Tipos de PCR

PCR anidada
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Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer amplicn se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificacin dentro del amplicn inicial. Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La especificidad aumenta porque como es amplificacin de un amplicn obtenido previamente, los cebadores slo van a hibridar en un sitio dentro de la molcula y el resultado ser una nica banda. As, evitamos posibles hibridaciones inespecficas de los cebadores. La desventaja de sta tcnica es que no nos permite cuantificar la muestra.

PCR in situ

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La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR in situ se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequesimas de genoma. Esta tecnologa es de gran alcance en la capacidad de amplificar especficamente una poblacin de secuencias de menor representacin.

PCR mltiplex

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PCR en la cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin. Emplea dos o ms pares de cebadores en un nico tubo con el fin de amplificar simultneamente mltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una nica reaccin todos pares de cebadores de los sistemas que queremos amplificar simultneamente, junto con el resto de los reactivos de la reaccin en cantidades suficientes. Sus ventajas: se obtiene la informacin de varios loci en una sola reaccin, menor cantidad de molde para el anlisis, menor cantidad de reactivos, rpida construccin de base de datos.

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)

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Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa (como Tth) para realizar la sntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sera: 1er paso: retrotranscripcin a partir del ARN. 2 paso: aplificacin a partir de la primera hebra de ADNc. 3er paso: PCR estndar.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativa (qPCR)

Artculo principal: PCR en tiempo real

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Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presentes en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN especficas a partir de su temperatura de fusin (tambin denominado valor Tm , del ingls melting temperature). Se puede dividir en las tcnicas basadas en fluorocromos no especficos y en las tcnicas basadas en sondas especficas. En las tcnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar slo una secuencia por reaccin pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realizacin. Es mucho ms econmica que la que usa sondas especficas. Las tcnicas basadas en sondas especficas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); cuando la sonda est intacta, presenta una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda est daada y los dos fluorocromos estn distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrn de fluorescencia y deducir el nivel de amplificacin del gen. La mayora de estos inconvenientes se han solucionado con la introduccin de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresin de la amplificacin en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulacin del ADN al final de un nmero predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificacin usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar fcilmente usando un sistema que realice la amplificacin (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayora pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las condiciones de amplificacin y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos determinados.