REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) y otras tcnicas moleculares en el estudio de afecciones dermatolgicas

Noris Rodrguez
nmrodric@gmail.com

Miguel A. Barrios

Venezuela
Laboratorio de Ingeniera Gentica, Instituto de Biomedicina, Universidad Central de Venezuela: Apdo. postal 4043, caracas 1010 A; Email: nmrodric@gmail.com. Telefax: 0212 8648624

Reaccin en Cadena de la Polimerasa La Reaccin en Cadena de la Polimerasa, conocida como P.C.R por sus siglas en ingls (Polymerase Chain Reaction), es una tcnica de biologa molecular desarrollada en 1983 por Kary Mullis que permite la sntesis in Vitro de secuencias especficas de cido desoxirribonucleico (ADN) 1.

Fundamentos e Importancia La tcnica se basa en la replicacin del ADN en los organismos eucariotas realizada por la ADN polimerasa. Esta enzima realiza la sntesis de una cadena complementaria de ADN en sentido 5` 3`usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una regin de doble cadena. Para crear esta regin de doble cadena, se utilizan los denominados iniciadores (primers ). Estos son una pareja de oligonucletidos diseados de tal manera que sean complementarios a cada uno de los extremos del fragmento de ADN que se quiere amplificar. Este proceso se lleva a cabo mediante ciclos alternados de temperaturas altas y bajas, que permiten separar las hebras de ADN formadas entre si tras cada fase de replicacin y, la unin nuevamente de estas hebras con la polimerasa para que vuelvan a duplicarse. Todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un aparato llamado termociclador, el cual permite calentar y enfriar los tubos de reaccin (efecto Peltier) controlando la temperatura necesaria para

cada etapa de la reaccin. La automatizacin del proceso se debe al descubrimiento de la enzima Taq polimerasa termoestable, extraida del Thermus aquaticus2, que elimin el inconveniente de agregar enzima fresca en cada paso de la reaccin.

Fig 1.- Equipo (maquina de PCR), utilizado para la amplificacin del ADN. La maquina se programa con las temperaturas necesarias para cada paso de la reaccin y todo el proceso de amplificacin se realiza automticamente.

En la actualidad, la PCR es una tcnica de rutina indispensable en laboratorios de investigacin mdica y biolgica con una gran variedad de aplicaciones. La clonacin del ADN para la secuenciacin, la filogenia basada en el ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnostico de trastornos hereditarios, la identificacin de huellas genticas (usada en tcnicas forenses y prueba de paternidad), taxonoma, la deteccin y diagnostico de enfermedades infecciosas, son algunas de las aplicaciones donde la PCR ha sido implementada como una tcnica de gran valor. Componentes de la PCR Desoxinucletidos trifosfato (dNTPs). Es una mezcla de deoxi nucletidos que sirve de sustrato para la sntesis de nuevo ADN.

Iniciadores (primers). Dos oligonucletidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre 10-30 nucletidos, que son reconocidos por la polimerasa permitiendo iniciar la reaccin. Deben estar enfrentados (uno en cada hebra del ADN), para delimitar el fragmento a amplificar). ADN polimerasa. El descubrimiento en 1976 de la Taq polimerasa, una ADN polimerasa extrada de la bacteria termfila Thermus aquaticus que habita medios de muy alta temperatura (50-80 C), elimin los grandes inconvenientes del mtodo de la PCR. Esta ADN polimerasa es estable a altas temperaturas, permaneciendo activa hasta despus de la desnaturalizacin del ADN ADN molde. Molcula que contiene la regin de ADN que se va a amplificar. Etapas de la PCR La PCR consiste en una serie de cambios repetidos de temperatura llamados ciclos. Por lo general el nmero de ciclos es de 20 a 30, cada ciclo consiste en tres cambios de temperatura. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo, dependen de algunos parmetros en los que se incluye, la enzima usada para la sntesis de ADN, la concentracin de iones divalentes y dNTPs en la reaccin as como la temperatura de unin de los iniciadores 3 .

Desnaturalizacin del ADN En la primera etapa, la reaccin es llevada a una temperatura de 94-96C y se mantiene entre 30 segundos y un minuto. A estas temperaturas el ADN se desnaturaliza (se separan las dos hebras que lo constituyen). La temperatura a la cual se decide llevar a cabo esta etapa va a depender de la proporcin de Guanina-Citocina (G-C) que tenga la hebra, as como tambin del largo de la misma. Alineamiento/Unin del iniciador a la secuencia complementaria

En la segunda etapa tambin conocida como hibridacin, los iniciadores se unen a las regiones 3`complementarias que flanquean el fragmento que se quiere amplificar. Para ello, es necesario bajar la temperatura a 50-65C durante 20-40 segundos, permitiendo as el alineamiento. La polimerasa se une entonces al hibrido formado por la cadena molde y el iniciador y empieza la sntesis del ADN. Los iniciadores actan como lmite de la regin de la molcula que va a ser amplificada. Extensin/Elongacin de la cadena En la tercera etapa, la polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementario a la hebra molde, aadiendo los dNTPs complementarios en direccin 5` 3` uniendo el grupo 5`-fosfato de los dNTPs con el grupo 3`-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente. La temperatura en esta etapa depende de la ADN polimerasa que se utilice. Para la Taq polimerasa, la temperatura de mxima actividad est entre 74-80C, aunque por lo general se usa 74C. El tiempo de elongacin va a depender del tipo de polimerasa empleado, as como tambin del tamao del fragmento de ADN que se requiere amplificar. Elongacin final En la cuarta etapa, la temperatura es regulada de 70-74C durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR, con el objeto de asegurar que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente amplificado. Por ltimo, el producto amplificado es mantenido a una temperatura de 4C por un periodo indefinido lo cual permite conservar el producto de la reaccin Para comprobar que la PCR ha generado el fragmento de ADN esperado, se emplean tcnicas como la electroforesis, que permite separar los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su tamao. Por lo general se emplea la electroforesis en gel de agarosa para fragmentos grandes, en acrilamida para fragmentos ms pequeos y asociada a marcaje fluorescente as como la electroforesis capilar3, 4

Fig 2.- Equipo de electroforesis utilizado para la separacin de los productos amplificados por la PCR. La deteccin del producto de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa se realiza normalmente mediante una corrida electrofortica. Dependiendo del tamao del producto de la amplificacin y la resolucin que se desea, se utilizan diferentes matrices de separacin (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones. La posterior visualizacin se puede realizar con bromuro de etidio con una lmpara de luz UV, tincin de plata, fluorescencia o radioactividad. De igual forma, la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridacin (unin complementaria) con una sonda marcada radiactivamente, cuya secuencia de bases est contenida en el fragmento de inters. Los tamaos de los productos de PCR se determinan comparando los mismos, con marcadores que contienen fragmentos de ADN de tamao conocido los cuales se corren en el gel junto a los productos de PCR.

La Fig 3 muestra en la lnea M, los marcadores de ADN, el tamao de cada fragmento esta expresado en kilo pares de bases (Kbp) asignados en nmeros al lado izquierdo de la figura.

.Esquema general de la PCR.

Fig 4:_ Representa de manera esquemtica el proceso de amplificacin a partir del ADN extrado de la muestra. En cada ciclo se duplica el nmero de copias del ADN que se amplifica

Contaminacin en la PCR La reaccin en cadena de la polimerasa PCR es una tcnica altamente sensible y especifica, por lo que es muy importante evitar contaminaciones que puedan dar origen a la amplificacin de ADN no deseado. La contaminacin con ADN extrao puede solucionarse con protocolos y procedimientos que separen las reacciones pre-PCR (mezcla de todos los componentes de la reaccin), del ADN molde. Esto normalmente implica la separacin espacial de las reas de realizacin de la PCR de los de anlisis o purificacin de los productos, as como la limpieza exhaustiva de la superficie de trabajo entre la realizacin de un PCR y el siguiente.

Tipos de PCR PCR anidada En esta variante de PCR, el producto de una amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con iniciadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es altamente especfica 5 PCR in situ Es una PCR que se realiza en preparaciones fijadas sobre un portaobjeto. Consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Se realiza para ello una primera amplificacin del ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera puede detectarse cantidades pequesimas del material gentico 6

PCR multiplex Es una PCR en la cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin. Emplea dos o ms pares de iniciadores en un nico tubo de reaccin con el fin de amplificar simultneamente mltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una nica reaccin todos los pares de iniciadores de los sistemas que queremos amplificar simultneamente, junto con el resto de los reactivos de la reaccin en cantidades suficientes. La ventaja de esta PCR es que se obtiene la informacin de varios loci en una sola reaccin, utilizando menor cantidad de molde para el anlisis y menor cantidad de reactivos. Se puede generar rpidamente la construccin de una base de datos 7. RT-PCR Este tipo de PCR utiliza como molde inicial el ARN y se requiere de una transcriptasa inversa, para realizar la conversin del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc (ADN complementario) 8.

PCR tiempo real Es una reaccin de PRC cuya principal caracterstica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original 9. Se puede dividir en: a- Tcnica basada en fluorocromos no especficos. b- Tcnica basada en sondas especficas. En las tcnicas basadas en fluorocromos no especficos, el ADN se une al fluorocromo (por lo general SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por un termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar slo una secuencia por reaccin, pero tiene la ventaja de utilizar iniciadores normales para su realizacin. Es mucho ms econmica que la PCR que utiliza sondas especficas.

Las tcnicas basadas en sondas especficas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el iniciador directo (forward) y el inverso (reverse). Cuando la sonda esta intacta, presentan una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha fluorescencia no se produce cuando la sonda esta daada y los dos fluorocromos estn distantes, producto de la actividad 5` 3`exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio de patrn de fluorescencia y deducir el nivel de amplificacin del gen.

Random Primer PCR Esta variante de la tcnica es muy sensible y especifica, es muy til en el estudio y diagnstico de organismos de una misma especie con variaciones genticas especificas. Su aplicacin permite la amplificacin de molculas de ADN y genomas que varan entre 400 pares de bases hasta 40 Mega bases. La tcnica utiliza primes que consisten en un pool de de secuencias de los extremos 3 del ADN y una regin 5 constante para la deteccin del primer incorporado 10.

Aplicaciones El diagnstico molecular est revolucionando la prctica clnica de enfermedades infecciosas. Sus efectos sern importantes en la configuracin de la atencin de casos agudos donde oportunas y precisas herramientas de diagnstico son esenciales para las decisiones de tratamiento del paciente y los resultados. PCR es la tcnica molecular ms desarrollada hasta ahora y tiene una amplia gama de aplicaciones clnicas, incluyendo la deteccin de patgenos especficos o de amplio espectro, evaluacin de las infecciones emergentes, la vigilancia, la deteccin temprana de agentes biolgicos y la creacin de perfiles de resistencia a los antimicrobianos. Los mtodos basados en PCR tambin pueden asociarse a los procedimientos tradicionales de diagnstico. Otro avance de la tecnologa es necesario para mejorar la

automatizacin, optimizar la sensibilidad y especificidad y expandir la capacidad para detectar varios organismos simultneamente. 11 La PCR convencional es utilizada como base para un gran nmero de tcnicas en el laboratorio debido a su especificidad y rapidez. Permite identificar especies de bacterias que producen determinados cuadros infecciosos. Esto se consigue, amplificando cierta zona del genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea caractersticas particulares que permitan identificar de una manera inequvoca la bacteria o agente causal. En el caso de infecciones virales, que implican la integracin del genoma del patgeno en el ADN del hospedador, como es el caso de la infeccin por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la determinacin de la carga viral existente y por tanto, del estadio de la enfermedad 12, 13 De igual manera, la PCR es usada en servicios de donantes de sangre para test de rutina. Mediante la implementacin de la PCR, se pueden detectar infecciones peligrosas en el donante (HIV, Hepatitis B) mientras an estn en el perodo de incubacin. A su vez, en el diagnostico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma, en las cuales los procedimientos se presentan largos y engorrosos, la PCR ha venido a facilitar este problema, amplificando mediante iniciadores correspondientes los diferentes genes para la identificacin de mutaciones existentes14. En dermatologa, la aplicacin de la PCR en las enfermedades de la piel ha permitido conocer los mecanismos ntimos de muchas entidades, facilitando su diagnstico e incluso su tratamiento. Esta tcnica es ampliamente utilizada en el diagnstico de enfermedades de la piel producida por parsitos, virus y bacterias; tales como leishmaniasis 15, lepra 16, oncocercosis 17 y virus de papiloma 18, entre otras, ampliamente reportadas en la literatura. En la fig 5 se muestra un ejemplo de una reaccin de polimerasa utilizada para el diagnstico de leishmaniasis cutnea producida por Leishmania braziliensis. La reaccin se lleva a cabo un par de oligonucleotidos obtenidos a partir de una secuencia repetida de ADN nuclear de Leishmania

braziliensis. Los oligos amplifican un fragmento de 603 pares de bases en L. braziliensis (banda mostrada en la figura). La reaccin se realiz utilizando como molde ADN total extrado a partir de biopsias de pacientes con leishmaniasis cutnea localizada y es evidente la sensibilidad y especificidad en el diagnstico.

10

603 pb

Fig 5.- Visualizacin del producto de PCR en un gel de agarosa teido con bromuro de etidio. La presencia del producto esperado (banda fluorescente) indica la positividad de la muestra para el organismo responsable de la patologa observada. La muestra M, corresponde al marcador ADN utilizado como referencia. (Tomado de Rodrguez y col; 2005)

Las enfermedades hereditarias de la piel se caracterizan por mutaciones genticas. El diagnstico molecular por PCR est hoy en da disponible para mltiples enfermedades en las que anteriormente no se dispona de tcnicas diagnsticas de laboratorio sino solamente la clnica. El diagnstico mediante PCR de las enfermedades hereditarias ofrece dos ventajas claras: en primer lugar, es notablemente sensible y con frecuencia es suficiente disponer de una sola clula nucleada, y en segundo lugar, todas las clulas del organismo

contienen el mismo ADN lo que conlleva un riesgo elevado de tumores malignos 19. En otras enfermedades hereditarias existe una produccin proteica defectuosa, frecuentemente en la zona de la membrana basal, como sucede en la Epidermlisis ampollosa distrfica y juntural que se manifiesta clnicamente como fragilidad cutnea y formacin de ampollas sub- epidrmicas originadas por un trauma mnimo 20 En cuanto a las variantes de la PCR, estas tcnicas han sido implementadas para el diagnstico de numerosas enfermedades de la piel. Por ejemplo, la RT-PCR, puede ser aplicada para detectar translocaciones en los tumores de piel y partes blandas, como en el Liposarcoma mixoide y en sus variantes pobremente diferenciadas. Una lista larga de cambios cromosmicos de tumores en dermatologa se ha podido determinar con la implementacin de la RT-PCR 21, 22 .

En cuanto a las enfermedades congnitas o degenerativas de la piel se han descrito numerosas alteraciones cromosmicas que pueden igualmente ser detectadas por esta variante de la PCR. 19, 23 De igual manera, las variantes PCR asimtrica, PCR anclada y PCR anidada sirven para aumentar la sensibilidad y especificidad de la reaccin y se utilizan cuando partimos de cantidades muy bajas de ADN problema. Se han diseado protocolos de consenso especficos para la deteccin de un amplio espectro de Virus de papiloma humano (VPH) cutneos no genitales o asociados a epidermodisplasia verruciforme 24. Por ejemplo en tejidos incluidos en parafina, el estudio de productos de PCR anidada obtenidos con iniciadores que codifican una protena de 65 Kda comn a todas las micobacterias, se ha observado que en un 80% de las lesiones cutneas de sarcoidosis, una enfermedad granulomatosa sistmica, se ha podido identificar ADN de micobacterias. Mediante el anlisis del patrn de enzima de restriccin en estos productos de PCR (PCR/REPA) se han sub-clasificado las micobacterias detectadas en estos tejidos y han sido M. tuberculosis complex, M. aviumintracellulare y M. kansasii 25. Con la variante "anidada" de PCRelectroforesis en gel con gradiente de desnaturalizacin se detecta hasta un 90% de clonalidad en el receptor TCR-gamma en lesiones de micosis fungoides en todos los estudios 26.

A su vez, el PCR multiplex, ha sido de gran utilidad en la deteccin del gen de la distrofina en la distrofia muscular de Duchenne 27. De igual manera, empleando esta tcnica y sondas flurognicas se puede diagnosticar la enfermedad en varios tipos de muestra 28. En lo que respecta a la variante PCR In situ, esta se realiza sobre cortes de tejidos o extensiones citolgicas, y posteriormente se detectan los productos amplificados en el lugar donde se encuentra el ADN. Con esta tcnica, se ha podido detectar una nica copia del genoma del VPH en una clula determinada 6.

En otros estudios utilizando PCR se han podido determinar los genes involucrados en la atriquia universal congnita o atriquia con lesiones papulosas (una forma hereditaria de alopecia, en el que la prdida de pelo ocurre poco despus del nacimiento y aos despus se sigue una erupcin papulosa difusa). Igualmente en la porfiria cutnea tarda espordica se ha estudiado la mutacin de un gen similar a MHC clase I cuya mutacin se piensa que es la causa de la hemocromatosis. En la dermatitis atpica, el estudio mediante PCR-RFLP en sangre perifrica muestra un predominio significativo (85%) de homocigotos para alelos acetiladores lentos (N-acetiltransferasa 2, NAT2) entre los pacientes con dermatitis atpica, frente a un 54% en sujetos sanos29. Otros estudios describen una mayor frecuencia de acetiladores rpidos en pacientes con dermatitis alrgica de contacto que en controles 30 En familias japonesas se ha observado que las diferencias en la actividad transcripcional del gen de IL4 influyen en la predisposicin a dermatitis atpica, al estudiar el polimorfismo del gen IL4. En otros estudios, usando marcadores muy polimrficos, se observa vnculos entre la dermatitis atpica y marcadores del cromosoma 11q13 (como D11S903 y el gen del receptor IgE de gran afinidad (FCER 1 B Fc (epsilon) RI-b Leu 181) 31, 32 con enfermedad respiratoria y una IgE srica superior a 2000 IU/mL33. Mediante PCR con iniciadores especficos para segmentos Vgamma 1-8 y V-gamma 9 del gen del receptor de linfocitos T (TCRgamma), en combinacin con electroforesis en gel en condiciones desnaturalizantes (PCR-DGGE), se ha observado que un 66% de

micosis fungoides en estadio de placa y un 100% de micosis fungoides en estadio de tumor o de linfomas cutneos de clulas T pleomrficos presentan reordenamientos clonales del gen TCRgamma, mientras ninguno de los pseudos-linfomas cutneos de clulas T, estudiados presentaban este reordenamiento. La PCR se ha utilizado tambin para detectar mutaciones en toda la regin de codificacin del gen p53. Las mutaciones de p53, estudiadas con PCR-SSCP se encuentran con mayor frecuencia en carcinomas epidermoides infiltrantes que en el carcinoma in situ (enfermedad de Bowen) o micro-infiltrante. Tambin se asocian a linfomas cutneos primarios y a la evolucin de micosis fungoides desde el estadio de placa al estadio tumoral 34 y a la transformacin histolgica del linfoma folicular en un linfoma difuso ms agresivo 35. Tambin se utiliza en el estudio de gen supresor tumoral, cuyas mutaciones se describen en el epitelioma basocelular y parecen ser ms frecuentes en el epitelioma basocelular espordico (30%) que en el asociado a xeroderma pigmentosa (11%). Adems, se ha comprobado la coexistencia de mutaciones en p53 y en en el gen supresor tumoral en un 50% de los epiteliomas basocelulares asociados a xeroderma pigmentoso 36 . Consideraciones generales La aplicacin de las tcnicas moleculares en las enfermedades de la piel sin duda alguna, ha generado un gran conocimiento sobre los mecanismos genticos de muchas enfermedades y de muchas agentes etiolgicos, facilitando su diagnstico e incluso su tratamiento. La PCR y sus variantes, en combinacin con otras tcnicas moleculares, ofrece una plataforma ideal para el desarrollo de una gran variedad de pruebas moleculares para la identificacin y cuantificacin de los agentes infecciosos de inters clnico. Debido a sus indudables ventajas, como la facilidad de empleo, la mayor rapidez o el menor riesgo de contaminacin, aunado a la alta especificidad y sensibilidad, estn siendo aplicadas a una gran cantidad de patologas dermatolgicas.

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