcoRI BamHI

Origen Bacteriano Escherichia coli Bacillus amyloliquefaciens

Sitio de Reconocimiento 5'GAATTC 3'CTTAAG 5'GGATCC 3'CCTAGG CH3 | 5'GATC 3'CTAG | CH3 5'AAGCTT 3'TTCGAA 5'TCGA 3'AGCT 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG 5'GANTC 3'CTNAG 5'GATC 3'CTAG 5'CAGCTG 3'GTCGAC 5'CCCGGG 3'GGGCCC 5'GGCC 3'CCGG 5'AGCT 3'TCGA 5'GATATC 3'CTATAG 5'GGTACC 3'CCATGG 5'CTGCAG 3'GACGTC 5'GAGCTC 3'CTCGAG 5'GTCGAC 3'CAGCTG 5'GCATGC 3'CGTACG 5'TCTAGA 3'AGATCT

Resultado del Corte 5'---G AATTC---3' 3'---CTTAA G---5' 5'---G GATCC---3' 3'---CCTAG G---5' CH3 | 5'---GA TC---3' 3'---CT AG---5' | CH3 5'---A AGCTT---3' 3'---TTCGA A---5' 5'---T CGA---3' 3'---AGC T---5' 5'---GC GGCCGC---3' 3'---CGCCGG CG---5' 5'---G ANTC---3' 3'---CTNA G---5' 5'--- GATC---3' 3'---CTAG ---3' 5'---CAG CTG---3' 3'---GTC GAC---5' 5'---CCC GGG---3' 3'---GGG CCC---5' 5'---GG CC---3' 3'---CC GG---5' 5'---AG CT---3' 3'---TC GA---5' 5'---GAT ATC---3' 3'---CTA TAG---5' 5'---GGTAC C---3' 3'---C CATGG---5' 5'---CTGCA G---3' 3'---G ACGTC---5' 5'---GAGCT C---3' 3'---C TCGAG---5' 5'---G TCGAC---3' 3'---CAGCT G---5' 5'---G CATGC---3' 3'---CGTAC G---5' 5'---T CTAGA---3' 3'---AGATC T---5'

DpnI*

Diplococcus pneumoniae

HindIII TaqI NotI

Haemophilus influenzae Thermus aquaticus Nocardia otitidis

HinfI
Sau3A PovII* SmaI* HaeIII* AluI* EcoRV* KpnI[1] PstI[1] SacI[1]

Haemophilus influenzae
Staphylococcus aureus Proteus vulgaris Serratia marcescens Haemophilus egytius Arthrobacter luteus Escherichia coli Klebsiella pneumonia Providencia stuartii Streptomyces achromogenes

SalI[1]
SphI[1] XbaI[1]

Streptomyces albue
Streptomyces phaeochromogenes Xanthomonas badrii

* = ADN queda con extremos romos

Paciente Tx intralesionalmente/glucantime