Universidad Tcnica Federico Santa Mara

Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental

Laboratorio de Introduccin a la Microbiologa

Practico N 3
RECUENTO BACTERIANO Y ANLISIS DE AGUA

CRECIMIENTO BACTERIANO
Introduccin
Crecimiento es el incremento ordenado de todos los componentes de un
organismo. La multiplicacin celular es una consecuencia del crecimiento. En organismos
unicelulares la multiplicacin conduce a un aumento en el nmero de individuos dando
lugar a una poblacin o aun cultivo.
El crecimiento microbiano puede medirse en trminos de concentracin celular
(nmero de clulas por unidad de volumen de cultivo) o densidad celular (peso seco de
las clulas por unidad de volumen de cultivo). Estos dos parmetros no siempre son
equivalentes, debido a que el promedio de peso seco de la clula vara en las distintas
etapas de la historia del cultivo.

Cintica exponencial
Durante la fase exponencial de crecimiento, la tasa de incremento de la masa
bacteriana en un tiempo determinado es proporcional a la masa presente:
dB/dt = B

(1)

donde B es la masa bacteriana, t el tiempo y la tasa constante de crecimiento

instantneo para cada cultivo concreto ( es decir el aumento relativo por unidad de
tiempo) Por tanto:
dB/B = dt (o d ln B = dt)

(2)

Bt = Bo et; e integrando: (3)

lnBt/Bo = t, o ln Bt = ln Bo + t

(4)

Por tanto, durante esta fase, la representacin grfica del logaritmo de B frente al
tiempo da lugar a una lnea recta. Esta grfica semilogaritmica suele ser la que se emplea
para representar curvas de crecimiento bacteriano. Suele ser til expresar la tasa de
crecimiento como tiempo de duplicacin (tD), denominado tambin tiempo medio de

Universidad Tcnica Federico Santa Mara

Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental

generacin (TMG). Este valor se obtiene asignando a Bt el valor 2Bo en la ecuacin 4 (

es decir, el doble):
ln Bt/Bo = ln2 = tD
tD = (1/) ln 2 = 0,69 (1/)
1/tD = = 1,45
El valor recproco del TMC, (= 1/tD), es la tasa constante de crecimiento
exponencial, expresada en generaciones por hora. Su valor es 1,45 veces mayor que la
tasa constante de crecimiento instantneo , ya que el valor de B, y, por tanto, de B,
aumenta continuamente durante el crecimiento exponencial, y cuando se duplica la masa
bacteriana, la tasa de sntesis celular se duplica con respecto al instante inicial (ver
Figura de grfica).

RECUENTO DE MICROORGANISMOS
El recuento es un procedimiento que permite conocer el nmero de
microorganismos que hay en una muestra. Para este propsito, existen diferentes
mtodos mediante los cuales se pueden contar microorganismos vivos (recuento de
viables), o bien vivos y muertos (recuento de totales). A su vez todos los tipos de
recuento, se pueden clasificar en directos e indirectos. Un recuento directo es aquel en el
que se cuentan las clulas por observacin directa al microscopio, y el recuento indirecto
es aquel en el que se determina el nmero por crecimiento o alguna propiedad de los
microorganismos.

Universidad Tcnica Federico Santa Mara

Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental

1.- Recuento de Totales

a) Recuento de Breed
Es un mtodo que entrega recuento de totales. Se utiliza para recuento de
microorganismos en la leche.
Para realizar este mtodo usted, sobre un porta objetos limpio y desengrasado
dibuje con un lpiz un cuadrado de un centmetro cuadrado.
Homogenice la muestra problema y con una pipeta Pasteur coloque una gota de
la muestra (aproximadamente 0,01 ml) sobre el cuadrado y extindala bien sin salirse de
l.
Seque y fije al calor suavemente, luego cubra la extensin con cristal violeta
durante un minuto. Lave con agua y seque.
Observe al microscopio con aceite de inmersin.
Cuente el nmero de microorganismos en varios campos, no menos de 5. Luego
calcule el promedio de microorganismos contados y multiplique por 3000 (rea del
campo del microscopio) y por 100 (inverso del inoculo colocado en el cuadrado).
N de clulas/ml = X de clulas por campo x 3000 x 100
3000, corresponde al rea del campo del microscopio y debe ser calculado para
cada uno, o referirse al fabricante.
100, corresponde al inverso del inoculo depositado en el portaobjeto.

b) Recuento con cmara de Petroff-Hauser o Hemocitmetro.

Este mtodo consiste en colocar una diminuta gota de cultivo en un portaobjetos
especial llamado Hemocitmetro (porque fue ideado originalmente para el recuento de
glbulos rojos). La muestra queda depositada en un espacio de 0,02 mm entre el porta
y el cubreobjeto. La excavacin completa tiene 25 cuadrados cada uno dividido en 16
cuadrados ms pequeos. Para calcular el nmero de clulas por ml de muestra, se debe
hacer la siguiente operacin:
-

Contar las clulas presentes en varios cuadrados grandes y sacar un

promedio.
Multiplicar el promedio por 25 (con esto se obtiene el N de clulas en un
mm2).
Multiplicar por 50 (esto entrega el nmero de clulas en un mm3).
Multiplicar por 1000, para transformar todo a cm3.

N cel/ml = X cel x 25 x 50 x 1000

Este recuento representa la cantidad de clulas vivas y muertas. El mtodo es
aplicable a cualquier suspensin de partculas microscpicas.

Universidad Tcnica Federico Santa Mara

Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental

c) Recuento con sales de tetrasolium.

Las sales de tetrasolium son un compuesto que se agrega a la preparacin, el cual
se reduce como producto del metabolismo y las clulas se tien de color rojo. Las clulas
muertas quedan sin teir (el compuesto no es utilizado y queda insoluble).
d) Recuento por Microscopia de Fluorescencia.
Las bacterias se tien con naranja de acridina, compuesto que es capaz de
integrarse al DNA bacteriano por lo que las clulas vivas quedaran fluorescentes. ste
mtodo es tambin un mtodo de recuento de viables y no de totales y directo.

2.- Recuento de clulas viables.

En muchos casos queremos contar slo las clulas vivas. Una clula viva se
define como aquella capaz de dividirse, y un conteo de la viabilidad celular generalmente
se efecta determinando la cantidad de clulas de una poblacin que son capaces de
dividirse y formar colonias. El mtodo de conteo en placas es el ms ampliamente usado
y dos son las versiones de esta tcnica: la placa vertida y la placa extendida.

Universidad Tcnica Federico Santa Mara

Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental

a) Mtodo de la placa extendida

En el mtodo de la placa extendida, una muestra generalmente pequea de 0,1 ml se
extiende aspticamente sobre la superficie de una placa de cultivo con el medio adecuado
y bien seco y se incuba hasta que las colonias son visibles a simple vista.
Se entiende que cada colonia se originan de una sola clula por lo tanto contando el
nmero de colonias se puede calcular la cantidad de clulas viables de la muestra.
b) Mtodo de la placa vertida
Con el procedimiento de la placa vertida, la muestra se mezcla con el agar el cual
debe encontrarse a una temperatura de 45 a 50C colocndose posteriormente sobre la
placa de Petri estril. Los microorganismos quedan entonces fijos dentro del agar y
forman colonias. Con las placas servidas se pueden emplear volmenes de muestra de 1,0
ml o ms, siendo posible el recuento de lodos o suspensiones como las que se obtienen
de alimentos o medios homogeneizados. Una desventaja importante de esta tcnica es
que los microorganismos daados por el breve calentamiento del agar fundido no pueden
contarse.
El recuento en placa es muy sensible debido a que, en principio, cualquier clula
viable, si se pone en medio de cultivo adecuado, dar lugar a una colonia. Adems de su
sensibilidad, el recuento en placa permite tambin la identificacin positiva del organismo
que se va a contar, en vista de que la colonia formada puede servir como inoculo para un
cultivo puro puede a su vez ser identificado taxonmicamente. Ms aun, puesto que
organismos diferentes frecuentemente producen colonias diferentes en forma, textura,
tamao y color, diferentes tipos de organismos pueden contarse en una mezcla. Una de
las principales suposiciones en los procedimientos para el recuento en placa es que cada
colonia se origina de una sola clula, pero sin por el azar dos clulas quedan dispuestas
muy cerca de una de la otra, durante la incubacin, pueden dar origen a una sola colonia
fusionada, que no puede diferenciarse de la que se origin de una sola clula.
La experiencia prctica ha determinado que debe haber menos de 300 colonias
por cada placa de cultivo para minimizar el problema.
c) Mtodo de las diluciones y plaqueo (viables).
Se toma 0,1 ml de un cultivo problema bien homogeneizado con una pipeta
estril y se diluye progresivamente en tubos con 9 ml de solucin salina estril al 0,8% de
NaCl.
En lo posible se recomienda hacer cada dilucin con una pipeta nueva
homogeneizando bien la suspensin en cada paso.
Se obtienen as las siguientes diluciones:
10-1 , 10-2 , 10-3 .................................... 10-8 , 10-9, 10-10

Universidad Tcnica Federico Santa Mara

Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental

De las tres ltimas se toma 0,1 ml y se siembra en la superficie de una placa de

Petri con agar nutritivo bien seco y posteriormente con un asa de Drigalsky se
homogeniza la siembra por todo el medio el cual debe estar bien seco.
Incubar las placas a la temperatura adecuada de crecimiento durante 24-48 horas.
Una vez incubadas las placas, cuente el nmero de colonias que aparecen en cada
una de ellas y saque un promedio. Tome en cuenta las placas que contengan entre 30 y
300 colonias solamente.
Luego el valor promedio del nmero de colonias multiplicado por el valor
recproco de la dilucin correspondiente y por 10 (colocamos 0,1 ml de inoculo) nos da
el nmero de microorganismos por ml de la muestra problema.
N cel/ml = X colonias x factor de dilucin x 10
Ejercicio: Si en la placa correspondiente a la dilucin 10-8 aparecen 38 colonias,
el nmero de microorganismos viables por ml de muestra inicial ser?

d) Mtodo Turbidimtrico.
Un medio de cultivo estril, que ha sido inoculado va presentando turbidez a
medida que la poblacin celular va en aumento. Este fenmeno puede ser medido en un
espectrofotmetro.
Se coloca un volumen medido de cultivo, en un tubo especial de vidrio
transparente de dimetro conocido. Este es interpuesto entre una unidad de foco
luminoso, y otra unidad fotoelctrica, la cual est acoplada a un galvanmetro o disco de
lectura, el cual registra el porcentaje de la luz transmitida a travs de la suspensin de

Universidad Tcnica Federico Santa Mara

Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental

clulas. El porcentaje de tramitancia de la luz a travs del tubo se relacionar de manera

inversa con la turbidez del tubo.
Este mtodo es rpido, sencillo y puede determinarse el nmero de clulas
correspondiente a cada lectura por recuento en placa. Con l se puede confeccionar la
curva de crecimiento de un cultivo bacteriano, informacin necesaria cuando se desea
trabajar con cultivos en fase exponencial.

Figura El espectrofotmetro. (a) El espectrofotmetro mide la turbidez, es decir, la

cantidad de luz que transmite un cultivo, expresada en unidades de absorbancia. La
clula bacteriana dispersa la luz, de manera que no es detectada por el detector sensible a
la luz. (b) El tubo de la izquierda no tiene clulas bacterianas y est transparente. El de la
derecha contiene alrededor de mil millones (109) de clulas por mililitro y, por lo tanto,
est turbio. (c) La curva patrn relaciona la absorbancia con el nmero de clulas
bacterianas por mililitro. Una vez que se obtiene, esta curva puede usarse para convertir
cualquier medida de absorbancia en nmero de clulas. Por ejemplo, a partir de esta
curva, una lectura de 1,6 unidades de absorbancia significa que el cultivo contiene 100
millones (108) de clulas por mililitro

e) Nmero ms probables de microorganismos.

Es posible hacer determinaciones de conteo de viabilidad empleando slo cultivos
lquidos, con la tcnica del Nmero Ms Probable (NMP). En esta tcnica, la muestra
que va a ser contada se diluye hasta que la densidad celular sea de menos de 1 clula por
ml. En estas condiciones ya no es apropiado hablar de concentraciones de clulas, sino
ms bien de la probabilidad de encontrar una clula. Por ejemplo, si existen 5 clulas en
10 ml, la concentracin puede expresarse como 5 x 10-1 clulas por ml. Sin embargo, las
clulas viables son desde luego individuales, por lo tanto, decimos que en

Universidad Tcnica Federico Santa Mara

Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental

este ejemplo existe una probabilidad de 0,5 por cada ml del tubo de que contenga una
clula viable. Si el tubo se vaciara tomando 10 muestras de 1 ml cada una, 5 de ellas se
esperara que contuvieran una clula y 5 que carecieran de ella. Este concepto es la base
del procedimiento del NMP. Se toma una cantidad de muestra pequea por duplicado
(generalmente 1 ml), de una muestra diluida, y cada una de ellas es inoculada en un tubo
separado de medio fresco de crecimiento, que posteriormente es incubado para permitir
la proliferacin del microorganismo. Los tubos que reciben una clula mostrarn
crecimiento (proliferacin) y los que no la tienen no mostrarn crecimiento. La
proporcin de tubos inoculados que muestran crecimiento es una medida de la
probabilidad que se acaba de mencionar. Esta probabilidad puede convertirse
nuevamente a concentracin celular en la muestra, considerando el nmero de diluciones
y el empleo de las tablas del NMP. Las tablas del NMP son una derivacin estadstica del
nmero ms esperado o ms probables de clulas que producir el patrn de crecimiento
observado. Para que llegue a ser til es procedimiento del NMP, la muestra debe diluirse
lo suficiente, sino se hace esto, todas las muestras contendrn clulas viables y todos los
tubos inoculados mostrarn crecimiento cuando se incube. Por el contrario, si la muestra
ha sido muy diluida, ninguno de los tubos inoculados mostrar crecimiento.
El mtodo est diseado para trabajar con series de 3, 5 y 10 tubos por cada
dilucin. Cuando mayor sea la cantidad de tubos empleados, mayor ser la precisin del
mtodo.

El mtodo del nmero ms probable (NMP) proporciona un recuento de viables. Al

aumentar el factor de dilucin, se alcanza un punto en el que algunos tubos contienen
slo un organismo y los otros, ninguno. A partir del nmero, determinado por los tubos
que presentan turbidez en tres diluciones sucesivas (en este caso 5, 3, 1), puede
determinarse el nmero ms probable de clulas. Este valor, multiplicado por el factor de
dilucin nos proporciona el nmero de clulas viables de la muestra.

Universidad Tcnica Federico Santa Mara

Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental

El mtodo del NMP se utiliza para contar microorganismos que son difciles de cultivar
en medio slido. Tambin se usa para determinar el nmero de clulas de un cultivo
mixto que pueden crecer en un medio lquido determinado. Por ejemplo, puede
emplearse para determinar la contaminacin del agua potable, determinando el nmero
de bacterias que pueden crecer en un medio que contiene lactosa. Estas bacterias
probablemente sean Escherichia coli provenientes de aguas residuales contaminadas, y la
presencia de E. coli en el agua potable es una prueba presuntiva de contaminacin.

f) Recuento en filtro de membrana.

f.1) Introduccin
En 1955 la dcima edicin de los Standar Methods for Examinacion of Water, inclua
como mtodo tentativo en la determinacin de coliformes la tcnica de filtracin por
membrana.
En las ediciones siguientes de esta publicacin, ste mtodo se hizo oficial para la
determinacin de coliformes. Actualmente, est siendo utilizada como un mtodo
normalizado. Cada laboratorio deber realizar pruebas comparativas con la tcnica de los
tubos mltiples con la finalidad de poder aplicarla mejor.
Esta tcnica permite examinar volmenes muy variables de agua y ofrece
resultados directos de la concentracin de bacterias coliformes en lugar de un estimado
estadstico, como es el caso de la tcnica de los tubos mltiples. Ciertos tipos de
muestras no pueden ser filtradas debido a la presencia de turbiedad, poblaciones
excesivamente altas de bacterias no coliformes, o metales pesados. Estas dificultades
pueden encontrarse al examinar muestras de algunas aguas de pozos, lagos pequeos o
efluentes industriales.

f.2) Resumen del mtodo

El procedimiento de filtracin consiste en pasar con ayuda del vaco la muestra de
agua a travs de una membrana de celulosa de 0,45 micrones. La limitacin con los
volmenes depende tambin de la presencia de turbiedad. Cuando se trata de aguas
contaminadas es necesario diluir previamente las muestras. Para efectuar la dilucin se
debe tener en consideracin que el nmero ideal de colonias en el filtro de membrana
est entre 20 y 60. La muestra se filtrar a travs del filtro de membrana
convenientemente colocado en el soporte de filtracin.
El filtro es colocado en una placa de petri conteniendo un medio con agar adecuado:
M-FC para coliformes fecales, temperatura de incubacin 44,5C por 24 horas
M-Endo para coliformes totales, temperatura de incubacin 37C por 24 horas.
El tiempo transcurrido desde la filtracin hasta la incubacin no debe exceder a los 30
minutos.

Universidad Tcnica Federico Santa Mara

Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental

Ventajas
Los resultados son obtenidos ms rpidamente, principalmente para bacterias
del grupo coliformes.
Volmenes mayores de muestra pueden ser examinadas
Los resultados son ms precisos que los esperados por la tcnica de los tubos
mltiples
Los equipos y materiales necesarios ocupan menor espacio con relacin a la
tcnica de los tubos mltiples.
Limitaciones
En las muestras con bajo recuento de coliformes y relativamente gran
cantidad de slidos en suspensin, el crecimiento bacteriano se puede
constituir a veces en una pelcula continua sobre la superficie de la membrana,
imposibilitando el recuento.

Universidad Tcnica Federico Santa Mara

Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental

Ejercicios
1.- En el estudio de una curva de crecimiento a las 4 horas se determin el nmero de
microorganismos por el mtodo de Breed, obtenindose al contar 3 campos 11, 8 y 10
MO. A las 16 horas por el mtodo de diluciones y plaqueo, tres placas presentaron 150,
215, 180 UFC, con un inoculo de 0,01 en la dilucin 10-8. Calcule:
a) Tiempo generacional
b) K
2.- Una muestra se diluyo a la tercera parte de su volumen, posteriormente se realizaron
5 diluciones decimales y tres centesimales. A partir de la serie de diluciones centesimales,
se siembran 3 series de 5 tubos por dilucin, mediante NMP. Despus de la incubacin se
obtuvieron los siguientes resultados: 534
Calcule el NMP/ml
3.- Se toma 1 litro de agua de pozo para ser analizado mediante la tcnica de los tubos
mltiples: de esta forma se tomaron 10 ml y se diluyeron en 90 ml de solucin salina,
luego se realizaron diluciones sembrndose 3 alicuotas de 1 ml de cada dilucin hasta la
dilucin 10-3. Se obtuvieron los siguientes resultados: 532.
Calcule el N de NMP/l.
4.- En el estudio de una curva de crecimiento a las 4 horas se determin el nmero de
microorganismos por el mtodo de Breed, obtenindose al contar 5 campos 13, 9, 7, 9 y
12 MO. A las 16 horas por el mtodo de dilucin y plaqueo, se toman 800 [mL] y de
estos 10 [mL] se diluyen en 90 [mL]. Luego se hacen 7 diluciones decimales. AL
sembrar en placas de la ltima dilucin se obtienen: 310, 470, 301 UFC. A continuacin
se realizan 8 diluciones decimales, 2 centesimales y 7 milesimales, sembrando de la
penltima dilucin en una serie de placas obteniendo como resultado: 310, 250, 130, 70,
28, 13. Calcule:
a) Tiempo generacional
b) K
5.- De una muestra de leche, se realiz el recuento de Breed en 6 campos distintos,
contando 6, 7, 15, 4 y 8 microorganismos a las 5 horas. Luego, de 50 [mL] de leche, se
tomaron 25 y se diluyen en 225 [mL] de caldo peptonado, de esa dilucin, se realizaron
6 diluciones decimales, 5 centecimales y 4 milidecimales, del ltimo tubo, se sembr en
placas, obteniendo 500, 298, 150, 420, 49, 63 y 301 UFC a las 10 horas. Calcular:
a) N microorganismos/mL
b) N microorganismos/mL de la muestra inicial
c) Constante k
d) Tiempo Generacional

Universidad Tcnica Federico Santa Mara

Departamento de Ingeniera Qumica y Ambiental

6.- Se desea conocer el nmero de microorganismos presente en una muestra de agua y

su tiempo de duplicacin. Se entrega las curvas de crecimiento y absorbancia y adems
se recomienda para obtener un buen resultado realizar 7 diluciones de 1 en 9. De la
ltima dilucin se mide la absorbancia obtenindose 1.68.
Absorbancia vs tiempo

Curva de Crecim iento

2,5

1500000

MOml

Absorbancia

1,5

1000000
500000

0,5

0
0

0
0

20

40
Tiem po [m in]

60

80

20

40

60

80

100

Tiem po [m in]

7.- Usted debe analizar una muestra de 400 [ml] de leche de cabra comprada en el
mercado de Valparaso, a continuacin realiza dos procedimientos paralelos para
determinar la presencia de coliformes:
Procedimiento A: Se realizan 3 diluciones milesimales y se siembra 3 series de tubos por
dilucin, mediante NMP, con un inculo de 0,1 [ml] en caldo BRILA. Despus de la
incubacin, se obtuvieron los siguientes resultados: 552.
Procedimiento B: Se realiza 2 diluciones decimales y 2 centesimales, de la ltima dilucin
se toma 1 [ml] y lo lleva a 99 [ml]. De esta ltima dilucin se filtra en triplicado para
M-ENDO y en triplicado para M-FC. El volumen filtrado cada vez fue de 1 [l]. Luego de
incubar a condiciones que cada medio requiere, se obtuvieron 110, 70 y 55 UFC en MENDO; mientras que para M-FC se contaron 20,60 y 40 UFC.
Calcule:
a) N de coliformes totales en la muestra original determinado por NMP.
b) N de coliformes fecales por [ml] de muestra por mtodo de filtracin
c) N de coliformes totales por [ml] de muestra por mtodo de filtracin

8.- Se desea saber el grado de contaminacin de un ro. Se toman 400 [L] de los cuales
se sacan 10 [mL] y se diluyen en 90 [mL]. Luego se diluye hasta la dilucin 10-7. A
partir de esta se realizan una siembra en 4 placas con la tcnica de placa extendida,
obteniendo 301, 420 y 450 UFC. Ms tarde se hacen 10 diluciones ms: 3 decimales, 5
centesimales y 2 milesimales, tomando de la penltima dilucin y sembrando por tcnica
de placa extendida en 7 placas obteniendo 380, 280, 140, 32, 29, 75 y 83 Calcular el N
de microorganismo en la muestra original.

100