MICROSCOPIA Apertura numrica (NA)

N: ndice de refraccin del medio entre el objeto y el objetivo. (aceite de inmersin, aire) : mitad del ngulo descripto por el cono de luz que ingresa al objetivo. La apertura numrica aumenta cuando se aumenta el aumento utilizado. En objetivos secos n=1 y =90 por lo tanto NA=1 (en la prctica NA=0.95) En objetivos de inmersin n=1,51 =90 por lo tanto NA=1,51 (en la prctica NA=1,45) Poder de resolucin Es la DISTANCIA mnima entre dos puntos para que estos sean vistos como dos objetos individuales.

El poder de resolucin es nico para cada microscopio y depende de la longitud de onda, apertura numrica y del objetivo de la lente. A mayor apertura numrica, disminuye R aumenta el poder de resolucin, mejor microscopio. Microscopio de campo claro Se ve el espcimen sobre un fondo claro y se requieren tinciones. Se utiliza para ver caractersticas morfolgicas. Microscopio de campo oscuro Se ve el espcimen sobre un fondo oscuro Se utiliza para ver microorganismos con alguna caracterstica morfolgica en estado vivo y en suspensin sin tinciones. Utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen. El campo de visin del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y slo recoge la luz que se refleja en el objeto. Microscopa de contraste de fases Convierte pequeas diferencias en el ndice de refraccin y la densidad celular en variaciones de intensidad de luz fcilmente detectadas. Permite observar microorganismos vivos SIN TEIR y seguir eventos dinmicos en clulas vivas. En estos microscopios existe una placa cambiadora de fase la cual retrasa la longitud de onda generando un contraste entre las bacterias y el campo. Nomarski, microscopa diferencial de contraste de interferencia (DIC). Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imgenes combinadas aparecen como si la clula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Aprovecha los efectos de interferencia entre las ondas que atraviesan la clula, para crear una imagen de la estructura celular viva, ntida y tridimensional. DIC se usa cuando el espcimen es muy grueso para usar contraste de fases. Microscopia de fluorescencia Una sustancia natural en las clulas o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energa absorbida como rayos luminosos. Permite detectar la prescencia de molculas en baja cantidad como DNA

o protenas. Rojo: viva; verde: metablicamente inactiva. Colorante: naranja de acridina: tie intercalndose entre DNA y RNA emitiendo luz verde cuando se encuentra con DNA y naranja cuando se encuentra con RNA. Microscopia confocal Se obtiene la imagen en secciones, controlando la profundidad permitiendo as evidenciar diferencias estructurales. Elimina el background.

Confocal Secciones plano por plano que permiten evidenciar diferencias en estructuras.

Fluorescencia Pierde detalle por alta seal de emisin.

Iluminacin Longitud de onda Lentes Medio Resolucin Magnificacin Focalizacin COLORANTES

Microscopio de luz Haz de luz 2000 75000 amstrong vidrio atmosfera 200 nm 10 x - 2000 x mecnica

Microscopio electrnico Haz de electrones 370 nm Electromagnticas Vacio 0,3 nm 100 x 450000 x elctrica

Los colorantes son compuestos orgnicos que contienen anillos benceno, un grupo cromforo y un grupo auxocromo. La capacidad de un colorante depende de la carga elctrica que posee el grupo cromforo y de la carga elctrica del componente celular a ser coloreado. En los colorantes cidos son compuestos anionicos donde el grupo cromforo posee carga negativa y por lo tanto se une a componentes celulares cargados positivamente como protenas celulares. Los colorantes bsicos son compuestos catinicos donde el grupo cromforo posee carga positiva, por lo tanto posee mucha afinidad con compuestos con carga negativa como acidos nucleicos y protenas celulares. Azul de metileno. La presencia de cargas negativas en la superficie, produce repulsin electroesttica con la mayora de los colorantes cidos evitando que estos penetren en la clula. Tincin simple El extendido se colorea con un nico reactivo, se puede visualizar la morfologa y disposicin de las clulas bacterianas. Azul de metileno, cristal violeta, carbol fucsina. Tincin negativa Se utiliza un colorante cido como tinta china o nigrosina. El colorante no penetra a la clula y por lo tanto las clulas no teidas se puede diferenciar claramente del fondo coloreado. Permite observar la forma y tamao natural de los microorganismos ya que no se realizan fijaciones del material. Es posible ver espirilos.