1.

- RESUMEN La obtencin de espermatozoides a nivel epididimario es una potente herramienta para el rescate de clulas germinales de animales domsticos con alto valor gentico, que murieron repentinamente por accidente o enfermedad, entre las especies domsticas en que se ha aplicado esta tcnica se encuentran: bovinos, caprinos, porcinos, equinos, gatos y caninos. Tambin se han utilizado para crear banco de genomas de especies salvajes en peligro de extincin. Debido a que los espermatozoides van sufriendo cambios mientras pasa el tiempo despus de haber muerto el animal el presente trabajo tiene la finalidad de medir el efecto postmortem a las 3, 24, 48y 72 horas, tomando en cuenta los principales parmetros afectados por la refrigeracin, viabilidad, motilidad progresiva y dao acrosomal. Por lo que se recolectaron testculos por orquiectoma de perros recin sacrificados, separando el conducto deferente y la cola del epiddimo, para obtener los espermatozoides mediante flujo retrogrado. A las muestras obtenidas se les evalu viabilidad, motilidad masal, motilidad progresiva y reaccin acrosomal en cada una de las diferentes horas postmortem. Los resultados obtenidos en cuanto a la viabilidad nos indicaron que conforme pasa el tiempo postmortem el porcentaje de espermatozoides vivos va disminuyendo de manera significativa, siendo a las 3 horas de 79.5 6.74%, a las 24 horas un porcentaje de 77.71 8.84 % , mientras que a las 48 horas se obtuvo un porcentaje de 64.7 7.98% y a las 72 horas de 58.5 10.50 %, en donde se observa que mientras ms tiempo postmortem pase los espermatozoides su viabilidad va disminuyendo progresivamente. Finamente se puede concluir que la motilidad masal, motilidad progresiva y viabilidad fueron descendiendo progresivamente conforme iban pasando las horas postmortem (3, 24,48 y 72 hrs), lo cual fue inversamente proporcional a los resultados obtenidos en la reaccin acrosomal, ya que en vez de que fueran descendiendo, estos se fueron incrementando, pudindose observar que efectivamente todas estas variables son afectadas por el tiempo postmortem.

2.- INTRODUCCIN La muerte inesperada de animales de alto valor gentico ya sea zootcnico, o de inters para los zoolgicos (animales en vas de extincin) as como la dificultad para obtener semen fresco en especies silvestres ha impulsado el desarrollo y la aplicacin de tcnicas de reproduccin asistida que permiten preservar la biodiversidad animal. Es as que los investigadores han dirigido sus esfuerzos a la preservacin tanto de gametos como de clulas somticas con el fin de crear bancos de material gentico para ser usado en el futuro. La obtencin de Espermatozoides Epididimales (EE), potencialmente frtiles, almacenados en la cola del epiddimo puede ser la nica opcin para preservar el material gentico de un macho de alto valor reproductivo, luego de la muerte o castracin por motivos mdicos. Este hecho es especialmente relevante en animales en vas de extincin. La recuperacin post-orquiectoma o postmortem de gametos a partir de los rganos reproductivos y la posterior criopreservacin de las mismas, es una herramienta sumamente interesante tanto para resguardar el material gentico como para crear bancos de reserva de este material (Tittarelli et al., 2007) . Entre las especies domsticas en que se ha aplicado esta tcnica se encuentran: bovinos, caprinos, porcinos, equinos, gatos y caninos. Tambin se ha utilizado para crear bancos de genomas de especies salvajes en peligro de extincin, como es el caso de bfalo africano, ciervo ibrico, oso pardo, y rinoceronte blanco. Se podra aplicar en la especie canina, utilizando al perro como modelo, para su posterior aplicacin en caninos no domsticos, ya que en la actualidad dos especies de lobos y tres de zorros estn en la lista de animales en peligro de extincin (Hernndez et al., 2004). Para la obtencin postmortem del semen, el mejor lugar en el tracto genital masculino es la cola del epiddimo por el hecho de que en esta porcin se encuentra un gran nmero de clulas espermticas con un estado de madurez muy avanzado. Sin embargo los espermatozoides obtenidos de la cola del epiddimo no han tenido contacto con el plasma seminal y puede tener un comportamiento distinto al de los eyaculados. El momento de recogida puede variar mucho segn como y donde se produce la muerte del animal y la calidad del semen puede variar segn el tiempo que transcurre entre la muerte, la recogida, y el modo de conservacin de las muestras durante este tiempo. La evaluacin de las formas anormales y de las gotas citoplasmticas es un criterio muy importante en la contrastacin seminal dado que la fertilidad del semen est relacionada con la calidad y la morfologa de las clulas espermticas (Tittarelli et al., 2007).

En la actualidad, la crianza de perros es una aficin de distribucin mundial; consecuentemente, la conservacin de semen y la inseminacin artificial se han constituido en temas de alta relevancia en la actividad mdico veterinaria (LindeForsberg, 2001). Por lo tanto es importante sealar que se podran obtener espermatozoides viables provenientes de la cola del epiddimo con movilidad y capacidad fertilizante, poco tiempo despus de la muerte del animal, que podran ser procesados y congelados para su posterior uso en inseminacin artificial.

3.-- MARCO TERICO. 3.1 Epiddimo 3.1.1- Anatoma del epiddimo El epiddimo es la estructura que le sigue a los conductos eferentes, en la parte dorsal del testculo (Salisbury et al., 1978). Tiene forma de un tbulo elongado y tortuoso empaquetado en un saco de tejido conectivo que es una extensin de la tnica albugnea (Barrios, 2002). Hafez y Hafez (2002) menciona que se reconocen tres regiones anatmicas del epiddimo. Se estructura de tal forma que pueden distinguirse tres porciones perfectamente diferenciadas entre s: - Cabeza: situada en el borde crneo-lateral del testculo y difcilmente puede palparse. - Cuerpo: se sita sobre la superficie dorso-lateral y tampoco es posible su palpacin. - Cola: se localiza sobre el polo dorso-caudal, se palpa fcilmente en un perro sano normal y es una pequea protuberancia (Allen, 1992). La estructura anatmica ms relevante desde el punto de vista reproductivo es la cola del epiddimo, ya que acta como reservorio de espermatozoides hasta que se produce la eyaculacin y desemboca en una estructura tubular recta que es el conducto deferente que tambin cumple funciones de almacenamiento de espermatozoides (Ruberte y Sautet, 1998; Hewitt, 2000). Los espermatozoides maduran a lo largo de su paso por el epiddimo; en la especie canina, este perodo es de aproximadamente 14 das (Allen, 1992). Diversos autores describen la presencia de unas clulas llamadas espermifagos en el testculo y en el propio epiddimo, cuya funcin sera la de fagocitar a los espermatozoides no eyaculados facilitando as su destruccin y posterior reabsorcin (Illera, 1984).

3.1.2- Fisiologa del epiddimo. Las funciones del epiddimo son el transporte y la maduracin de los espermatozoides (Chenoweth, 1997) los cuales, a travs del pasaje por los conductos eferentes y el epiddimo, adquieren la habilidad de tener movimiento progresivo lineal y la capacidad de fertilizar (Jonson y Everitt, 1980). Durante este proceso, en la clula espermtica ocurren cambios funcionales, bioqumicos y morfolgicos (Jonson y Everitt, 1980; Amman y Schanbacher, 1983; Chenoweth, 1997). Tambin ocurre la reabsorcin e intercambio de fluidos. Especficamente en la cabeza del epiddimo ocurre la reabsorcin de solutos y fluidos, en el cuerpo del epiddimo la maduracin espermtica, y en la cola del epiddimo el almacenamiento de los espermatozoides frtiles (Barrios, 2002). Entre las principales caractersticas de las funciones del epiddimo se encuentran: 1. Transporte, son varios los factores que contribuyen al movimiento de los espermatozoides por el epiddimo, uno es la presin que ejercen los espermatozoides en los tbulos seminferos y la red testicular; otro factor que posiblemente ejerza influencia sobre el movimiento de los espermatozoides son los cilios presentes en el epiddimo (Bearden y Fuquay, 1982; Hafez y Hafez, 2002). 2. Concentracin, diariamente el testculo segrega una gran cantidad de lquidos hacia el epiddimo (hasta 60 ml en el carnero), este es absorbido principalmente en la cabeza del epiddimo (Bearden y Fuquay, 1982; Hafez y Hafez, 2002). 3. Almacenamiento, el epiddimo cuenta con las condiciones adecuadas para almacenar espermatozoides viables hasta por 60 das (Bearden y Fuquay, 1982). La cola del epiddimo es el principal rgano de almacenamiento, pues casi el 75% de los espermatozoides en el epiddimo se encuentran en esta ltima estructura (Hafez y Hafez, 2002). 4. Maduracin, cuando los espermatozoides entran a la cabeza del epiddimo no tienen la capacidad de movilidad y de fertilidad, y es en el epiddimo donde la adquieren, adems de perder una gota citoplasmtica ubicada en el cuello (Bearden y Fuquay, 1982). Los espermatozoides almacenados en el epiddimo conservan capacidad fecundante por varias semanas; la cola de esta estructura es el principal rgano de almacenamiento, alrededor del 75% de las clulas espermticas alojadas en el epiddimo. La capacidad especial de la cola de almacenar espermatozoides depende de las temperaturas relativamente bajas del escroto y de la accin de la hormona sexual del macho (Hafez y Hafez, 2002).

Los espermatozoides almacenados en las ampollas constituyen slo una pequea parte de las reservas extragonadales totales en semen eyaculado semanas o incluso meses despus de la castracin se observan pequeas cantidades de espermatozoides inmviles (Hafez y Hafez, 2002). 3.2- Evaluacin de espermatozoides de epiddimo y eyaculado Los espermatozoides de la cola del epiddimo se le consideran como maduros y presentan los factores de capacitacin adquiridos en el cuerpo del epiddimo, la membrana plasmtica de los espermatozoides eyaculados es ms estable que la de los del epiddimo. Se piensa que el plasma seminal tambin contienen una serie de sustancias que provocan en el espermatozoide una segunda capa protectora (Ortiz, 2000). La maduracin espermtica incluye procesos tales como, la adquisicin de la movilidad progresiva, cambios morfolgicos, metablicos en la membrana espermtica, as como, la adquisicin de la capacidad de la unin o la zona pelcida del poder fecundante. Sin embargo, no se conoce la forma precisa en qu momento durante el transito espermtico por epiddimo el espermatozoide adquieren estas propiedades. Aun que es posible que los espermatozoides de la regin de la cabeza epididimaria van adquiriendo algunas de estas funciones, otra posibilidad es que a en dicha regin la clulas espermtica ha conseguido algunas de ellas, aunque aun no sea capaz de expresarlas (Ortiz, 2000). Tabla1. Evaluacin de espermatozoides de eyaculado y obtenidos de cola de epiddimo en caninos. Espermatozoides Concentracin total % Morfologa % Motilidad % Viabilidad (millones) Progresiva Epididimarios 583.09607.1 68.513.08 53.9727.22 5510.57 414.9178.3 87.76.9 95.73.6 86.54.5 Eyaculado (Hernndez et al., 2004; Albers y Barrios., 2006; Snchez et al., 2006) 3.3- Efecto postmortem El efecto del tiempo postmortem sobre la calidad de muestras recogidas de cadveres ha sido objeto de atencin en diversos estudios. La importancia de este factor es muy importante, ya que muestras de gran calidad pueden deteriorarse rpidamente, sobre todo si se mantienen en condiciones inadecuadas (Martnez, 2004). Phillip en (1997), mencion obtener espermatozoides vivos en animales con 19 horas de muertos, los cuales fueron capaces de fecundar vulos de hembras. En esta situacin la calidad espermtica que se obtuvo vara dependiendo de la causa de la muerte y de las condiciones ambientales en la que fue mantenido los cadveres desde la muerte hasta la obtencin de los espermatozoides.

El cuerpo permanece enteramente vivo, y los rganos comienzan a morir cada uno en su orden, apareciendo los primeros signos a nivel celular, signo que puede ser incluso reversible hasta en un determinado momento, los signos ms importantes de destruccin intracelular (autolisis) se consideran que aparecen a las 24 horas, aunque no exista ningn estudio publicado sobre la evolucin de estos signos en tejidos testiculares. Ortiz en el (2000), menciona que el intervalo de tiempo transcurrido desde la muerte del animal hasta el momento de la extraccin de los espermatozoides puede ser un factor limitante de esta tcnica. Sin embargo se han relacionado trabajos en mufln y en ciervo, en los que se han observado que espermatozoides obtenidos de hasta 48 horas despus de la muerte del animal, en ciervo y mufln, respectivamente, son capaces de penetrar ovocitos de hmster libres de la zona pelcida. Adems, en otras especies tambin se han conseguido obtener espermatozoides epididimarios con capacidad fecundante, despus de varias horas de la muerte del animal. As en el morrueco, se ha observado tasas de divisin celular de 50 y 30%, para espermatozoides epididimarios obtenidos de 24 y 48 horas post mortem respectivamente. Dentro de los factores que determinan la viabilidad de los espermatozoides, el tiempo transcurrido desde la muerte del animal hasta la congelacin de los gametos y el manejo que se le d al epiddimo durante ese tiempo, van a ser unos de los factores ms condicionantes para la supervivencia y capacidad fecundante de los espermatozoides en el futuro (Anel et al., 2002). La viabilidad de los espermatozoides depende del tratamiento dado al epiddimo. En ratones, el 30% de los espermatozoides conservan su motilidad cuando son mantenidos a 4 C por 10 das, considerando que la motilidad decrece de 10 a 15% en las 24 h siguientes a la muerte en cadveres que son conservados a temperatura ambiente. Estos estudios muestran que los espermatozoides recuperados de especmenes luego de su muerte, incluso muchas horas despus, mantienen su funcin normal (Yu y Leibo, 2002). Espermatozoides del epiddimo con una motilidad de 70 a 90% pueden ser obtenidos varias horas despus siempre y cuando los rganos sean refrigerados inmediatamente (Gerber et al., 2002). Segn Anel et al. (2002) dependiendo del intervalo entre la recuperacin de los espermatozoides y la muerte, la motilidad espermtica disminuir significativamente entre las 24 y 48 horas. Despus de las 48 horas postmortem, todas las medidas de calidad del esperma declinan progresivamente. Este autor, tambin sugiriere que el tejido del epiddimo debe refrigerarse antes de las 48 h despus de la muerte con el fin de asegurar una mayor probabilidad de vida de los espermatozoides.

Martnez en el (2004), menciona que trabajando con los ciervos rojo Ibrico, encontr que la calidad del espermatozoide pareca reducir al cabo de 12 horas postmortem, y la proporcin de muestras clasificadas como excelentes tenian la motilidad progresiva del 60%, la morfologa normal del 40%, acrosomas intactos > 40% despus de ese momento cayeron, llegando a 0% en el perodo 24-36 h. Hishiuma et al. (2003) mencionaron que los espermatozoides de ciervo japons obtenidos del epiddimo refrigerados por 7 das disminuy su motilidad, obteniendo del da 0 (78%) al da 4 con un 41.8% de su motilidad. En cuanto a la viabilidad obtuvieron un 82.4% al da 0 y un 80.5% al da 4. En comparacin con el ciervo rojo ibrico se obtuvieron de las 0 a las 24 horas una motilidad de 49.36%, con una viabilidad de 68.45%, en donde se observ durante las 24 a las 48 horas se fue disminuyendo su motilidad a 56.36%, mientras que su viabilidad aumento a 71.95% (Anel et al., 2002). Yu y Leibo en el (2002) mencionaron que espermatozoides tomados del epiddimo en perros conservados a 4C durante 40 horas de refrigeracin obtuvieron una motilidad de 35%, donde disminuy a las 48 horas a un 25%. Killian et al. (2000) compararon la motilidad espermtica de antlopes, Gemsbok y el bfalo africano de la hora 0 a la hora 108, donde observaron que la motilidad en las tres especies fue disminuyendo en el transcurso del tiempo, donde se puede resaltar que a las 48 horas post mortem se obtuvieron un 41% en el antlope, el Gemsbok se obtuvo un 20%, mientras que en el bfalo africano se obtuvo un 40%. 3.4- Refrigeracin del semen La refrigeracin del semen a temperaturas que fluctan entre los 4 y 6 C es una alternativa simple para la conservacin de espermatozoides caninos con adecuada capacidad fecundante. La refrigeracin del semen condiciona una menor tasa metablica de los espermatozoides, permitiendo extender su supervivencia por periodos cortos. Se ha descrito que el potencial fecundante de los espermatozoides expuestos a bajas temperaturas, depende fundamentalmente de la resistencia de la membrana plasmtica (plasmalema) al dao causado por los cambios de temperatura (Snchez et al., 2006). Los principales daos celulares inducidos por la refrigeracin incluyen alteraciones morfolgicas como ruptura de la membrana plasmtica (principal estructura afectada durante la refrigeracin), degeneracin acrosomal y lesiones en las mitocondrias. La prdida de las propiedades de selectividad en la permeabilidad de la membrana es uno de los hechos que ms precozmente se producen en el proceso, est asociada a las fases de transicin de los lpidos de la membrana debidas al choque trmico.

3.4.1- Susceptibilidad al choque trmico Uno de los problemas ms evidentes en los procesos de conservacin del semen es el conjunto de alteraciones en el espermatozoide, designadas colectivamente como choque trmico. Dichas alteraciones se ponen en evidencia por la prdida irreversible de viabilidad que se produce cuando el espermatozoide se enfra rpidamente a 0C y cuya seal ms evidente es la prdida de motilidad tras el calentamiento; observndose movimientos circulares de los espermatozoides y prdida precoz de la motilidad. Adems se observan otras lesiones como son la disminucin de la produccin energtica y el aumento de la permeabilidad de la membrana. Debido a este fenmeno, la refrigeracin previa a la congelacin se lleva habitualmente a cabo con mucha precaucin, de modo que el enfriamiento se realiza lentamente, aunque esto no evita que los cambios de temperatura originen alteraciones en las membranas (Andrade, 2005). Esto demuestra que el espermatozoide se hace susceptible al choque trmico en la regin proximal del cuerpo del epiddimo, cuando la gota citoplasmtica se mueve en direccin a la porcin distal de la pieza intermedia; por tanto, durante la maduracin del espermatozoide en el epiddimo, ste adquiere la motilidad pero tambin la susceptibilidad al choque trmico (Andrade, 2005). Existen evidencias de que el choque trmico y las lesiones irreversibles asociadas resultan de alteraciones en la organizacin de los lpidos de la membrana del espermatozoide o fases de transicin lipdica. A la temperatura fisiolgica, los fosfolpidos de membrana estn en un estado ms o menos fluido y sus cadenas de cidos grasos son flexibles (Andrade, 2005). Se sabe que algunos lpidos de la membrana del espermatozoide, los lpidos no-bicapa, asumen una disposicin hexagonal, estando implicados en la formacin de un anillo alrededor de las protenas que integran la membrana. As que, la temperatura de la membrana disminuye por debajo de la temperatura de transicin de cada uno de los fosfolpidos individuales que la componen. stos sufren la fase de transicin termo trpica del estado lquido-cristalino al estado gel, comenzando a agregarse. Concretamente, las cadenas de cidos grasos toman rigidez y se aslan en dominios de gel, de los cuales son excluidas las protenas de la membrana que se concentran en reas fluidas; como se ha demostrado mediante microscopa electrnica. Este fenmeno afecta las funciones de las protenas, por ejemplo, en los canales proteicos inicos (Watson, 2000). Los lpidos no-bicapa son los que probablemente sufren en primer lugar la fase de transicin, agregndose en micro-dominios de gel bicapa. Tras la refrigeracin y principalmente tras el calentamiento, los micro-dominios de lpidos bicapa no restablecen las asociaciones con los restantes componentes de membrana y las regiones resultantes de agregados hexagonales pueden potencialmente desestabilizar la membrana.
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La reorganizacin de los lpidos perturba principalmente las asociaciones normales lpido-lpido y lpido-protena que son imprescindibles para una funcin normal de la membrana. La disposicin anormal de los fosfolpidos puede permitir la rpida entrada de molculas que en situaciones normales atravesaran la membrana lentamente. Tras la descongelacin, la capacidad de fusin y las respuestas de la membrana a las seales de transduccin pueden tambin verse alteradas, lo que conduce a la capacitacin precoz y, en consecuencia, a la reduccin de la longevidad del semen tras la descongelacin (Watson, 1995). La susceptibilidad al choque trmico vara con las especies, considerndose los espermatozoides de toro y de cerdo entre los ms sensibles donde se manifiesta por marcadas alteraciones en el movimiento de iones, con acumulacin de Ca2+ y prdidas de K+ y Mg2+. Por el contrario, los espermatozoides del hombre, aves, perro y conejo no evidencian alteraciones tan marcadas. Adems en los espermatozoides de toro y cerdo se ha detectado acumulacin de Na+. Algunos constituyentes de la membrana espermtica son altamente importantes en el grado de susceptibilidad de los espermatozoides de las distintas especies al choque trmico, esto es, los fosfolpidos y los cidos grasos (Watson, 1995). 3.5- Medio de extraccin. EI diluyente o medio de extraccin, es una solucin acuosa que permite, adems de incrementarse el volumen del eyaculado mantener la funcionalidad de la clula espermtica hasta el momento de la Inseminacin artificial (Gmez et al., 2004). Los diluyentes seminales tienen como principal funcin la proteccin de la integridad y funcionalidad de la membrana plasmtica de los espermatozoides. Los diluyentes proveen de sustratos energticos y permiten la mantencin de condiciones estables de pH y osmolaridad en el medio extracelular (Bearden y Fuquay, 1982). Principales funciones del diluyente. Crear espacio entre los espermatozoides, disminuyendo la aglutinacin. Proporcionar nutrientes a la clula espermtica. Proteger al espermatozoide del shock trmico. Evitar la intoxicacin celular asociada a la acumulacin de desechos gracias a las sustancias conservantes y quelantes incluidas en sus frmulas. Evitar las fluctuaciones de pH mediante sustancias amortiguadoras o tampn.

Controlar la presin osmtica. Inhibir el desarrollo microbiano gracias a los antibiticos que contienen (Gmez et al., 2004).

3.5.1.- Fructuosa (Fuente de energa). En general, los monosacridos, cumplen diversas funciones en el diluyente: proporcionan una fuente de energa para la clula espermtica, mantiene la presin osmtica y, adems, ejercen accin crioprotectora (Baquero et al., 2004). Aunque en principio, la principal fuente de energa son los monosacridos del plasma seminal (glucosa y fructosa), tambin puede emplear como sustrato energticos lactato, piruvato, glicerol y glicerol-3 fosfato. En general la mayora de los diluyentes emplean glucosa como sustrato energtico ya que la principal va de obtencin de energa es la gluclisis. Adems, estudios in vitro han demostrado que la glucosa no es un mero sustrato energtico, sino un modulador funcional especfico ya que, hay cambios especficos en la membrana, dependientes de glucosa, durante la capacitacin y la penetracin (Garde et al., S/A). 3.5.2.- Tris (agentes tamponadores). Para la correcta preservacin del semen, resulta fundamental mantener el pH entre 6,8 y 7,4 este rango, permite reducir el metabolismo y la motilidad de la clula espermtica alargando as su vida media. Para el mantenimiento de dichos valores, los diluyentes incorporan en sus frmulas agentes tamponadores como bicarbonato v citrato sdico. TES, HEPES o TRIS (Gmez et al., 2004). 3.5.3.- cido ctrico (quelantes). Son sustancias que capturan calcio impidiendo su utilizacin por parte del espermatozoide. El calcio, acta como mediador en los procesos de capacitacin y reaccin acrosmica tras los cuales el espermatozoide muere por tanto, la disminucin del calcio disponible en la dosis seminal permite prolongar la vida til del semen (Gmez et al., 2004, Garde et al., S/A). 3.6- Evaluacin del semen 3.6.1- Motilidad El mtodo tradicional para determinar la motilidad espermtica consiste en utilizar una gota de semen que se deposita entre un porta y un cubre para evaluar el movimiento de los espermatozoides, generando as una pelcula fina que permita determinar de forma ms o menos precisa el nmero de clulas mviles presentes en la muestra, e incluso realizar una valoracin de si el tipo de movimiento observado es normal o no. Se observan varios campos por muestra utilizando para ello un microscopio ptico con contraste de fases a 200-400 aumentos.
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Como todo el material debe encontrarse atemperado a 37-39 C, se debe disponer de una placa trmica y el microscopio debe poseer una platina calentadora o una cmara con bulbos de luz incandescente (Rota et al., 1995). Cuando el semen ha sido sometido a un procedimiento de refrigeracin, se considera que la motilidad puede oscilar entre 20-80%. Como norma general, se acepta que la motilidad seminal post-refrigeracin es aceptable cuando alcanza valores del 60-70% (Rota et al., 1995). . 3.6.2- Viabilidad El procedimiento ms habitualmente utilizado para la valoracin de la vitalidad son las tcnicas de tincin vital que permiten diferenciar los espermatozoides vivos de los muertos debido a la permeabilidad de la membrana plasmtica a los colorantes vitales; por lo tanto, aquellas clulas que presentan una membrana plasmtica funcional no permiten el paso del colorante, mientras que si est alterada el colorante penetra en el interior de la clula (Silva et al., 1996). El mtodo ms tradicional es la tincin con eosina-nigrosina, que tambin se utiliza para la valoracin de las morfoanomalas. El procedimiento muestra una extensin donde aparecen clulas vivas de color blanco sobre un fondo prpura, o teidas de rosa si estn muertas. El mayor inconveniente que presenta el uso de la eosina-nigrosina es que, al ser un colorante hipotnico que se aade a una muestra que no ha sido fijada qumicamente, puede producir morfologas anormales en los espermatozoides, especialmente defectos en la cola (Pea, 2000). La extensin se valora en un microscopio provisto de contrastes de fases a 100400 aumentos, y se deben contar un mnimo de 200 clulas y, a partir de ah, extrapolar el porcentaje de clulas vivas. En la mayora de los trabajos, se considera que un semen es de muy buena calidad cuando se observa un 9095% de espermatozoides vivos en fresco. En cuanto al semen congelado, el valor mnimo aceptable de vitalidad es del 80% (Silva et al., 1996). 3.6.3- Dao acrosomal El acrosoma es un pequeo depsito situado en el extremo apical de la cabeza del espermatozoide y que contiene enzimas hidrolticas. La misin de stas es el debilitamiento y ruptura -por efecto colaborativo de varios espermatozoides- de las distintas paredes que envuelven al vulo. Est limitado por la membrana acrosomal externa (adosada a la membrana celular) y por la membrana acrosomal interna (adosada a la membrana nuclear (Pea y Linde-Forsberg, 2000). El acrosoma es un organelo espermtico que cumple una funcin esencial en el proceso de fecundacin. Est revestido externamente por el plasmalema y la membrana acrosomal externa e internamente por la membrana acrosomal interna. La importancia funcional del acrosoma se debe a su rol en la fijacin y penetracin espermtica de la zona pelcida y en la fusin entre gametos. Aun cuando la membrana acrosomal interna es bastante resistente, la doble membrana que constituye la pared acrosomal puede alterarse fcilmente por efectos fisiolgicos o no fisiolgicos.
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Este organelo tiende a romperse en el proceso de refrigeracin y calentamiento teniendo por consecuencia que el espermatozoide pierde su capacidad fecundante (Pea y Linde-Forsberg, 2000). Los procesos de criopreservacin afectan la integridad acrosmica. El acrosoma debe estar intacto en el momento de la inseminacin debido a que la reaccin acrosmica debe ocurrir en el sitio donde ocurra la fertilizacin. La morfologa acrosmica puede ser observada mediante microscopio de contraste de fase, microscopio electrnico de transmisin, lectinas marcadas con sustancias fluorescentes y anticuerpos monoclonales (Daz et al., 2002) Los espermatozoides considerados vivos y con membrana acrosomal intacta emiten fluorescencia verde en la cabeza y zona media del espermatozoide, donde se encuentran las mitocondrias. En cambio, espermatozoides muertos emiten fluorescencia roja, por la tincin con yoduro de propidio, que marca el DNA de los espermatozoides daados, presentndose en la zona de la cabeza (Acevedo et al., 2010).

4.- OBJETIVOS

4.1.- Objetivo general Evaluar la viabilidad e integridad acrosomal de espermatozoides de caninos obtenidos de cola de epiddimo a diferentes tiempos postmortem.

4.2.- Objetivos particulares Realizar las tinciones de eosina-nigrosina para el diagnostico de viabilidad espermtica por cada tiempo (3, 24, 48 y 72 hrs). Realizar una comparacin entre dos tcnicas de valoracin de viabilidad espermtica en espermatozoides de cola de epiddimo a diferentes tiempos postmortem. Realizar el espermograma a cada muestra obtenida Valorar la integridad acrosomal de los espermatozoides obtenidos a las 3, 24, 48 y 72 horas postmortem mediante la tincin azul de coomassie.

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5.- METODOLOGA 5.1-Material Extraccin de testculos Hielera Bisturi Suero Hartmann Tijeras de diseccin Hilo de seda Vasos estriles Guantes de Ciruga Gel fro

Extraccin de espermatozoides Gasas Plato Tijeras de diseccin Tubos Falcn de 50 ml Jeringas Estriles Gradillas Medio de extraccin (Fructuosa)

Evaluacin de espermatozoides Microscopio Pipetas graduadas Portaobjetos Cubreobjetos Eosina Nigrosina

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Contador de leucocitos y eritrocitos 5.2 Mtodos

Este trabajo se llevo a cabo en la Universidad Autnoma Metropolitana unidad Xochimilco, en el laboratorio de Bioqumica de la Reproduccin y en el Centro de Control Canino de la Delegacin Tlahuac. 5.2.1 - Recoleccin de Muestras 1- Se recolectaron desde el mes de Septiembre hasta Diciembre 5 muestras de testculos, por semana, de perros sacrificados en el Centro de Control Canino de la Delegacin Tlahuac, del cual solo se escogieron las 10 mejores muestras por cada hora (3, 24, 48 y 72 hrs) 2- Para la obtencin de testculos se utilizo la tcnica de orquiectoma, que consiste en incidir el escroto para la obtencin de los testculos y conducto deferente. 3.- Posteriormente las muestras solucin Hartmann. se colocaron en frascos estriles con

4- Se trasportaron en una hielera a 4 C y se llevaran a laboratorio de Bioqumica de la reproduccin (Albers et al., 2006). 5.2.2- Preparacin del medio de extraccin 1- Se pesaron 2.9 gr de Tris, 1.32 gr de Acido ctrico y 1.25 gr de Fructuosa. 2- Se disolvieron en 100 ml de agua destilada hasta quedar totalmente homognea 3- Se envasaron en tubos falcom de 15 ml y se guardarn en refrigeracin a 4C para su posterior utilizacin (Hernndez et al., 2004). 5.2.3- Mtodo para la recoleccin de espermatozoides epididimarios. Para la obtencin de espermatozoides se utilizo la tcnica de Lavado Retrogrado, la cual consiste en: 1- Separar el conducto deferente y la cola del epiddimo del testculo. 2- Posteriormente se colocar la cola y una porcin del conducto deferente en un tubo falcn de 15 ml. 3- Se introdujo fructuosa como medio para la extraccin de espermatozoides; esto se lleva a cabo utilizando una jeringa insulinica introduciendo el bisel en la luz del conducto deferente y con presin suave y continua se extrajo el contenido epididimario, representado por un lquido espeso y cremoso (Albers et al., 2006).
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5.2.4- Evaluacin de espermatozoides epididimarios. 1- Una vez obtenida la muestra de espermatozoides se realizo una evaluacin, en la que se midi motilidad progresiva, viabilidad y dao acrosomal. A) Motilidad Progresiva: Con una pipeta se extrajo 0.4 microlitros de la muestra que se encontraba en el tubo falcn y se deposito en un portaobjeto inmediatamente se puso el cubreobjetos y se observo en el microscopio ptico a 10 x y despus a una ampliacin de 40 x para observar los movimientos de los espermatozoides, se les dio un porcentaje del 0 100 % B) Viabilidad: con una pipeta se tomaron 0.4 microlitros de la muestra y deposito en el portaobjeto, inmediatamente se deposito sobre la muestra 0.2 microlitros de eosina y se hizo una mezcla, despus se depositaron sobre esta mezcla 0.4 microlitros de nigrosina y se realizo un barrido sobre el portaobjeto, se dejo secar y se observo en el microscopio ptico a un enfoque de 10 x y despus de 40 x, los muertos aparecieron teido y los vivos estuvieron sin teir, se les dio un porcentaje de 0 100 % (Alamo, 2007) 6.- ACTIVIDADES REALIZADAS 1. Bsqueda de Literatura: Durante toda la investigacin se llevo acabo con la finalidad de obtener mayor informacin 2. Obtencin de Testculos por medio de orquiectomias: Se realizo en el Centro de Control Canino de la Delegacin Tlahuac en un periodo de 4 meses. 3. Evaluacin de las muestras: Las muestras obtenidas se evaluaron mediante un espermograma clsico para determinar si las muestras eran o no aptas para su procesamiento. Anlisis de resultados: Los resultados que se obtuvieron se analizaron estadsticamente y representados en graficas.

4.

7.- OBJETIVOS Y METAS ALCANZADAS Se evalu la motilidad masal, motilidad progresiva , viabilidad e integridad acrosomal de espermatozoides de caninos obtenidos de la cola del epiddimo a diferentes tiempos post-mortem (3,24,48 y 72 hrs)

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8.- RESULTADOS Tabla 1.- Comparacin de la Motilidad Masal en diferentes horas postmortem de muestras obtenidas de la cola del epiddimo de testculos de perros. Horas Postmortem 3 hrs 24 hrs 48 hrs 72 hrs Movilidad Masal 81 5.16 74.64 6.68 58.5 10.01 52.5 12.30

Grafica 1.- Comparacin de la Motilidad Masal a diferentes horas postmortem.

MovilidadMasal
100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 3hrs 24hrs 48hrs 72hrs

MovilidadMasal

En la Grafica 1, se muestra el porcentaje de movilidad masal a diferentes tiempo postmortem (3, 24, 48 y 72 horas), en donde se observa que entre ms tiempo postmortem la motilidad masal va disminuyendo, obteniendo a las 3 horas un 81 5.16 %, y a las 24 horas un 74.64 6.68 %, mientras que a las 48 horas se obtuvo un 58.5 10.01 % y a las 72 horas un 52.5 12.30 %.

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Tabla 2.- Comparacin de la Motilidad Progresiva en diferentes horas postmortem de muestras obtenidas de la cola del epiddimo de testculos de perros.

Horas Postmortem 3 hrs 24 hrs 48 hrs 72 hrs

Motilidad Progresiva 73 9.92 68.21 7.88 57 7.88 53 11.10

Grafica 2.- Comparacin de la Motilidad Progresiva en diferentes horas postmortem

MovilidadProgresiva
100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 3hrs 24hrs 48hrs 72hrs

MovilidadProgresiva

En la Grafica 2, se muestra el porcentaje de movilidad progresiva a diferentes tiempo postmortem (3, 24, 48 y 72 horas), igualmente se observa que al aumentar las horas de extraccin postmortem la movilidad de los espermatozoides va disminuyendo progresivamente, obteniendo a las 3 horas un 73 9.92 %, a las 24 horas un 68.21 7.88%, mientras que a las 48 horas se obtuvo un 57 7.88 % y a las 72 horas un 53 11.10 %

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Tabla 3.- Comparacin en Viabilidad en diferentes horas postmortem demuestras obtenidas de la cola del epiddimo de testculos de perros. Horas Postmortem 3 hrs 24 hrs 48 hrs 72 hrs Viabilidad 79.5 6.74 77.71 8.84 64.7 7.98 58.5 10.50

Grafica 3.- Comparacin en Viabilidad en diferentes horas postmortem

Viabilidad
100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 3hrs 24hrs 48hrs 72hrs

Viabilidad

En la Grafica 3, se muestra el porcentaje de Viabilidad a diferentes tiempo postmortem (3, 24, 48 y 72 horas), en cuanto a la viabilidad espermtica de los espermatozoides recuperados de cola de epiddimo fue disminuyendo conforme aumentan los tiempos postmortem, obteniendo a las 3 horas un 79.5 6.74 %, y a las 24 horas un 77.71 8.84 %, mientras que a las 48 horas se obtuvo un 64.7 7.98 % y a las 72 horas un 58.510.50 %.

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Tabla 4.- Comparacin Dao Acrosomal en diferentes horas postmortem de muestras obtenidas de la cola del epiddimo de testculos de perros. Horas Postmortem 3 hrs 24 hrs 48 hrs 72 hrs Reaccin Acrosomal 8.9 4.1 9.3 3.47 10.7 3.54 11.14 4.29

Grafica 4.- Comparacin de Dao acrosomal en diferentes horas postmortem

ReaccinAcrosomal
14 12 10 8 6 4 2 0 3hrs 24hrs 48hrs 72hrs ReaccinAcrosomal

En la grafica 4 se muestra el porcentaje de Reaccin Acrosomal a diferentes tiempos postmortem (3. 24, 48 y 72 hrs) en donde se puede observar que al contrario de las otras graficas , mientras ms tiempo se tengan las muestras en refrigeracin mayor ser la reaccin acrosomal, debido al dao que ocurre en la membrana plasmtica de los espermatozoides, asi mismo el tiempo postmortem es un factor determinante, obteniendo a las 3 horas un 8.9 4.1%, a las 24 horas un 9.3 3.47%, mientras que a las 48 horas se obtuvo un 10.7 3.54 % y a las 72 hrs un porcentaje de 11.14 4.29 %

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Tabla 5.- Comparacin entre las evaluaciones de las diferentes horas postmortem de muestras obtenidas de la cola del epiddimo de testculos de perros. Horas Postmortem 3 hrs 24 hrs 48 hrs 72 hrs Movilidad Masal 81 5.16 74.64 6.68 58.5 10.01 52.5 12.30 Motilidad Progresiva 73 9.92 68.21 7.88 57 7.88 53 11.10 Viabilidad 79.5 6.74 77.71 8.84 64.7 7.98 58.5 10.50 Reaccin Acrosomal 8.9 4.1 9.3 3.47 10.7 3.54 11.14 4.29

Grafica 5.- Comparacin entre las evaluaciones de las diferentes horas postmortem

100 95 90 85 80 75 70 65 60 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Movilidad Masal Motilidad Progresiva Viabilidad Reaccin Acrosomal

3hrs 24hrs 48hrs 72hrs

En la Grafica 5 se puede observar que como vimos en las graficas pasadas mientras mayor sea el tiempo de refrigeracin de las muestras obtenidas a diferentes horas postmortem (3,24,48 y 72 hrs) menor ser el porcentaje de movilidad masal, movilidad progresiva y viabilidad, y la reaccin acrosomal ser mayor mientras mas tiempo se mantengan en refrigeracin .

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9.- Discusin El aumento del valor y las posibilidades de comercializacin de los cachorros de raza pura as como el aumento de la importancia de la cra canina tanto desde el punto de vista econmico, recreativo o para la obtencin de perros de trabajo ha impulsado el desarrollo e implementacin de las biotecnologas reproductivas en esta especie. En los caninos la obtencin y conservacin postmortem de espermatozoides viables de cola de epiddimo, se ha considerado como una tcnica de gran importancia para la preservacin de animales con alto valor gentico y particularmente til en casos donde la colecta de semen es difcil, como sucede en los animales salvajes. La obtencin de espermatozoides de animales muertos es una posibilidad de gran importancia para la preservacin de animales en peligro de extincin, como tambin de animales de alto valor gentico o de laboratorio . Para prevenir un deterioro en ms especies de animales es necesario implementar o crear bancos de recursos genticos de animales en vas de extincin o de alto valor gentico para la reproduccin de stos (Amann et al., 1993). La refrigeracin del semen a temperaturas que fluctan entre los 4 y 6 C (Goodman y Cain, 1993) es una alternativa simple para la conservacin de espermatozoides caninos con adecuada capacidad fecundante. La refrigeracin del semen condiciona una menor tasa metablica de los espermatozoides, permitiendo extender su supervivencia por periodos cortos. Se ha descrito que el potencial fecundante de los espermatozoides expuestos a bajas temperaturas, depende fundamentalmente de la resistencia de la membrana plasmtica (plasmalema) y al dao causado por los cambios de temperatura (shock trmico) (Hammerstedt et al.,1990). Aunque todava no se dispone de ningn mtodo o procedimiento que permita determinar por medicin directa el poder fecundante de los espermatozoides, se conocen algunas de las caractersticas que debe de exhibir el semen de buena calidad, entre estas se encuentran las caractersticas morfolgicas, los que resultan importantes dentro del anlisis seminal, como lo son la movilidad masal, movilidad progresiva, la viabilidad, y la reaccin acrosomal, ya que de ello depender el poder fecundante de los gametos (Briz et al., 1996). En cuanto a los resultados obtenidos sobre la motilidad masal, en comparacin con los resultados de Yu et al. 2002 a las 3 hrs que fue de 63.6 con un error estndar de 5.0, se puede observa que en comparacin a los resultados en esta investigacin a las 3 hrs, fueron inferiores ya que nosotros obtuvimos una motilidad masal promedio de 81 con un error estndar de 5.16. Por otra parte Martnez 2003, menciono que en ciervo rojo ibrico la calidad espermtica del esperma se redujeron al cabo de las 12 horas posmortem obteniendo una motilidad de 60% en donde al cabo de las 24-36 horas se llego a 0, esto refleja una motilidad alta en comparacin con nuestros resultados, ya que en motilidad se observa un 58.50 con un error estndar de 10.01 a las 48 horas.

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Anel et al. (2002) obtuvieron espermatozoides del ciervo rojo ibrico a las 24-48 horas con una motilidad de 56.36 con un error estndar de 4.39 y a las 48-72 horas 16.65 con un error estndar de 3.07, con un porcentaje bajo en comparacin a nuestros resultados a las 24 hrs, de 74.64 con un error estndar de 6.68 , a las 48 hrs un porcentaje de 58.50 con un error estndar de 10.01, y a las 72 hrs un 52.5 con un error estndar de 12.30, que como se puede observar son promedios altos en comparacin con dichos autores. Esto se explicara en base a que ellos utilizaron diferentes especies, y el manejo que se utilizo, y a lo dicho por Kikuchi et al. (1998) quienes comunicaron que la motilidad de espermatozoides porcinos almacenados a 4C por 1 2 das baja signifcativamente, este hecho poda relacionarse con la sensibilidad de los espermatozoides a las bajas temperaturas, percatndose que a mayor tiempo post mortem la motilidad va decreciendo poco a poco, lo cual concuerda con lo dicho por Manosalva et al. 2005. quien dice que la motilidad permite predecir la capacidad fecundante in vitro de los espermatozoides. Sin embargo, se sabe que la motilidad espermtica es particularmente dependiente de la funcin mitocondrial, las mitocondrias se encuentran estratgicamente distribuidas alrededor de la pieza media del espermatozoide para proveer energa a la dinena que propulsa a los microtbulos. Las mitocondrias son la mayor fuente de energa oxidativa a travs de la produccin de ATP va la cadena transportadora de electrones (ECT). La actividad mitocondrial se afecta de la misma manera que la motilidad, indicando que la refrigeracin afecta inicialmente la membrana mitocondrial, y esto causa la disminucin de la motilidad Sanchez et al. (2002) obtuviern resultados en cuanto a Motilidad progresiva a las 0 hrs de semen refrigerado a 4C de 95.7 6.74, a las 24 hrs de un 93.0 4.5, 48 hrs de un 91.0 6.0 y a las 72 hrs de 89.0 6.1, lo cual en comparacin a los resultados obtenidos en esta investigacin fueron superiores, ya que nosotros obtuvimos a las 3 horas un porcentaje de 73%, con una desviacin estndar de 9.92, a las 24 horas un porcentaje de 68.21% con un error estndar de 7.88 , mientras que a las 48 horas se obtuvo un porcentaje de 57 % con un error estndar de 7.88 y a las 72 horas un porcentaje de 53 y un error estndar de 11.10. A lo cual como se puede apreciar hubo una tendencia prcticamente lineal en la disminucin de la motilidad progresiva Estas observaciones podran explicarse por un efecto acumulativo del shock trmico sobre las clulas espermticas a travs del tiempo (Batellier et al., 2001). En cuanto a la viabilidad (Alvers y Barrius, 2006) obtuvieron un 55 10.57 de perros recin sacrificados; por lo que reflejan una motilidad y viabilidad ms baja en comparacin con nuestros resultados obtenidos en esta investigacin, los cuales como se puede observar en la Grafica 3, a las 3 hrs se obtuvo una viabilidad de 79.5 6.74, por otro lado Hishuima et al. (2003) mencionaron que en ciervo japons los espermatozoides obtenidos del epiddimo refrigerado durante 4 das mostraron 80.5% de viabilidad en comparacin con los del ciervo rojo ibrico al obtener espermatozoides de 24-48 horas con un 71.95 2.46 y que a las 48-72 horas vario con 52.84 3.43, estos resultados fueron bajos en comparacin con los obtenidos en esta investigacin, ya que en cuanto a la viabilidad espermtica a las 24 hrs postmortem se obtuvo un promedio de 77.71 8.84, mientras que 48 hrs con 64.7 64.7 7.98 y a las 72 hrs con un 58.5 10.50.

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En ciervos (Cervus elaphus) y mufones (Ovis musimon) se demostr que almacenando los espermatozoides obtenidos de la cola del epiddimo por ms de 40 horas a temperatura ambiente, tanto la viabilidad como la capacidad fecundante descenda al aumentar el intervalo de tiempo entre la muerte del animal y la recuperacin espermtica (Garde y col., 1994). Esto se explica por que como dice Silva, et al, 2002 , se ha observado que la longevidad del semen canino es signifcativamente mayor a 4 C que a 22 C. Adems de que la refrigeracin del semen condiciona una menor tasa metablica de los espermatozoides, permitiendo extender su supervivencia por periodos cortos. Se ha descrito que el potencial fecundante de los espermatozoides expuestos a bajas temperaturas, depende fundamentalmente de la resistencia de la membrana plasmtica al dao causado por los cambios de temperatura. .Uno de los problemas ms evidentes en los procesos de conservacin del semen es el conjunto de alteraciones en el espermatozoide, designadas colectivamente como choque trmico. Dichas alteraciones se ponen en evidencia por la prdida irreversible de viabilidad que se produce cuando el espermatozoide se enfra rpidamente a 0C y cuya seal ms evidente es la prdida de motilidad tras el calentamiento; observndose movimientos circulares de los espermatozoides y prdida precoz de la motilidad (Andrade, 2005). Otros factores que ayudaron a la motilidad y viabilidad de nuestros espermatozoides lo atribuimos a los medios de extraccin que se utilizaron ya que estos proveen de sustratos energticos y permiten la mantencin de condiciones estables de pH y osmolaridad en el medio extracelular. (Bearden y Fuquay, 2002). El mayor porcentaje de reaccin acrosomal se observ a las 6 hrs en espermatozoides frescos, en tanto que la mayor parte de reacciones acrosomales ocurri a las 3 hrs en espermatozoides refrigerados, en concordancia con otros estudios en caninos (Rota et al., 1999) y ratones (Fuller y Whittingham, 1997). Lo cual concuerda con lo obtenido en esta investigacin Este resultado podra ser explicado por una desestabilizacin a nivel de la membrana, producto del refrigeramiento, en donde la composicin lipdica de la bicapa se ve afectada por la tasa de refrigeracin, lo cual causara que el calcio se encuentre ms permeable y por tanto entrara al espermatozoide iniciando la capacitacin y en consecuencia la reaccin acrosomal. Este proceso ha sido determinado previamente en espermatozoides de ovino a temperatura inferior de 15 C (Maxwell y Jonson, 1999). Por otro lado el efecto de la eliminacin del plasma seminal por centrifugacin y la dilucin de los espermatozoides podra causar desestabilizacin de la membrana espermtica (Huo et al., 2002).

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Por lo tanto se podra decir que en base a los resultados se puede sugerir que la motilidad, viabilidad, y reaccin del acrosoma son afectados por la refrigeracin. Esto sera una indicacin que la vulnerabilidad de la membrana acrosomal y de la membrana mitocondrial ocasionara la disminucin de la motilidad espermtica. El hallazgo de valores mayores de integridad mitocondrial que de motilidad podra sugerir que la muerte celular se realiza por apoptosis (Dinsdate et al., 1998; Green y Reed, 1998; Sun et al., 1999). Otros autores han sealado que este estado mitocondrial podra ser debido a alteraciones en el metabolismo de energa sin dao de integridad de membrana (Vetter et al., 1998); sin embargo, los resultados del presente estudio permiten postular que el efec to de la refrigeracin es a nivel de integridad de membrana mitocondrial debido a la disminucin de la integridad de membrana acrosomal. El efecto de la refrigeracin sobre los espermatozoides caninos se ve reflejado en la disminucin de la motilidad, integridad de membrana y actividad mitocondrial y en el aumento de la reaccin acrosomal. La dinmica de la motilidad, integridad de membrana acrosomal y actividad mitocondrial es similar en espermatozoides refrigerados y frescos. La cintica de la reaccin acrosomal en espermatozoides refrigerados ocurre en un tiempo previo con respecto a espermatozoides frescos.

10.- Conclusiones En base a lo obtenido en esta investigacin se puede concluir que la motilidad masal, motilidad progresiva y viabilidad fueron descendiendo progresivamente conforme iban pasando las horas postmortem (3, 24,48 y 72 hrs), lo cual fue inversamente proporcional en cuanto a los resultados obtenidos en la reaccin acrosomal, ya que en vez de que fueran descendiendo, estos se fueron incrementando, pudindose observar que efectivamente todas estas variables son afectadas por la refrigeracin.

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11.- REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS Acevedo F., Yasna A., Alcayaga V., Alfaro A., Alvial F., Allamand M. 2010. Tcnicas avanzadas de evaluacin de la funcionalidad espermtica: Universidad de Chile, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Departamento de la Produccin animal. Alamo S. D., (2007). Crioconservacin y Viabilidad Espermtica en la especie canina: Utilizacin de nitrgeno lquido. Universidad de las Palmas de Gran Bretaa. pp: 74-82 Albers, A. M. y Barrios A. D. (2006). Movilidad Individual de los Espermatozoides Epididimarios de Toros Postmortem obtenidos mediante Lavado Retrogrado. Zootecnia Tropical. 24:3 Allen, W. E. (1992). Fertility and obstetrics in the Dog. Ed. Blackwell Scientific Publications, Oxford, pp: 33-55; 136-140. Amann, R. P. Schanbacher, B.D. (1983). Physiology of male reproduction. J. Anim. Sci., 57: 2 (380-403) Amann, R.P., and Hammersted, R.H. 1993. In Vitro evaluation of sperm quality. an opinion. J. Androl. 14:397-406. Andrade M. C. A., (2005) Influencia en la Calidad Espermtica de la Adicin de Distintas Concentraciones de Crioprotectores para la Conservacin de Semen Canino, Tesis Doctorado, Universidad Complutence de Madrid Anel, L., Gerra, C., Alvarez, M., Anel, E., Martinez, A.F., Boixo, C.J., Kaabi, M., Herraez, P., and Paz, P. (2002). Effect of postmortem interval in quality of epididymal spermatozoa in Iberian Red Deer (Cervus elaphus hispanicus). Theriogenology; 57: 577 Baquero, P.J; Pardo, R.E; Cruz, C.P. (2004). Evaluacin de dos diluyentes para la conservacin de semen canino bajo condiciones de refrigeracin: efectos del tiempo de refrigeracin, grado de dilucin y de la concentracin de fructuosa. Colombia: universidad de los Llanos Villavicencio. p.p.9 Barrios, A.D.R. (2002). Evaluacin de la calidad y capacidad fecundante de espermatozoides de la cola el epiddimo de toros post-mortem. Memorias: XI Congreso Venezolano de Produccin e Industria Animal. Universidad Central de Venezuela. Batellier, F., Vidament, M., Fauquant, J., Duchamp, G., Arnaud, G., Yvon, J., and Magistrini, M. 2001. Advances in cooled semen technology. Animal Reprod. Sci. 68: 181-190. Bearden J. H. y Fuquay W. J. 2002. Reproduccin Animal Aplicada. El Manual Moderno. Mxico. pp. 141-164 Briz, M.D.; Bonet, S.; Pinart, B.; Sperm malformations throughout the boar epididymal duct. Animal Reproduction Science, v.43, p. 221-239, 1996. Chenoweth P. 1997. Clinical reproductive anatomy and physiology of the bull. En Youngquist R.S. Current Therapy in Large Animal Theriogenology. Saunders. pp. 217- 229..
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14.- ANEXOS. Tablas de resultados de motilidad masal, motilidad progresiva, viabilidad y reaccin acrosomal de testiculos de perros obtenidos de la cola del epididimo a las 3 hrs post mortem

Numerodemuestras 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Motilidad Masal 80 85 80 80 85 80 90 70 80 80

MotilidadProgresiva Viabilidad 75 70 70 75 80 70 85 60 70 75 80 73 87 83 84 80 87 68 78 75

Reaccin Acrosomal 12 14 8 6 6 18 10 11 16 6

Tablas de resultados de motilidad masal, motilidad progresiva, viabilidad y reaccin acrosomal de testiculos de perros obtenidos de la cola del epididimo a las 24 hrs post mortem
Numero de muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Motilidad masal 60 70 70 60 60 75 70 70 80 70 Motilidad progresiva 65 75 60 70 70 70 65 60 85 60 Viabilidad Reaccin acrosomal 18 17 10 20 16 3 5 15 5 5

59 79 63 66 73 83 75 72 87 68

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 Tablas de resultados de motilidad masal, motilidad progresiva, viabilidad y reaccin acrosomal de testiculos de perros obtenidos de la cola del epididimo a las 48 hrs post mortem

Numero Motilidad Motilidad de masal progresiva muestras 1 50 55 2 60 50 3 40 45 4 50 55 5 60 50 6 60 55 7 60 65 8 60 65 9 75 70 10 70 60

Viabilidad

Reaccin acrosomal 13 9 6 12 5 8 3 10 14 9

57 66 59 63 57 59 79 75 68 64

Tablas de resultados de motilidad masal, motilidad progresiva, viabilidad y reaccin acrosomal de testiculos de perros obtenidos de la cola del epididimo a las 72 hrs post mortem.

Numerode muestras 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Motilidad masal 50 40 60 70 40 50 60 70 50 35

Motilidad Viabilidad progresiv a 55 56 40 43 65 61 60 78 50 50 55 61 50 67 60 63 65 61 30 45

reaccin acrosomal 5 9 14 11 13 3 7 10 16 5

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