Generalidades

INDUSTRIA FARMACUTICA

Biotecnologa Vegetal
Es una disciplina perteneciente a la Biotecnologa, la cual tiene por objeto de estudio a las plantas.

INDUSTRIA ALIMENTOS

Multiplicarlas masivamente Hacerlas mejores Mas productivas

INDUSTRIA COLORANTES

Metabolitos

Cultivo de clulas vegetales

Teniendo por objetivo aislar partes de una planta hacindolas crecer en un medio de cultivo artificial in vitro en condiciones de asepsia para obtener :

Tejidos

rganos

Platas Completas

Qu significa in vitro?
Reiteradamente se menciona este concepto como una forma de indicar que las plantas o partes de plantas estudiadas fueron cultivadas dentro de un contenedor de vidrio (del latn in: adentro, vitro: vidrio), es decir, en un frasco de vidrio, en una placa Petri, en un matraz Erlenmeyer, etc.

Papa semilla

Produccin de micro tubrculos de papa

La papa (Solanum tuberosum) se encuentra entre los productos agrcolas ms importantes a nivel global. Aunque los cientos de variedades de papa son nativas especialmente del Alto Per, actualmente se cultivan en todo el mundo. Por microtubrculos producidos in vitro ya que

Ventajas:: presenta ventajas relacionadas con su fcil almacenamiento, alta calidad fitosanitaria, conveniencia para el transporte; adems los microtubrculos no requieren pasar por una etapa de aclimatacin previa a su siembra en campo.
Microtubrculos producidos in vitro

Protocolos utilizados durante el cultivo in vitro

La totipotencia es la capacidad de una clula de dirigir el desarrollo total de un organismo

Totipotencia celular

cualquier clula de una planta es posible regenerar un individuo completo

Eleccin de la planta

Protocolo

Establecimiento
Multiplicacin Enraizamiento

Protocolos utilizados durante el cultivo in vitro

Eleccin de la planta
Estn constituidos por tejidos y/o clulas .

Protocolo

protoplastos

Protocolos utilizados durante el cultivo in vitro

Establecimiento
Desinfeccin de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptacin al medio artificial.

Protocolo

Protocolos utilizados durante el cultivo in vitro

Multiplicacin
Generar una masa vegetal suficiente para la regeneracin del nmero de plantas necesarias.

Protocolo

Protocolos utilizados durante el cultivo in vitro

Enraizamiento
formacin de races con el fin de convertir los brotes o embriones en plntulas completas.

Protocolo

Medios de cultivos
las plantas necesitan de varios factores para su crecimiento y desarrollo.

Condiciones ambientales Oxigeno Nutrientes

Agua
Soporte

Medios de cultivos
Composicin de medios de cultivo para clulas vegetales Nutrientes Macroelementos (P, K, Ca, Mg) Microelementos (Fe,, Zn, Cu, ), en una proporcin adecuada segn la planta elegida.

Hormonas y reguladores del Auxinas: promueven la, la formacin de callos y races. crecimiento Citoquininas: promueven la divisin celular, regulan el crecimiento y el desarrollo de los tejidos vegetales. Materiales inertes Se usan como soporte: agar, agarosa, lana de vidrio, papel de filtro, arena. como el agua de coco, extracto de levadura, carbn activado y sustancias naturales diversas. Sacarosa Ajustar el grado de Ph y oxidacion : cidos orgnicos, Lcisteina etc

Otros ingredientes Fuentes de carbono Reguladores ambientales

Medios de cultivos

microtubrculos producidos in vitroiitr

Cultivo de nudos de plantas jvenes Azcares (6-8% de sacarosa) Citoquinina (2-10ppm) Temperatura : Ambiente pH 6.5

Los tejidos vegetales pueden cultivarse de varias maneras, independientemente de la finalidad buscada. Bajo esta concepcin, no se considera a la embriognesis o a la organognesis como tipos de cultivo.

As tenemos que se realizan cultivo de tejidos organizados y desorganizados, de clulas individuales, de rganos, de plantas enteras, etc

Un aspecto importante es que los tipos de cultivo no necesariamente dependen del tejido inicial o explante, ya que no se considera dentro de esta clasificacin al cultivo de segmentos de hojas, de raz, de tallo, etc.

Esto se debe a que a partir de cualquier explante se puede hacer cultivo de callos, de clulas en suspensin o individuales..

Determinados

Cultivo de rganos Organizada Cultivo de embriones

Cultivos de clulas vegetales

Hojas, flores, frutos (enteros)

Indeterminados
Yemas meristematicas apicales y laterales

Semillas, embriones aislados

Cultivo de callos Desorganizada Cultivo de clulas en suspensin Cultivo de clulas individuales

Se refiere al cultivo de explantes diferenciados (especializados) que continan su crecimiento in vitro, manteniendo su estructura normal durante el tiempo de cultivo.

Evidentemente, los explantes que presentan esta forma de crecimiento son los rganos (primordios de frutos, yemas vegetativas, yemas florales, races, primordios foliares, etc.), no obstante, cualquier otro tejido (como un fragmento de ptalo) puede dar origen a una forma organizada, como un embrin.

Existen esencialmente dos tipos de rganos en las plantas: aquellos que tienen un alto grado de especializacin y los que modifican su forma y funciones conforme crecen y se desarrollan

Al fenmeno que establece la adquisicin de especializacin se le llama determinacin, el cual se basa en la expresin diferencial de genes.

Todas las clulas de una planta poseen la misma carga gentica (nuclear, mitocondrial y de plastos), de la cual slo una parte se expresa constantemente (genes constitutivos que producen protenas constitutivas o enzimas del metabolismo primario); sin embargo, otra parte del genoma se expresa slo bajo la influencia de ciertos estmulos ambientales.

rganos determinados

rganos indeterminados
Son ejemplos de stos los pices del tallo y ramas, yemas axilares y puntas de races; los tres primeros crecern hasta dar origen a un nuevo tallo completo con hojas y sus propias yemas, y mientras el espacio y los nutrimentos los permitan continuarn su crecimiento de manera indefinida.

Son ejemplos de stos los frutos, las flores, las hojas; siempre que se utilice como explante los primordios de ellos, crecern y se desarrollarn hasta formar rganos tpicos.

Lo cual se debe a que la determinacin es un fenmeno epigentico, es decir, que hereda de clula a clula la expresin de los programas genticos y esto se mantiene durante perodos prolongados de tiempo an cuando se modifiquen las condiciones de cultivo.

Igualmente, las races se alargarn y producirn races secundarias y pelos absorbentes. Cabe aclarar que estos rganos son indeterminados (o ms precisamente, poco determinados) desde la planta in situ, por lo que el crecimiento mostrado no es producto del cultivo in vitro.

Se utiliza esta tcnica cuando se mantienen en cultivo embriones hasta que alcanzan el estado de plntula, es decir, cuando se ha diferenciado por completo la primera hoja y desarrollado el sistema radical.

Existen en cultivo de tejidos tres tipos de embriones: aquellos provenientes de la semilla sexual, los que son producto de la apomixis, y los obtenidos por embriognesis somtica.

Una aplicacin importante de este tipo de cultivo es el rescate de embriones, ya que algunas cruzas interespecficas no prosperan porque el ovario rechaza al embrin formado y lo aborta, lo cual impide que se puedan obtener hbridos de especies emparentadas; mientras que esta tcnica permite rescatar al embrin antes de que sea abortado

La forma ms usual de obtenerlos in vitro es exponiendo a un explante a altas concentraciones de auxinas. La utilidad de los callos en cultivo de tejidos es tambin variada, ya que son un paso intermedio en la propagacin in vitro por embriognesis somtica, pueden utilizarse para producir metabolitos de inters o bien para estudios bsicos.

Se realiza en medio lquido utilizando como inculo un callo celular, aunque en algunos casos especficos es posible obtener una suspensin de clulas a partir de un explante recin extrado de la planta. La utilidad ms grande de este tipo de cultivo es la produccin de metabolitos secundarios importantes, por ejemplo: frmacos, colorantes, aromas, etc.

Cultivo de callos

Cultivo de clulas en suspensin

Se utiliza este tipo de cultivo cuando se desean lograr lneas celulares clonales o cepas celulares vegetales, las cuales tendrn un grado de pureza muy alto. Otra utilidad es la obtencin de protoplastos (clulas sin la pared celular), para hacer fusin de protoplastos entre distintas especies con el fin de mejorar genticamente a un cultivo.

Cultivo de clulas individuales

INDUSRIA Alimentos y bebidas Agroqumica

PRODUCTO Quinina (alcaloide) Taumatina Piretrina Codena (alcaloide) Quinina (alcaloide) Digoxina (glicsido cardiaco) Jazmn

PLANTA

USO INDUSTRIAL

Cinchona ledgeriana Agente amargante Thaumatococcus danielli Edulcorante no nutritivo Crysanthemum cineraviaefolium Papaver somniferum Cinchona ledgriana Digitalis lanata Jasminium sp. Insecticida Analgsico Antimalario Cardiotnico Perfume

Farmacutica

Cosmtica

es el trmino general que se le ha dado al aislamiento de un tipo especfico de clulas provenientes de tejidos u rganos animales, que posteriormente son colocadas en un ambiente artificial que favorece su divisin, crecimiento, multiplicacin y en algunos casos, diferenciacin. El cultivo de clulas animales ha permitido studiar la actividad intracelular, los flujos metablicos, las interacciones con el medio ambiente, las interacciones clulaclula, la gentica y la generacin de metabolitos de inters

el uso de cultivos celulares animales dentro de la biotecnologa farmacutica se ha incrementado en los ltimos aos, ya que stos permiten la produccin de manera casi exclusiva de biolgicos y biofrmacos complejos (tales como vacunas tradicionales y recombinantes, protenas recombinantes glicosiladas, anticuerpos monoclonales, vectores virales para terapia gnica, etc.).

En los aos 1960s se establecieron las dos lneas celulares ms utilizadas para la produccin de biofrmacos en la actualidad, las cuales son las clulas CHO (Chinese Hamster Ovarium) y la lnea BHK21 (Baby Hamster Kidney), la cual proviene de rin de cra de hmster

Las de ovario de hmster chino crecen normalmente ancladas a superficie, tienen forma fibroblastoide y pueden adaptarse a crecer en suspensin, adquiriendo entonces forma esfrica. Son las ms utilizadas para la produccin comercial de protenas recombinantes mediante clulas animales.

CLASIFICACION
Los cultivos de clulas animales se han clasificado de acuerdo a su capacidad de anclaje (adherencia) De acuerdo a su capacidad de adherencia a una superficie determinada pueden crecer formando monocapa o en suspensin respectivamente. por lo general las clulas provenientes de rganos, crecen en monocapa. igualmente existen clulas que pueden crecer indistintamente tanto en monocapa como en suspensin. Entre esto podemos llamarlos de la siguiente manera: Cultivo Primario Lneas Celulares Cultivos Secundarios

CULTIVOS EN MONOCAPA Las clulas exhiben una variedad de "comportamientos sociales", permitiendo la formacin de una monocapa que cubrir la correspondiente superficie de crecimiento (confluencia), lo que hace que su multiplicacin sea inhibida cuando establecen contacto entre s (quiescencia). Las clulas provenientes de cultivos primarios son las que mejor crecen en sta condicin, dada su estabilidad gentica y su naturaleza diploide normal. Los recipientes para el cultivo de clulas estacionarias son cajas de Petri, frascos para el cultivo de tejido (Roux), entre otros, que pueden ser de material de plstico o de vidrio previamente tratado y su desprendimiento para transferirlas a superficies mayores se realizan con agentes proteolticos como la tripsina.

CULTIVOS EN SUSPENSION Las Lneas celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento de anclaje a superficies, tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o en suspensin despus de un perodo de adaptacin. Existe evidencia experimental que los sistemas en suspensin tambin requieren de matrices que son macromolculas, que sirven de protectores a la superficie celular. stas macromolculas se encuentran en el suero, el cual contribuye igualmente con el medio de cultivo, proporcionando un sistema balanceado de nutrientes. DENSIDAD DE SATURACION: El mximo nmero de clulas mantenible bajo condiciones especficas de cultivo en un recipiente. Este trmino se expresa usualmente como el nmero de clulas por centmetro cuadrado en una superficie de cultivo o el nmero de clulas por centmetro cbico en un cultivo en suspensin. EFICIENCIA DE SIEMBRA (ADHESION): El porcentaje de clulas sembradas que se adhieren a la superficie del recipiente de cultivo en un tiempo determinado. Siempre deben establecerse las condiciones bajo las cuales se realiz la determinacin.

CULTIVOS PRIMARIOS tienen caractersticas especiales que los diferencian de las lneas celulares: conservan la morfologa de las clulas del rgano del que fueron aisladas, sus cromosomas tienen un nmero diploide (2n), su crecimiento in vitro es limitado y hay inhibicin por contacto.

LINEAS CELULARES estn formadas por clulas que se diferencian gentica y morfolgicamente de las clulas de las cuales se originaron. Pueden provenir de clulas que se derivan de tumores o de un proceso de transformacin de un cultivo primario mediante transfeccin con oncogenes o con tratamiento con carcinogenticos, lo que les confiere un nuevo fenotipo.

CULTIVOS TRIDIMENSIONALES Son aquellos que buscan mantener la caracterstica o arquitectura del tejido in vivo. Los sistemas tridimensionales permiten estudiar la proliferacin y morfologa epitelial y su interaccin con otras clulas como son las del tejido conectivo; igualmente con ellos se puede evaluar el efecto de sustancias que pueden influenciar en tales interacciones intercelulares. Actualmente se producen Kits drmicos comerciales con base en cultivos, que permiten evaluar la citotoxicidad de componentes qumicos presentes en lociones, preservativos, detergentes, perfumes, shampoos y solventes entre otros.

Este estudio mostr que las CMEH (clulas madres) pueden ser dirigidas hacia la diferenciacin retinal por manipulaciones de medio y substrato, y co-cultivadas con clulas de EPR(epitelio pigmentado retinal). Segn los autores, este es el primer tejido organizado en 3D que es generado solamente de CMEH. Las clulas de EPR juegan un importante papel en el desarrollo retinal. Los resultados obtenidos por los autores hacen evidente que el mtodo usado dirige las CMEH hacia un destino retinal, que brindan una abundante fuente de tejido retinal humano para estudios de desarrollo.

VENTAJAS DEL CULTIVO CELULAR Las dos principales ventajas cuando se utilizan los cultivos celulares son: El control del medio fisicoqumico, a saber, pH, temperatura, presin osmtica, tensin de oxgeno (O2) y gas carbnico (CO2) de las clulas cultivadas y, las condiciones fisiolgicas que deben ser constantes. Permiten el estudio del transporte y la utilizacin de metabolitos. DESVENTAJAS DEL CULTIVO CELULAR Las tcnicas de cultivo celular necesitan unas estrictas condiciones de asepsia porque las clulas animales crecen menos rpido que la mayora de los contaminantes comunes como las bacterias, los mohos y las levaduras. Adems las clulas precedentes de animales no pueden desarrollarse en medios de cultivo, por lo que es necesario agregar a los medios suplementos como suero, plasma y fluidos intersticiales, entre otros para de una manera u otra proveer a las clulas cultivadas un medio semejante al in vivo (Freshney, 1995).